一种高通量、高含量、液态的 Pathosystem线虫

Summary

在这里, 我们描述了一个协议, 它是一个适应性强, 全宿主, 高内容筛选工具, 可用于研究宿主病原体相互作用, 并用于药物发现。

Abstract

传统的、体外筛查到的新药数量已经减退, 这就减少了这种方法在寻找新武器以对抗多种耐药性方面的成功。这就得出结论, 研究人员不仅需要找到新药, 还需要开发新的方法来找到它们。其中最有希望的候选方法是全有机体,在体内的检测, 使用高通量, 表型读数和寄主, 范围从秀丽线虫到斑马斑马。这些主机有几个强大的优势, 包括显着减少假阳性命中, 因为有毒的化合物, 对主机和/或 biounavailable 通常下降在最初的屏幕上, 在昂贵的后续行动之前。

在这里, 我们展示了我们的检测如何被用来审问寄主变异的良好记录的C. 线虫-铜绿假单胞菌液体杀死 pathosystem。我们还演示了这种精心编制的技术的几个扩展。例如, 我们能够使用24或96井板格式的 rna 干扰来进行高通量的基因筛, 以查询宿主-病原体相互作用中的宿主因素。使用这项化验, 整个基因组屏幕只能在几个月内完成, 这可以大大简化确定药物目标的任务, 可能不需要费力的生化纯化方法。

我们还报告了我们的方法的变化, 取代革兰氏阳性菌肠球菌的革兰氏阴性病原菌P.与铜绿假单胞菌的情况一样, 由大肠杆菌杀死是有时间依赖性的。与以前的 C.粪肠球菌化验不同, 我们对粪肠球菌的化验不需要 preinfection, 改善其安全状况, 减少污染液体处理设备的几率。该检测具有高度健壮性, 显示95% 死亡率 96 h 后感染。

Introduction

在近一个世纪以前, 确定和发展有效的广谱抗生素导致了公共卫生的一个分水岭时刻, 人们普遍认为, 传染病将是过去的祸害。在短短的几十年里, 这种乐观情绪开始消退, 因为病原体形成的抗病机制限制了这些曾经神奇的治疗。一段时间内, 药物发现努力与病原体之间的军备竞赛似乎是平衡的。然而, 滥用抗菌药物最近终于出现了耐药菌株的肺炎克雷伯杆菌, 不动杆菌鲍曼,沙雷质, 和铜绿假单胞菌^{1, 2,3,4}。

铜绿假单胞菌是一种机会主义, 革兰阴性, 多宿主病原体, 严重威胁严重烧伤患者, 那些谁是免疫力低下, 或有囊性纤维化。它也日益被认定为严重医院感染的致病剂, 特别是由于其持续的耐药性的获得。为了应对这一威胁, 我们使用了记录良好的C.铜绿假单胞菌感染系统⁵。我们的实验室利用这个系统开发了一种基于液体的高通量高含量的筛选平台, 以确定新的化合物, 限制病原体杀死宿主⁶的能力。有趣的是, 这些化合物似乎属于至少三个一般类别, 包括抗菌素⁷和毒力抑制剂⁸。 tuberculosum 分枝杆菌、沙眼衣原体、鼠疫耶尔森菌、李斯特氏细胞增生、土拉弗 tularensis、金黄色葡萄球菌、白念珠病及粪肠球菌, 除其他^{9,10,11,12,13,14,15,16}。这些类型的化验有几个公认的优势, 如限制假阳性命中可能对宿主和病原体, 增加生物有效性的可能性相比, 化学屏幕, 并有能力识别命中超出简单地限制微生物的生长, 例如抗 virulents, 免疫刺激分子, 或其他使宿主-病原体相互作用的平衡倾斜的化合物, 有利于前者。此外, 在这些屏幕上发现的化合物通常在哺乳动物宿主中有效。

值得注意的是, 至少有另外两种化验^17,18可以在液体中的C. 线虫中进行高通量屏幕。然而, 每一个这些化验是一个修改, 允许原型肠道殖民化试验, 称为慢杀, 以液体进行, 增加的吞吐量, 并允许化合物更容易筛选。仔细的描述表明, 细菌毒力的机制是不同的, 这些化验和我们的液基筛⁷。由于两种类型的毒力都观察到哺乳动物系统, 重要的是要考虑哪些毒力决定因素是最相关的实验者的利益之前的化验选择。

