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方法文章

小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

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DOI：

10.3791/58081

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2018年10月30日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

本文内容

摘要

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

摘要

树突状细胞和巨噬细胞是抵御病原体的第一道防线中的关键细胞，同时在启动适应性免疫应答中也发挥着重要作用。对这些细胞进行实验操作具有较大挑战性。它们在器官和组织中的数量相对较少，因此难以大量分离获得。此外，这些细胞也难以通过cDNA质粒进行转染。在小鼠模型中，这些问题可通过以下方法部分克服： 体外 在存在M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的条件下诱导骨髓前体细胞分化为巨噬细胞，或在存在GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的条件下诱导其分化为树突状细胞。通过该方法，可利用极少量动物获得大量上述细胞。此外，在骨髓前体细胞分化为骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞之前的培养早期阶段，可使用携带cDNA构建体的逆转录病毒载体对其进行转导。因此，可在逆转录病毒转导后进行细胞分化 体外 可用于在这些细胞中表达各种cDNA构建体。异源蛋白的表达能力极大地拓展了可在这些细胞上开展的实验范围，包括荧光蛋白的活细胞成像、用于相互作用组分析的串联纯化、结构-功能分析、利用生物传感器监测细胞功能等。本文中，我们描述了一种详细的逆转录病毒转导方案，用于将编码荧光标记蛋白的载体导入小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞。以两种接头蛋白OPAL1和PSTPIP2为例，我们展示了该方法在流式细胞术和显微镜分析中的实际应用。同时，我们也讨论了该方法的优势与局限性。

引言

髓系细胞是我们抵御病原体防御机制中不可或缺的一部分。它们能够快速清除微生物以及凋亡细胞。此外，它们还参与调控组织发育与修复，并维持机体稳态1,2,3。所有髓系细胞均来源于骨髓中的共同髓系前体细胞。这些细胞分化为多种功能和形态各异的亚群，这一过程在很大程度上受细胞因子及其不同组合的调控4。目前研究最为深入的髓系细胞亚群包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。这些细胞群体中任何一类的缺陷均可导致潜在的生命威胁性后果，并在人类和小鼠中引发严重的免疫系统功能障碍1,2,3,5,6。

与中性粒细胞不同，树突状细胞和巨噬细胞是组织驻留细胞，其在免疫器官中的数量相对较少。因此，为需要大量这些细胞的实验而分离和纯化原代树突状细胞和巨噬细胞往往成本高昂且常常难以实现。为解决这一问题，已开发出多种实验方案，用于获得大量均一的巨噬细胞或树突状细胞 体外这些方法基于在细胞因子存在下诱导小鼠骨髓细胞分化：使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导巨噬细胞，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）或Flt3配体诱导树突状细胞7,8,9,10,11,12通过该方法获得的细胞在文献中通常被称为骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和骨髓来源树突状细胞（BMDCs）。与相应的细胞系相比，这些细胞在生理特性上更接近原代巨噬细胞或树突状细胞。另一主要优势在于可从基因修饰小鼠中获取这些细胞13野生型细胞与基因修饰小鼠来源细胞之间的比较研究对于揭示目的基因或蛋白质的新功能往往至关重要。

活细胞中蛋白质亚细胞定位分析需要将荧光标记与目标蛋白质偶联 体内。这通常是通过表达一种基因编码的融合构建体来实现的，该构建体由待分析蛋白与荧光蛋白通过一段短连接肽（linker）连接而成例如绿色荧光蛋白（GFP）14,15,16在树突状细胞或巨噬细胞中表达荧光标记蛋白具有挑战性。这些细胞通常难以通过标准转染方法进行转染，且转染效率往往很低。此外，转染效果是瞬时的，会引发细胞应激，且获得的荧光强度可能不足以满足显微镜观察的需求。17为了获得足够数量且外源基因表达水平较高的此类细胞，利用逆转录病毒载体感染骨髓前体细胞，并进一步将其分化为骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）或骨髓来源树突状细胞（BMDCs），已成为一种非常高效的方法。该方法使得研究人员能够在稳态条件下，或在吞噬作用、免疫突触形成及细胞迁移等与免疫应答密切相关的过程中，于天然细胞环境中分析髓系来源蛋白的功能。本文介绍了一种可在小鼠骨髓来源巨噬细胞和树突状细胞中实现目标荧光标记蛋白稳定表达的实验方案。

