一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

摘要

本文介绍一种可灵活应用的全生物体高内涵筛选工具，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用，并适用于药物发现。

摘要

通过传统的体外（in vitro）筛选方法发现的新药数量已逐渐减少，导致该方法在寻找应对多重耐药性的新武器方面成效降低。这促使研究者得出结论：不仅需要发现新的药物，更需要开发新的发现药物的方法。其中最具前景的候选方法之一是采用高通量、表型读数的全生物体体内（in vivo）检测，所用宿主范围从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）到斑马鱼（Danio rerio）。这些宿主具有多种显著优势，包括可大幅减少假阳性结果；因为在初始筛选阶段，对宿主具有毒性或生物利用度差的化合物通常即被淘汰，从而避免后续昂贵的验证工作。

本文展示了我们的检测方法如何被用于研究已有充分记录的秀丽隐杆线虫（C. elegans）—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）液体致死病理系统中宿主的变异。我们还演示了该成熟技术的若干拓展应用。例如，我们能够在24孔或96孔板体系中利用RNA干扰（RNAi）进行高通量遗传筛选，以探究该宿主-病原体相互作用中的宿主因子。通过该检测方法，全基因组范围的筛选仅需数月即可完成，这可显著简化药物靶点的鉴定工作，甚至无需繁琐的生化纯化手段。

我们还在此报告了本方法的一种改进版本，该版本使用革兰氏阳性菌Enterococcus faecalis替代革兰氏阴性病原菌P. aeruginosa。与P. aeruginosa类似，E. faecalis引起的杀伤作用也具有时间依赖性。与以往的C. elegans—E. faecalis检测方法不同，本方法检测E. faecalis时无需预先感染步骤，从而提高了安全性，并降低了液体处理设备被污染的风险。该检测方法具有高度稳健性，在感染后96小时可观察到约95%的死亡率。

引言

近一个世纪前，有效且广谱抗生素的发现与开发成为公共卫生领域的一个转折点，当时人们普遍认为传染病将成为历史的灾难。然而在短短几十年内，这种乐观情绪开始减弱，因为一种又一种病原体逐渐演化出耐药机制，使这些曾被视为奇迹的治疗方法效果受限。在一段时间内，药物研发与病原体之间的对抗似乎处于平衡状态。然而，由于抗菌药物的滥用，近年来已导致多种泛耐药菌株的出现，包括Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Serratia marcescens和P. aeruginosa^1,2,3,4。

P. aeruginosa 是一种机会性、革兰氏阴性、可感染多种宿主的病原体，对严重烧伤患者、免疫功能低下者以及囊性纤维化患者构成严重威胁。该病原体还 increasingly 被确认为重症医院内感染的致病因子，尤其是由于其持续获得抗菌药物耐药性所致。为初步应对这一威胁，我们采用了已有充分文献记录的 秀丽隐杆线虫-P. aeruginosa 感染系统

方案

注意：P. aeruginosa 和 E. faecalis 属于生物安全二级病原体，必须采取适当的安全防护措施，以防止意外感染并尽量减少对实验台面的污染。所有与病原体接触过的培养基和材料均须进行灭菌和/或妥善丢弃。更多指导方针可参见美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的《微生物学和生物医学实验室生物安全》（BMBL）第五版。

1. 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的制备与培养

1. 从冻存菌种中挑取P. aeruginosa在LB（Lysogeny Broth）琼脂平板上划线。37 °C培养16至24小时。
   注意：为确保无菌操作，P. aeruginosa实验应在BSL-2生物安全柜内进行。采取适当的安全防护措施，以最大限度降低病原体感染或污染的风险。
2. 将该平板转移至4 °C保存。此平板可在4 °C下保存，并用于接种培养物，最长可使用一周。一周后，需对平板进行去污染处理并丢弃，重新制备新的LB划线平板。
   注意：P. aeruginosa的毒力在长期储存后会下降。
3. 在设置检测平板前两天，从步骤1.1制备的平板上挑取单个P. aeruginosa菌落，接种于3–5 mL无菌LB液体培养基中。在37 °C下培养12至16小时。
   注意：培养时间不得超....

