一种高通量、高含量、液态的 Pathosystem线虫

Summary

在这里, 我们描述了一个协议, 它是一个适应性强, 全宿主, 高内容筛选工具, 可用于研究宿主病原体相互作用, 并用于药物发现。

Abstract

传统的、体外筛查到的新药数量已经减退, 这就减少了这种方法在寻找新武器以对抗多种耐药性方面的成功。这就得出结论, 研究人员不仅需要找到新药, 还需要开发新的方法来找到它们。其中最有希望的候选方法是全有机体,在体内的检测, 使用高通量, 表型读数和寄主, 范围从秀丽线虫到斑马斑马。这些主机有几个强大的优势, 包括显着减少假阳性命中, 因为有毒的化合物, 对主机和/或 biounavailable 通常下降在最初的屏幕上, 在昂贵的后续行动之前。

在这里, 我们展示了我们的检测如何被用来审问寄主变异的良好记录的C. 线虫-铜绿假单胞菌液体杀死 pathosystem。我们还演示了这种精心编制的技术的几个扩展。例如, 我们能够使用24或96井板格式的 rna 干扰来进行高通量的基因筛, 以查询宿主-病原体相互作用中的宿主因素。使用这项化验, 整个基因组屏幕只能在几个月内完成, 这可以大大简化确定药物目标的任务, 可能不需要费力的生化纯化方法。

我们还报告了我们的方法的变化, 取代革兰氏阳性菌肠球菌的革兰氏阴性病原菌P.与铜绿假单胞菌的情况一样, 由大肠杆菌杀死是有时间依赖性的。与以前的 C.粪肠球菌化验不同, 我们对粪肠球菌的化验不需要 preinfection, 改善其安全状况, 减少污染液体处理设备的几率。该检测具有高度健壮性, 显示95% 死亡率 96 h 后感染。

Introduction

在近一个世纪以前, 确定和发展有效的广谱抗生素导致了公共卫生的一个分水岭时刻, 人们普遍认为, 传染病将是过去的祸害。在短短的几十年里, 这种乐观情绪开始消退, 因为病原体形成的抗病机制限制了这些曾经神奇的治疗。一段时间内, 药物发现努力与病原体之间的军备竞赛似乎是平衡的。然而, 滥用抗菌药物最近终于出现了耐药菌株的肺炎克雷伯杆菌, 不动杆菌鲍曼,沙雷质, 和铜绿假单胞菌^{1, 2,3,4}。

铜绿假单胞菌是一种机会主义, 革兰阴性, 多宿主病原体, 严重威胁严重烧伤患者, 那些谁是免疫力低下, 或有囊性纤维化。它也日益被认定为严重医院感染的致病剂, 特别是由于其持续的耐药性的获得。为了应对这一威胁, 我们使用了记录良好的C.铜绿假单胞菌感染系统⁵。我们的实验室利用这个系统开发了一种基于液体的高通量高含量的筛选平台, 以确定新的化合物, 限制病原体杀死宿主⁶的能力。有趣的是, 这些化合物似乎属于至少三个一般类....

Protocol

注意:铜绿假单胞菌和粪肠是生物安全2级病原体, 必须采取适当的安全措施预防意外感染, 并尽量减少表面污染。与病原体接触的所有介质和材料都必须消毒和/或丢弃。在《微生物和生物医学实验室》 (BMBL) 第五版中, 可提供进一步的指导方针。

1. 铜绿假单胞菌的制备与维护

1. 从冷冻的股票上的绿脓杆菌到一磅 (溶源性肉汤) 琼脂盘子。孵育16到24小时在37°c
   注: 在 BSL-2 生物安全柜内进行铜绿假单胞菌实验, 以确保不孕。使用适当的安全预防措施, 尽量减少致病感染或污染的几率。
2. 把这个盘子转移到4摄氏度。该板块可保留在摄氏4摄氏度, 并用于接种文化长达一周。一个星期后, 净化和丢弃的盘子, 并作出一个新的 LB 条纹板。
   注:铜绿假单胞杆菌毒力在长时间贮存后减少。
3. 两天前建立化验板, 接种 3-5 毫升不育 LB 汤与单一殖民地的铜绿假单胞菌从板材制成的1.1。孵育37°c 12 至16小时。
   注: 不要孵化长于16小时。在富含液体的培养基中, 铜绿假单胞菌PA14 开始溶解。
4. 用慢速杀灭培养基制备无菌10厘米板 (3 克氯化钠, 3.5 克蛋白胨, 1 毫米 CaCl₂, 1 毫米 MgSO₄