在这里, 我们演示了一个优化版本的液态C 线虫-铜绿假单胞菌。我们还报告了我们的液基检测方法的适应性, 以适应革兰氏阳性菌粪肠球菌.与铜绿假单胞菌一样,粪肠球菌越来越多地被认定为严重的医院威胁, 并不断增加的武器耐药性途径¹。尽管以前的高通量筛选方法存在¹⁴, 但它需要 preinfection 病原体, 这就使程序复杂化, 增加了诸如 COPAS FlowSort 等污染设备的可能性。我们的协议消除了感染前的需要, 改善了安全配置。最后, 我们报告一种方法, 其中任一检测可以结合喂养 rna 干扰, 允许用户搜索的宿主因素, 发挥作用, 建立或抵抗, 感染。

Protocol

注意:铜绿假单胞菌和粪肠是生物安全2级病原体, 必须采取适当的安全措施预防意外感染, 并尽量减少表面污染。与病原体接触的所有介质和材料都必须消毒和/或丢弃。在《微生物和生物医学实验室》 (BMBL) 第五版中, 可提供进一步的指导方针。

1. 铜绿假单胞菌的制备与维护

1. 从冷冻的股票上的绿脓杆菌到一磅 (溶源性肉汤) 琼脂盘子。孵育16到24小时在37°c
   注: 在 BSL-2 生物安全柜内进行铜绿假单胞菌实验, 以确保不孕。使用适当的安全预防措施, 尽量减少致病感染或污染的几率。
2. 把这个盘子转移到4摄氏度。该板块可保留在摄氏4摄氏度, 并用于接种文化长达一周。一个星期后, 净化和丢弃的盘子, 并作出一个新的 LB 条纹板。
   注:铜绿假单胞杆菌毒力在长时间贮存后减少。
3. 两天前建立化验板, 接种 3-5 毫升不育 LB 汤与单一殖民地的铜绿假单胞菌从板材制成的1.1。孵育37°c 12 至16小时。
   注: 不要孵化长于16小时。在富含液体的培养基中, 铜绿假单胞菌PA14 开始溶解。
4. 用慢速杀灭培养基制备无菌10厘米板 (3 克氯化钠, 3.5 克蛋白胨, 1 毫米 CaCl₂, 1 毫米 MgSO₄, 25 毫升磷酸盐缓冲器 (每公升: 132 毫升的 K₂HPO₄ (1M) 和 868 ml 2 毫升₄ (1M)) 和18克琼脂/升)。
   注: 提前准备板材。它们可以在4摄氏度的密闭容器中储存长达3周。
5. 种子每10厘米慢杀板 (SK 板) 与 350 ul 的铜绿假单胞菌从新鲜的隔夜磅文化。使用无菌的细菌摊铺机, 在介质表面均匀传播细菌, 并允许在 BSL-2 生物安全柜中干燥。
6. 孵育板在37°c 为24小时。