结果

影响检测性能的重要参数

正确理解该检测方法背后的生物学原理对于排除故障和优化实验至关重要。为此，我们首先参考了几篇阐明发病机制的关键论文 P. aeruginosa介导的液体中杀伤作用^7,20. 只要遵循上述步骤（参见 图1 有关检测方案示意图，请参见）时间依赖性的杀伤作用 秀丽隐杆线虫 仅在病原体存在时才会被观察到（图2A）。相比之下，在缺乏关键营养补充剂的情况下（例如， 如果培养基中不添加蛋白胨，仅加入S基础盐溶液，则几乎观察不到杀灭作用（图2B）。有趣的是，两步孵育法 P. .......

讨论

该检测方法（或类似的检测方法，其中用其他病原体替代铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）或粪肠球菌（E. faecalis））具有多种用途，包括用于药物发现。此外，该方法还适用于回答基本的生物学问题，例如鉴定毒力因子、阐明宿主防御通路，以及确定宿主-病原体相互作用中涉及的调控机制。

尽管 P. aeruginosa 液体杀伤实验具有较高的稳健性，但在操作过程中仍有若干关键环节需格外注意，以最大限度降低实验失败的风险。首先，如前所述，用于实验的细菌来源平板 P. aeruginosa 接种物必须保持新鲜，否则细菌可能会丧失毒力，即使其在LB培养基中过夜生长。其次，关键是要确保向其中添加钙和镁 P. aeruginosa 杀伤实验。缺乏该条件将显著削弱毒力。最后值得注意的是，在HT115（用于RNAi实验）上培养的线虫比在OP50上培养的线虫死亡时间显著延迟（N. Kirienko，个人通讯）。因此，若转向基于RNAi的研究，必须通过实验确定该实验的最佳时间点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		大型物体流式细胞仪/线虫分选仪
Cytation 5	BioTek
EL406 Washer Dispenser	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24孔深孔板	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384孔板	Greiner Bio-One	MPG-781091
线虫生长培养基（NGM）			每升用量：18克琼脂，3克NaCl，2.5克蛋白胨，1 mL CaCl2（1 M），1 mL MgSO4（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，以及973 mL milli-Q水
慢杀（SK）平板			每升用量：18克琼脂，3克NaCl，3.5克蛋白胨，1 mL CaCl2（1 M），1 mL MgSO4（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，以及973 mL milli-Q水
慢杀（SK）培养基			每升用量： 3克NaCl，3.5克蛋白胨，1 mL CaCl2 （1 M），1 mL MgSO4（1 M），25 mL磷酸盐缓冲液，以及973 mL milli-Q水
LB培养基（Lysogeny Broth）	USBiological Life Sciences	L1520
脑心浸液肉汤（BHI）	Research Products International Corp	50-488-526
线虫漂白液			每100 mL用量：10 mL 5 M NaOH溶液，20 mL 5%次氯酸钠溶液，以及70 mL无菌水
S基础培养基（S Basal）			每升用量：5.85克NaCl，6克KH2PO4，1克K2HPO4，以及1升milli-Q水
琼脂	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
蛋白胨	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
磷酸盐缓冲液			每升用量：132 mL K2HPO4（1 M）和868 mL KH2PO4（1 M）
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
5%次氯酸钠溶液	BICCA	7495.5-32
NaOH溶液	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Orange核酸染料	Fisher Scientific	S11368
细菌菌株
P. aeruginosa （PA14）
E. faecalis（OG1RF）
E. coli superfood（OP50）
E. coli 表达RNAi的细菌（HT115）
线虫菌株
glp-4（bn2）（Beanan和Strome，1992，PMID: 1289064）
PINK-1::GFP报告基因（Kang等，2018，PMID: 29532717）