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方案

本文所述所有方法均已获得捷克共和国分子遗传学研究所实验动物福利专家委员会和捷克共和国科学院的批准。

1. 试剂准备

  1. 配制氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液。将 4.145 g NH4Cl 和 0.5 g KHCO3 加入 500 mL ddH2O 中，然后加入 100 µL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA），过滤除菌。
  2. 配制聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将 0.1 g PEI 加入 90 mL ddH2O 中。边搅拌边逐滴加入 1 M HCl，直至 pH 低于 2.0。继续搅拌最多 3 小时，直至 PEI 完全溶解，然后用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.2。用 ddH2O 定容至 100 mL，并过滤除菌。分装成 1–2 mL 等份，于 -20 °C 保存。
    注意：PEI 融化后可在 4 °C 保存最多 2 周，但不应再次冷冻。
  3. 制备含 M-CSF 或 GM-CSF 的细胞培养上清液。这些上清液可预先制备并储存于 -80 °C。制备方法如下：将细胞因子产生细胞（GM-CSF 使用 J558 细胞18，M-CSF 使用 CMG 14-12 细胞19）在含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中接种于 10 cm 培养皿，培养至完全汇合。然后将所有细胞转移至 T150 组织培养瓶中的 200 mL 培养基中，在 5% CO2/37 °C 条件下继续培养 4 天。收集上清液，经 0.2 µm 滤膜过滤除菌。分装后于 -80 °C 保存。
  4. 配制 100 mL 细胞培养基：DMEM 添加 10% 热灭活 FBS，以及分泌 GM-CSF 的细胞（用于 BMDC 分化）或分泌 M-CSF 的细胞（用于 BMDM 分化）的细胞培养上清液。
    注意：这些上清液中的细胞因子浓度可能有所差异，工作浓度需通过实验确定。通常使用产生 GM-CSF 的细胞系上清液的 2–3%（推荐起始浓度为 2%），或使用产生 M-CSF 的 CMG 14–12 细胞上清液的 5–10%（推荐起始浓度为 10%）。也可选择使用市售的纯化 M-CSF（10 ng/mL）和 GM-CSF（20 ng/mL），其效果与含细胞因子的上清液几乎相同，i.e.，对分化速率、感染效率以及 EGFP 标记构建体的亚细胞定位均无影响。除非另有说明，青霉素 G（100 IU/mL）、链霉素（100 µg/mL）和庆大霉素（40 µg/mL）等抗生素可在本方案的任何步骤中用于细胞培养。

2. 逆转录病毒的制备

警告：尽管逆转录病毒载体与其他类型的病毒载体相比相对安全，但仍可能存在潜在的安全风险。因此，至关重要的是要格外小心操作，使用适当的防护设备，并遵守所有关于病毒颗粒操作的安全规范和法律法规。