2. rna 干扰细菌的制备

1. 在含有适当抗生素的 LB 琼脂上 (羧苄青霉素100µg/毫升和四环素, 在 Ahringer 和维达图书馆的15µg/毫升) 中, 将所需的含有干扰的细菌的菌株从冷冻的库存中取出或引脚转移。
   注意: 在与致病细菌合作时, 使用 BSL-2 a/B 生物安全柜或 BSL-1 层流罩, 以确保文化的不育, 并尽量减少图书馆交叉污染的几率。
2. 孵化板为24小时在37°c。
3. 将盘子存放在4摄氏度, 最多两周。
   1. 两周后, 扔掉盘子, 用刚制成的盘子代替它们。
4. 通过在一个24井深井板的单个井中单独接种单个菌落, 并将其分为4毫升的羧苄青霉素补充磅, 并在一个无菌试管中, 对多个干扰菌株进行平行测试。
   注意: 据报道, 四环素可降低 rna 干扰的效率。不要在这个媒体中使用它。
5. 将24井深井板块放入一个为多井板优化的震动孵化器中, 并在37摄氏度处孵育16小时, 而在950转时晃动。
   注意: 使用常规的振动孵化器很难在多井板上获得均匀的细菌生长。震动孵化器需要能够至少 750 rpm 的震动, 以使文化能够正常生长。在没有专门的振动筛的情况下, 可以在单个管中培养每种文化。文化可以被转移入24井板材为离心以后, 如果需要。
6. 用离心收集细菌5分钟, 在 2000 x g。
7. 醒酒上清, 用力摇动板。并用重悬在100µL 的基部 (5.85 克氯化钠, 1 克 K₂HPO₄, 6 g, 2 PO₄溶解成1升的超纯水和灭菌的高压釜) 的 rna 干扰细菌。
8. 吸管悬浮细菌进入适当数量的多井 NGM 板 (线虫生长培养基, 3 克氯化钠, 2.5 克蛋白胨, 1 毫米 CaCl₂, 1 毫米 MgSO₄, 25 毫升磷酸盐缓冲 (每公升的数量: 132 毫升 K₂HPO₄ (1M)并且868毫升₂PO₄ (1M)) 和 18 g 琼脂每公升水) 补充与 IPTG (1 毫米最后的集中) 和羧苄青霉素 (100 微克或 mL 最后集中)。
   1. 使用3.5 毫升的 NGM 介质, 每井6井板, 1 毫升每井24井板, 或150µL 每井96井板。
   2. 使用 100 ul/良好的细菌为6井板;50 ul/井为 24-好;或 20 ul/井为96井板。允许干燥。
      注: 干燥通常在无菌流动罩中进行, 以促进快速, 均匀干燥。均匀干燥是非常重要的。避免过度干燥, 因为琼脂中的裂缝促进了蠕虫的挖洞。这导致了蠕虫的损失和液体处理系统的潜在堵塞。
9. 立即使用准备好的盘子, 或者将它们储存在4摄氏度, 供以后使用。
   注: 为防止板材干燥, 可以用塑料石蜡膜密封, 或置于密封的容器中, 用湿纸巾。

3.线虫的维护和制备

注: 在开始实验前, 生成妊娠、成年雌雄同体蠕虫的同步种群, 如下所示。

1. 从 4-6 10 厘米 NGM 板到15毫升圆锥管中, 将妊娠成人 (即,有多个胚胎可见), 通过加入4毫升的 S 基板, 轻轻旋转, 然后倒入15毫升圆锥管。
2. 颗粒蠕虫通过离心在 1000 x g 30 秒。
3. 吸入上清液, 注意不要扰乱蠕虫颗粒。
4. 添加3.5 毫升的蠕虫漂白溶液 (最终浓度0.5M 氢氧化钠, 1% 次氯酸钠, 在无菌水中) 到蠕虫颗粒, 并混合通过反转1分钟。
5. 简要地漩涡和离心机在 1000 x g 30 秒。
6. 吸入或醒酒上清, 注意不要扰乱蠕虫颗粒。
7. 加入3.5 毫升新鲜的蠕虫漂白溶液的蠕虫颗粒。
8. 在漂白剂溶液中大力混合蠕虫。定期 (大约每十秒) 目视检查蠕虫在解剖显微镜下。观察蠕虫角质层打破, 释放鸡蛋。一旦大多数成年蠕虫被溶解 (~ 95%), 稀释漂白剂到15毫升以 S 基部停止消化。
   注: 蛋壳比成人组织更耐漂白, 但在长时间暴露时可以溶解。为了避免卵子溶解, 不要将鸡蛋暴露在蠕虫漂白溶液中超过7分钟。如果蛋壳被过度破坏, 胚胎就会死亡。
9. 颗粒胚在 1000 x g 30 秒, 吸或醒酒上清, 而不去除胚胎颗粒。
10. 并用重悬蠕虫在 S 基部到最后容量15毫升稀释剩余的漂白剂解答。
11. 重复洗涤步骤 (3.9-3.10) 三多次, 总共4连续洗涤。
12. 第四洗涤后, 吸入上清, 并增加5或6毫升不育的基部到15毫升圆锥管。目标是并用重悬胚胎的浓度为每µL 50 蠕虫。
    注: S 基的数量取决于蛋粒的大小;球团越大, 基部就越有必要。
13. 在室温下或48小时在15摄氏度上, 在工作台顶部的转子上过夜。幼虫将孵化, 但幼虫发育将在 L1 阶段 (L1 滞育) 中停止, 由于养分匮乏。
14. 检查解剖显微镜下的胚胎, 以验证它们中的大多数在发育的 L1 阶段已经孵化和被逮捕。
15. 用20µL 的蠕虫作准备, 用80µL 的 S 基来稀释它, 以确定蠕虫的计数。吸管10µL 稀释的蠕虫溶液直接到一个空白的 NGM 板。重复2次。
    1. 计算每个点的幼虫数并确定平均值。将这个平均值除以 2, 以获得蠕虫准备中每µL 的蠕虫的近似计数。蠕虫眼影可以用于传播板或实验。
       注: 4-5 天后, 饥饿幼虫将开始死亡;在这一点上放弃准备。
16. 为传播菌株, 吸管适当数量的 L1 蠕虫 (5000-6000) 到 3-4 10 厘米 NGM 板上发现与集中 OP50大肠杆菌- "超级食品" (大肠杆菌OP50 发现25X 浓度 (即, 1 升的隔夜 OP50在 LB 中生长的培养40毫升的 25X OP50 超级食品);2毫升的这种浓缩细菌悬浮被发现到每10厘米 NGM 板)。
17. 要准备用于实验的板材, 请执行下列操作之一 (对于 "基本协议" 使用3.17.1 设置, 对于 "rna 筛选设置" 使用步骤 3.17.2 3.17.4):
    1. 吸管 ~ 5000 worms/10 厘米板种子有 rna 干扰或 OP50 超级食品。
    2. 吸管 ~ 500 蠕虫/井在6井板种子与 rna 干扰。
    3. 吸管 ~ 300 蠕虫/井在24井板种子与 rna 干扰。
    4. 吸管 ~ 100 蠕虫/井在96井板种子与 rna 干扰。
       注: 有关如何进行 rna 干扰的说明, 请参阅步骤 2.7-2.9 在制备 rna 干扰细菌。
18. 如果使用了一种肥沃的蠕虫菌株, 在25摄氏度处孵化出 44-48 小时的蠕虫, 在人口达到适当的年龄后尽快使用这些蠕虫。这就最大限度地减少了卵孵化在蠕虫的影响, 在试验期间。
19. 如果使用的应变是无温度的 (例如, 15 (b26);有限元-1 (hc17)或glp-4 (bn2)), 孵化蠕虫在15°c 为 ~ 16 小时, 然后转移到25摄氏度为 44 h 完成开发和防止胚胎发生。