Results

测定性能的重要参数

正确理解这项化验的生物学基础是解决问题和优化化验的必要。为此, 我们首先提到几项关键文件, 阐明了在液体^7,20中, 铜绿假单胞杆菌介导的杀死的发病机制。前提是遵循上述步骤 (见图1所示的检测协议示意图) 只有在病原体存在的情况下, 才会观察到与时间相关的C. 线虫的杀戮 (图 2A)。相比之下, 在缺乏关键的营养补充剂 (例如,如果蛋白胨是留出的媒体, 只有 S 基础上添加), 很少对没有杀害将被观察 (图 2B)。有趣的是, 两步孵化的铜绿假单胞菌.......

Discussion

这种化验 (或类似的化验, 其他病原体被替代的铜绿假单胞菌或大肠杆菌) 是有用的各种目的, 包括药物发现。它还有助于解决基本的生物学问题, 如确定毒力因素, 阐明宿主防御通路, 并确定参与宿主-病原体相互作用的调控机制。

虽然铜绿假单胞菌液体杀灭试验具有较强的鲁棒性, 但有几点需要认真注意, 以尽量减少失败的几率。首先, 如前所述, 对铜绿假单胞杆菌的细菌源板必须保持新鲜, 以免细菌丧失毒性, 尽管隔夜生长在磅。第二, 确保钙和镁加入到铜绿假单胞杆菌的实验中是关键。没有它, 毒力将会受到严重损害。最后, 值得注意的是, 在 HT115 上饲养的蠕虫 (用于基于 rna 检测的化验) 会比 OP50 上饲养的蠕虫 (n Kirienko, 个人通讯) 的死亡显著晚。由于这个原因, 如果切换到基于 rna 干扰的研究, 这是很重要的经验, 以确定最佳的时间点的化验。

对于用铜绿假单胞菌或粪肠杀灭化验, 关键.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		大型物体流式细胞仪/蠕虫分选仪
Cytation 5	BioTek
EL406 洗板分液器	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 深孔 RB 模块	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384 孔板	GreinerBio-One	MPG-781091
线虫生长培养基 （NGM）			每升含量：18 克琼脂、3 克 NaCl、2.5 克蛋白胨、1 mL CaCl2 （1 M）、1 mL MgSO4 （1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液和 973 mL milli-Q 水
慢杀灭 （SK） 板			每升含量：18 克琼脂、3 克 NaCl、3.5 克蛋白胨、1 mL CaCl2 （1 M）、1 mL MgSO4 （1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液和 973 mL milli-Q 水
慢杀伤 （SK） 培养基			每升含量：  3 克 NaCl， 3.5 克蛋白胨、1 mL CaCl2 （1 M）、1 mL MgSO4 （1 M）、25 mL 磷酸盐缓冲液和 973 mL milli-Q 水
溶原性肉汤 （LB）	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Infusion 肉汤 （BHI）	Research Products International Corp	50-488-526
蠕虫漂白剂溶液			每 100 mL 含量：10 mL 5 M NaOH 溶液、20 mL 5% 次氯酸钠溶液和 70 mL 无菌水
S 基础			每升含量：5.85 克氯化钠、6 克 KH2PO< >4、1 克 K2HPO4， 和 1 升 milli-Q 水
脂	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
蛋白胨	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
磷酸盐缓冲液			量：132 mL K2HPO4 （1M） 和 868 mL KH 2 PO4 （1M）
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5% 次氯酸钠溶液	BICCA	7495.5-32
NaOH 溶液	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Orange 核酸染色剂	Fisher Scientific	S11368
细菌菌株
铜绿假单胞菌 （PA14）
粪肠球菌（OG1RF）
大肠杆菌超级食物（OP50）
表达大肠杆菌RNAi的细菌（HT115）
蠕虫菌株<
em>glp-4（bn2）（Beanan 和 Strome，1992 年， PMID：1289064）
PINK-1：：GFP 报告基因（Kang等人，2018 年，PMID：29532717）