  1. 将Platinum-Eco（Plat-E）包装细胞的单细胞悬液接种于10 cm培养皿中，加入15 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，培养24小时至细胞融合度达50–60%。细胞应呈单层生长，培养过程中不应形成细胞团块。
  2. 移液 20 µg 逆转录病毒载体（例如，用于在pMSCV载体中表达荧光标记的目的蛋白的重组质粒）以及10 µg pCL-Eco包装载体20 加入1 mL DMEM（不含血清和抗生素）并轻轻混匀。
  3. 向第二个管中加入75 µL PEI溶于1 mL DMEM（不含血清和抗生素）的溶液。室温（RT）孵育5分钟，然后将两管内容物混合，再于室温下孵育10分钟。
    注意：pCL-Eco 的添加为可选步骤。该质粒编码嗜鼠病毒受体，可能提高病毒滴度。
  4. 小心地将Plat-E细胞中的培养基更换为8 mL新鲜DMEM，添加2% FBS。使用前将培养基预热至37 °C。转染过程中不要使用抗生素，因为抗生素可能会降低转染效率。
  5. 将步骤2.3中制备的混合物逐滴小心加入Plat-E细胞中，于37 °C孵育4小时。
  6. 孵育后，将Plat-E细胞中的培养基更换为10 mL预热的含10% FBS的DMEM，于37 °C继续培养24 h。在此孵育期间，Plat-E细胞将向培养基中释放病毒。
  7. 24 h后，使用5 mL移液器收集含逆转录病毒颗粒的Platinum Eco细胞培养基，并转移至15 mL离心管中（= "上清液 1" 含有嗜鼠逆转录病毒颗粒。
  8. 为避免Plat-E细胞对病毒上清液的污染，将收集的病毒在4 °C下以1250 × g离心5分钟。为获得最佳效果，应立即使用病毒进行感染。
    注意：病毒分装后也可在 -80 °C 保存以备后续使用，但会导致转导效率一定程度下降。应避免病毒反复冻融，以免引起病毒降解。
  9. 向Plat-E细胞中加入10 mL预热的含10% FBS的DMEM，于37 °C继续培养24 h。
  10. 重复步骤 2.7 和 2.8 以获得 "上清液2".

3. 小鼠骨髓细胞的分离

  1. 采用颈椎脱位或其他批准的方法处死小鼠。用70%乙醇喷洒小鼠体表。
  2. 使用镊子和剪刀，去除后肢的皮肤及部分肌肉组织。小心地将髋臼从髋关节中分离，避免股骨断裂。在踝关节处剪下足部。用70%乙醇喷洒骨骼（股骨连接胫骨），并用纸巾去除残留的肌肉。
  3. 将骨骼置于含有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）加2%胎牛血清（FBS）（PBS-FBS）的5 cm培养皿中。 若需处理更多骨骼，应将培养皿置于冰上直至后续操作。 
  4. 为确保培养过程中的无菌性，所有后续操作均应在组织培养超净台内进行。
  5. 在不破坏骨端的前提下，将股骨与胫骨分离（在膝关节处弯曲，并用剪刀小心剪开）。
  6. 逐根处理骨骼。用剪刀剪去骨骺极小部分（约1–2 mm），操作时用镊子夹持骨骼。
  7. 使用30 G针头和装有PBS-FBS的2或5 mL注射器，从骨骼两端冲洗骨髓细胞至15 mL离心管中。冲洗过程中需在骨内移动针头，以确保清除所有细胞。若针头堵塞，应及时更换。
    注意：冲洗过程中骨骼应由红色变为白色，表明大部分细胞已被清除。每根骨骼使用约2–3 mL PBS-FBS。
  8. 在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟。
  9. 弃去上清液，加入2.5 mL ACK缓冲液重悬沉淀，在室温下裂解红细胞2–3分钟。裂解同时，将骨髓细胞通过100 μm细胞筛过滤至新的15 mL离心管中。随后加入12 mL PBS-FBS以恢复渗透压。
    注意：使用ACK缓冲液进行低渗裂解的时间不得超过5分钟，以免导致细胞死亡。
  10. 立即在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟。