4. 液体杀灭试验装置 (基本协议)

注意: 这是一个细菌菌株和一个蠕虫来源的协议。

1. 使用细胞刮板, 从 SK 板中取出并用重悬, 并在 S 基部的5毫升内去除. 如果需要, 请放大。用分光光度计测量细菌悬浮液的光学密度 (OD₆₀₀)
2. 在₆₀₀ ≈ 0.09 (3X 最后浓度) 下, 在 S 基部制备24毫升的铜绿假单胞菌稀释库存。查看4.6.2 的最终内容, 并相应地缩放细菌稀释量。
3. 添加21毫升的液体慢杀培养基 (3 克氯化钠, 3.5 克的蛋白胨/L 补充与 CaCl₂和 MgSO₄到最后浓度1毫米)。使用多通道吸管, 将45µL 的细菌和介质转移到384井板的每一个井中。
4. 将蠕虫从源头 (即步 3.17.1) 中洗涤成50毫升锥形管, 并允许蠕虫在引力作用下安定下来。将上清液吸入5毫升。并用重悬共50毫升的基部。
5. 重复步骤4.4 两次。
6. 使用蠕虫分类器, 将大约22条蠕虫放入384井板的每个井中。
   注: 安装程序会将每条蠕虫滴在1.1 µL 的液体中。22蠕虫将共计25µL, 使总化验量达到70µL/井。
   1. 每个井的最后组成包括70µL. 45 µL 的这个体积添加为细菌培养基 (0.03 OD₆₀₀细菌在24µL 的基础, 和21µL SK 补充 CaCl₂和 MgSO₄)。另外25µL 添加了22蠕虫。
   2. 如果这里使用的分拣机 (见材料表) 是不可用的, 蠕虫可以稀释到最终浓度的1蠕虫/µL 在 S 基部和 pipetted 25 µL/井使用多通道吸管。然而, 结果可能表现出增加的变异性。另外, 如梁和同事¹⁹所述, 可以使用蠕动液体分配器。
7. 在蠕虫被分类到384井板之后, 用透气膜封住盘子, 在25摄氏度处孵化出 24-48 小时的板材。
8. 在所需时间, 使用微板块垫圈清洗384井板与 S 基础共5次。
   1. 第二次冲洗后, 吸入大部分介质, 留下20µL. 用微板块 vortexer 用力摇动板材, 至少30秒钟, 以松开井底的任何碎片)。
9. 最后洗完后, 将上清液吸入20µL. 添加50µL 0.98 µM 核酸染色 (见材料表)/井的384井板, 为最终浓度0.7 µM。
10. 室温孵育 12-16 小时。这种染料只会染死蠕虫。在理想的潜伏期后, 用微板块垫圈清洗盘子, 去除多余的污渍 (至少3洗涤)。
11. 对于数据采集, 使用分光光度计或自动显微镜来图像透射光和荧光 (531 nm 激发和593发射)。
    1. 使用低放大倍数目标, 以使整个井的图像被捕获。
    2. 或者, 使用流 vermimetry。该技术使用大型对象流式细胞仪作为蠕虫 fluorimeter, 测量整个生物体 (即线虫) 的大小和荧光, 这一方法与流动的超流化术有着强烈的相似性。
12. 使用自动图像分析软件 (如 CellProfiler, 一个基于 MatLab http://cellprofiler.org/的自由图像分析工作室), 以无偏见的方式计算每一个良好的荧光和总蠕虫面积。
    注: 这些数字的商数代表每个井的分数死亡。如果一个井有7只被染色的蠕虫20总, 则分数死亡包括0.35 或35%。
    1. 在第一次使用之前, 自动图像处理管线必须通过手动评分来验证。这是通过比较自动管道的结果和通过目视检查图像获得的分数, 并记录死蠕虫的分数。验证过程确保自动成像处理的参数准确, 并正确地表示数据。

