小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

摘要

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

摘要

树突状细胞和巨噬细胞是抵御病原体的第一道防线中的关键细胞，同时在启动适应性免疫应答中也发挥着重要作用。对这些细胞进行实验操作具有较大挑战性。它们在器官和组织中的数量相对较少，因此难以大量分离获得。此外，这些细胞也难以通过cDNA质粒进行转染。在小鼠模型中，这些问题可通过以下方法部分克服： 体外 在存在M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的条件下诱导骨髓前体细胞分化为巨噬细胞，或在存在GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的条件下诱导其分化为树突状细胞。通过该方法，可利用极少量动物获得大量上述细胞。此外，在骨髓前体细胞分化为骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞之前的培养早期阶段，可使用携带cDNA构建体的逆转录病毒载体对其进行转导。因此，可在逆转录病毒转导后进行细胞分化 体外 可用于在这些细胞中表达各种cDNA构建体。异源蛋白的表达能力极大地拓展了可在这些细胞上开展的实验范围，包括荧光蛋白的活细胞成像、用于相互作用组分析的串联纯化、结构-功能分析、利用生物传感器监测细胞功能等。本文中，我们描述了一种详细的逆转录病毒转导方案，用于将编码荧光标记蛋白的载体导入小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞。以两种接头蛋白OPAL1和PSTPIP2为例，我们展示了该方法在流式细胞术和显微镜分析中的实际应用。同时，我们也讨论了该方法的优势与局限性。

引言

髓系细胞是我们抵御病原体防御机制中不可或缺的一部分。它们能够快速清除微生物以及凋亡细胞。此外，它们还参与调控组织发育与修复，并维持机体稳态^1,2,3。所有髓系细胞均来源于骨髓中的共同髓系前体细胞。这些细胞分化为多种功能和形态各异的亚群，这一过程在很大程度上受细胞因子及其不同组合的调控⁴。目前研究最为深入的髓系细胞亚群包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。这些细胞群体中任何一类的缺陷均可导致潜在的生命威胁性后果，并在人类和小鼠中引发严重的免疫系统功能障碍^1,2,3,5,6。

与中性粒细胞不同，树突状细胞和巨噬细胞是组织驻留细胞，其在免疫器官中的数量相对较少。因此，为需要大量这些细胞的实验而分离和纯化原代树突状细胞和巨噬细胞往往成本高昂且常常难以实现。为解决这一问题，已开发出多种实验方案，用于获得大量均一的巨噬细胞或树突状细胞....

方案

本文所述所有方法均已获得捷克共和国分子遗传学研究所实验动物福利专家委员会和捷克共和国科学院的批准。

1. 试剂准备

1. 配制氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液。将 4.145 g NH₄Cl 和 0.5 g KHCO₃ 加入 500 mL ddH₂O 中，然后加入 100 µL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA），过滤除菌。
2. 配制聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将 0.1 g PEI 加入 90 mL ddH₂O 中。边搅拌边逐滴加入 1 M HCl，直至 pH 低于 2.0。继续搅拌最多 3 小时，直至 PEI 完全溶解，然后用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.2。用 ddH₂O 定容至 100 mL，并过滤除菌。分装成 1–2 mL 等份，于 -20 °C 保存。
   注意：PEI 融化后可在 4 °C 保存最多 2 周，但不应再次冷冻。
3. 制备含 M-CSF 或 GM-CSF 的细胞培养上清液。这些上清液可预先制备并储存于 -80 °C。制备方法如下：将细胞因子产生细胞（GM-CSF 使用 J558 细胞¹⁸，M-CSF 使用 CMG 14-12 细胞¹⁹）在含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格....

结果

信号接头蛋白通常是不具有任何酶活性的小分子蛋白。它们含有多种相互作用结构域或基序，可介导与其他参与信号转导的蛋白质（包括酪氨酸激酶、磷酸酶、泛素连接酶等）的结合²¹。为了展示本实验方案的功能性，选择了髓系细胞接头蛋白PSTPIP2和OPAL1。PSTPIP2是一种已被充分表征的蛋白，参与炎症反应的调控²²。它是一种细胞质蛋白，也可通过其F-bar结构域被招募至细胞膜。第二种蛋白是跨膜接头蛋白OPAL1，预期定位于细胞膜。其生理功能目前尚不清楚。然而，在急性淋巴细胞白血病中，OPAL1的表达与较好的预后相关²³。

编码C末端通过短连接子（分别为GSGGGS或Myc标签）与EGFP融合的PSTPIP2或OPAL1的cDNA构建体，采用标准cDNA克隆方法插入pMSCV逆转录病毒载体中。随后将该构建体与包装载体pCL.......

讨论

在多种生物学研究中，目标细胞中目的蛋白的表达是一个关键步骤。分化的巨噬细胞和树突状细胞难以通过标准转染和逆转录病毒转导技术进行基因导入。通过逆转录病毒感染骨髓前体细胞，使其携带所需的表达构建体，再诱导其分化为成熟细胞，从而绕过直接转染分化细胞的难题，是实现在这些细胞类型中异位表达cDNA的关键策略。我们近期发表的研究²⁵中已成功应用了该方法。本文提供了一种经济高效的实验方案，利用该策略在骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中实现目标构建体的稳定表达。本方案成本较低且操作简便，同时可获得非常理想的结果。所用试剂价格合理，即使在经费较为有限的情况下也可常规使用。本方案中Plat-E细胞的转染采用聚乙烯亚胺（PEI）作为转染试剂。与其他化学转染试剂相比，PEI成本极低，而其转染效率与大多数广泛使用的商业化试剂相当。然而，在此步骤中也可使用多种市售的其他转染试剂替代PEI，且不会降低转染效率。一般而言，适用于常用HEK293细胞的转染方案通常也适用于Plat-E细胞。另一项节约成本的措施是使用含细胞因子的上清液替代纯化的重组细胞因子。使用上清液需要一定的优化过程，但一旦建立了标准制备流程并严格执行，不同.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	用于培养基补充
KHCO3	Lachema, Brno, 捷克共和国	N/A
NH4Cl	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	A9434
青霉素	BB Pharma AS, Prague, 捷克共和国	N/A	PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
链霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	硫酸链霉素粉末
庆大霉素	Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, 捷克共和国	N/A
聚乙烯亚胺，线性，分子量 25,000	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966
聚凝胺	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	H9268
EDTA	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	E5134
PBS	由捷克共和国布拉格IMG ASCR媒体设施内部配制	N/A
APC抗小鼠/人CD11b抗体，克隆M1/70	BioLegend (San Diego, CA, USA)	101212	用于流式细胞术分析
PE抗小鼠F4/80抗体，克隆BM8	BioLegend (San Diego, CA, USA)	123110	用于流式细胞术分析
APC抗小鼠CD11c抗体，克隆N418	BioLegend (San Diego, CA, USA)	117310	用于流式细胞术分析
M-CSF	PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)	315-02
GM-CSF	PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)	315-03
Hoechst 33258	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	H1398	流式细胞术分析使用浓度为1-2 µg/mL