4. 骨髓细胞向骨髓来源巨噬细胞的分化

  1. 将骨髓细胞沉淀重悬于添加了10% FBS和抗生素的DMEM中（抗生素浓度见步骤1.4后的注释），并计数细胞。为诱导分化为骨髓来源的巨噬细胞，将5–10 × 106个骨髓细胞接种至一个10 cm非组织培养处理（细菌级）培养皿中，加入10 mL预先配制好的含血清和M-CSF的DMEM培养基（来自步骤1.4）。
    注：每只6–8周龄的C57BL/6J小鼠所获得的骨髓细胞产量约为4 × 107个。
  2. 将细胞置于细胞培养箱中，在5% CO2、37 °C条件下孵育3天。
    注：在前两天，细胞活力较差，因存在大量凋亡细胞（无法分化为髓系细胞及终末分化的细胞）。
  3. 3天后，骨髓细胞培养物开始呈现良好活力，并形成分裂细胞的集落。此时已可观察到首批贴壁细胞。在此阶段，补充新鲜的细胞因子培养基。
  4. 向每个10 cm培养皿中加入10 mL预热的含血清和M-CSF的DMEM培养基（来自步骤1.4），并将培养皿放回细胞培养箱。此步骤无需移除旧培养基。
    注：骨髓来源巨噬细胞在培养5–7天后完成完全分化。最佳收获时间为第6–8天，此时大多数细胞已贴壁，且培养皿表面完全被细胞覆盖。
  5. 在第5天，将培养皿移至细胞培养超净台，倾斜培养皿使培养基接近皿边缘。小心从边缘附近的液面吸取15 mL培养基，此时细胞倾向于保留在培养皿中央。随后加入等体积预热的含M-CSF培养基，并将培养皿放回培养箱。
    注：若缓慢且小心地吸除培养基，几乎不会损失细胞。此外，也可将吸出的培养基离心，回收其中的细胞并重新加入原培养体系，以确保未贴壁（即未完全分化）的细胞不被丢失。
  6. 实验仅使用贴壁细胞（巨噬细胞）。收获细胞时，在第6或第7天移除所有培养基及悬浮细胞。用预热的无血清PBS洗涤培养皿一次。
  7. 加入5 mL含0.02% EDTA的PBS，于37 °C组织培养箱中孵育3–5分钟。
  8. 使用5 mL移液器，用PBS-EDTA溶液冲洗培养皿以收集细胞，并将细胞悬液转移至含25 mL PBS的50 mL离心管中。如有需要，可合并多个培养皿的细胞。
  9. 立即在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。
  10. 将巨噬细胞沉淀重悬于DMEM培养基中并计数细胞。通过流式细胞术验证巨噬细胞表面分化标志物（CD11b和F4/80）的表达。
  11. 对于需要细胞处于悬浮状态的实验，例如流式细胞术、qPCR或Western blot分析，可直接使用上述巨噬细胞。对于需使用贴壁巨噬细胞的实验，应根据实验设计将细胞接种至组织培养板中。
  12. 细胞已完全分化。可将其维持在适合目标实验的培养基中，或继续使用含M-CSF的原始生长与分化培养基。
    注：若需进行贴壁巨噬细胞实验，建议至少在使用前6小时（理想情况下过夜）将细胞转移至新培养板，以确保其充分贴附于新表面。实验前可去除少量仍处于悬浮状态的细胞。

5. 骨髓细胞向骨髓来源树突状细胞的分化

  1. 遵循BMDM的实验方案，但针对BMDCs进行以下5.2–5.4步骤中所述的调整。
  2. 将获得的骨髓细胞沉淀重悬于含10% FBS和抗生素的DMEM中，并计数细胞（参照巨噬细胞实验方案的第 4.1步）。为诱导分化为树突状细胞，将1–1.5 × 107个骨髓细胞接种至10 cm非组织培养处理（细菌级）培养皿中，加入10 mL预先配制的含血清和GM-CSF（来自第1.4步）的DMEM培养基。
  3. 培养步骤与BMDM方案相同（巨噬细胞方案的4.3–4.5步），但使用含血清和GM-CSF的DMEM培养基，而非M-CSF。由于BMDCs的培养时间较长（通常为10–12天），需额外添加1–2次换液，间隔为3天（操作方式同第4.5步，即移除上清液并加入新鲜培养基）。
  4. 本部分操作与巨噬细胞方案中的相应部分基本相同（巨噬细胞方案的4.6–4.12步）。实验仅使用贴壁细胞。在第10–12天，用EDTA收集细胞，计数后接种至新的培养表面。通过流式细胞术检测树突状细胞表面分化标志物（CD11c+, CD11b+, F4/80-）的表达情况。