5. 适应筛查多种C 线虫菌株或 Knockdowns (rna 屏蔽设置)

注意: 这是一个为24井板安装而描述的 rna 干扰屏幕。

1. 添加1毫升的 S 基部的每井24井板 (见步骤 3.17.3)。通过摇动盘子轻轻地搅动蠕虫, 然后将蠕虫转移到一个空的、无菌的24深井板上。允许蠕虫解决引力 (5 分钟)。
2. 吸入上清, 留下大约1毫升。添加7毫升的 S 基向每个井。
3. 重复步骤 5.1-5.2 至少2次。最后洗净后, 吸入上清, 留下大约400µL。
4. 利用蠕虫分拣机的 Resampler 功能, 将24井板蜗杆悬浮液中的22种蠕虫从384井板中的每一个井中分类 (24 井板的每一个井产量 8-12 井板)。
   1. 为了避免饥饿, 将细菌注入 384-井板 (在排序前, 可以只作为食物的一种菌株, 如 OP50 或致病性菌株)。
      注: 病原体可通过以下步骤 2.3-2.5 或 6.4-6.5 添加, 而食物源细菌可以稀释, 并按照与铜绿假单胞菌相同的方案添加。
5. 在蠕虫被分类入384井板之后, 加入小分子或其他实验特定材料。

6. 对粪肠的适应

注: 仅描述与铜绿假单胞菌的差异。

1. 在37摄氏度的 BHI (脑心输液) 琼脂板和孵化16至24小时后, 通过将冰冻的储存细菌从冷冻的库存中裸奔, 制备出一种新的粪肠源.
   注: 在 BSL-2 生物安全柜内进行粪肠试验, 以确保不孕。使用适当的安全预防措施, 尽量减少致病感染或污染的几率。
2. 盘子可以储存在4摄氏度, 长达一周。这段时间后, 更换一个新鲜的盘子。
3. 在分类蠕虫之前的晚上, 接种 3-5 毫升无菌 BHI 与一个单一的大肠杆菌群.孵育 12-16 小时在37°c 与鼓动。
4. 将细菌添加到水井中作为铜绿假单胞菌 (3x 细菌在 S 基部, OD₆₀₀≈0.09)。
   注: 对于粪肠, 最终的井组成是:大肠杆菌(OD₆₀₀≈0.03), BHI = 10% 伏/五, 其余的体积由 S 基部组成。请记住, 25 µL 的基础将被交付与蠕虫。
   注:粪肠产生厚的生物膜, 吸收荧光染色, 造成模糊图像。广泛的洗涤可能不足以去除这种生物膜。在这种情况下, 蠕虫可以被转移到一个空的盘子使用多通道吸管。为便于转移, 补间20可以添加到 s 基部到最终浓度为 0.1% (v/v) 补间20在 S 基部。这有助于清除生物膜中的蠕虫。

Results

测定性能的重要参数

正确理解这项化验的生物学基础是解决问题和优化化验的必要。为此, 我们首先提到几项关键文件, 阐明了在液体^7,20中, 铜绿假单胞杆菌介导的杀死的发病机制。前提是遵循上述步骤 (见图1所示的检测协议示意图) 只有在病原体存在的情况下, 才会观察到与时间相关的C. 线虫的杀戮 (图 2A)。相比之下, 在缺乏关键的营养补充剂 (例如,如果蛋白胨是留出的媒体, 只有 S 基础上添加), 很少对没有杀害将被观察 (图 2B)。有趣的是, 两步孵化的铜绿假单胞菌...

Discussion

这种化验 (或类似的化验, 其他病原体被替代的铜绿假单胞菌或大肠杆菌) 是有用的各种目的, 包括药物发现。它还有助于解决基本的生物学问题, 如确定毒力因素, 阐明宿主防御通路, 并确定参与宿主-病原体相互作用的调控机制。

虽然铜绿假单胞菌液体杀灭试验具有较强的鲁棒性, 但有几点需要认真注意, 以尽量减少失败的几率。首先, 如前所述, 对铜绿假单胞杆菌的细菌源板必须保持新鲜, 以免细菌丧失毒性, 尽管隔夜生长在磅。第二, 确保钙和镁加入到铜绿假单胞杆菌的实验中是关键。没有它, 毒力将会受到严重损害。最后, 值得注意的是, 在 HT115 上饲养的蠕虫 (用于基于 rna 检测的化验) 会比 OP50 上饲养的蠕虫 (n Kirienko, 个人通讯) 的死亡显著晚。由于这个原因, 如果切换到基于 rna 干扰的研究, 这是很重要的经验, 以确定最佳的时间点的化验。

对于用铜绿假单胞菌或粪肠杀灭化验, 关键...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		大型物体流式细胞仪/蠕虫分选仪
Cytation 5	BioTek
EL406 洗板分液器	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 深孔 RB 模块	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384 孔板	GreinerBio-One	MPG-781091
线虫生长培养基 （NGM）			每升含量：18 克琼脂、3 克 NaCl、2.5 克蛋白胨、1 mL CaCl2 （1 M）、1 mL MgSO4 （1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液和 973 mL milli-Q 水
慢杀灭 （SK） 板			每升含量：18 克琼脂、3 克 NaCl、3.5 克蛋白胨、1 mL CaCl2 （1 M）、1 mL MgSO4 （1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液和 973 mL milli-Q 水
慢杀伤 （SK） 培养基			每升含量：  3 克 NaCl， 3.5 克蛋白胨、1 mL CaCl2 （1 M）、1 mL MgSO4 （1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液和 973 mL milli-Q 水
溶原性肉汤 （LB）	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion 肉汤 （BHI）	Research Products International Corp	50-488-526
蠕虫漂白剂溶液			每 100 mL 含量：10 mL 5 M NaOH 溶液、20 mL 5% 次氯酸钠溶液和 70 mL 无菌水
S 基础			每升含量：5.85 克氯化钠、6 克 KH2PO< >4、1 克 K2HPO4， 和 1 升 milli-Q 水
脂	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
蛋白胨	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
磷酸盐缓冲液			量：132 mL K2HPO4 （1M） 和 868 mL KH 2 PO4 （1M）
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5% 次氯酸钠溶液	BICCA	7495.5-32
NaOH 溶液	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Orange 核酸染色剂	Fisher Scientific	S11368
细菌菌株
铜绿假单胞菌 （PA14）
粪肠球菌（OG1RF）
大肠杆菌超级食物（OP50）
表达大肠杆菌RNAi的细菌（HT115）
蠕虫菌株<
em>glp-4（bn2）（Beanan 和 Strome，1992 年， PMID：1289064）
PINK-1：：GFP 报告基因（Kang等人，2018 年，PMID：29532717）