6. 表达EGFP标签目的蛋白的BMDM和BMDC的制备

  1. 将第 3.10 步中获得的骨髓细胞沉淀用添加了 10% FBS 和抗生素的 DMEM 重悬，并对细胞进行计数。用于感染时，每孔 6 孔组织培养板中加入 2–5 × 106 个骨髓细胞。
  2. 每孔加入 1 mL 上述制备好的 DMEM 培养基，培养基中添加 M-CSF 以诱导分化为 BMDM，或添加 GM-CSF 以诱导分化为 BMDC。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的组织培养孵箱中培养 4–6 小时。
  3. 加入 2 mL 新鲜收集的病毒（"上清液 1"），并加入聚凝胺（终浓度为 12 µg/mL，加入细胞后终浓度为 8 µg/mL）。
    注意：也可使用含有病毒的上清液的冷冻分装样品，但其感染效率会较低。
  4. 在 30 °C 下以 1,250 × g 离心 90 分钟（加减速缓慢），然后在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。
  5. 可选：将 2 mL 培养基更换为含有相应细胞因子（M-CSF 或 GM-CSF）的新鲜培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养。第二天，移除 2 mL 培养基，并使用 2 mL 新鲜收集的病毒（"上清液 2"）重复整个感染步骤（步骤 6.3–6.4）。
    注意：此步骤可能提高感染效率。第二次感染后的改善程度取决于细胞类型和靶蛋白，根据我们的经验，效率提升范围可从 30% 到无任何改善不等。
  6. 收集非贴壁细胞，转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  7. 将细胞沉淀用 10 mL 含 M-CSF 或 GM-CSF 的培养基重悬，将细胞接种至一个 10 cm 未经过组织培养处理的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。对于 10 cm 培养皿，骨髓来源巨噬细胞的最佳细胞数量为 5–10 × 106，骨髓来源树突状细胞为 10–15 × 106。
    注意：可使用更小的培养皿或板，但需相应调整细胞数量。
  8. 按照第 4 和第 5 步中所述的巨噬细胞和树突状细胞培养与分化方案进行操作。

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结果

信号接头蛋白通常是不具有任何酶活性的小分子蛋白。它们含有多种相互作用结构域或基序，可介导与其他信号转导相关蛋白的结合，包括酪氨酸激酶、磷酸酶、泛素连接酶等21。为展示本实验方案的功能性，选择了髓系细胞接头蛋白PSTPIP2和OPAL1。PSTPIP2是一种已被充分表征的蛋白，参与炎症反应的调控22。它是一种细胞质蛋白，也可通过其F-bar结构域被招募至细胞膜。第二种蛋白是跨膜接头蛋白OPAL1，预期定位于细胞膜。其生理功能目前尚不清楚。然而，在急性淋巴细胞白血病中，OPAL1的表达与较好的预后相关23。

将编码C端融合EGFP的PSTPIP2或OPAL1的cDNA构建体（分别通过短接头GSGGGS或Myc标签连接）采用标准cDNA克隆方法插入pMSCV逆转录病毒载体中。随后将该构建体与包装载体pCL-Eco共同...

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讨论

在多种生物学研究中，目标细胞中目的蛋白的表达是一个关键步骤。分化的巨噬细胞和树突状细胞难以通过标准转染和逆转录病毒转导技术进行基因导入。通过逆转录病毒感染骨髓前体细胞，使其携带所需的表达构建体，再诱导其分化为成熟细胞，从而绕过直接转染分化细胞的难题，是实现在这些细胞类型中异位表达cDNA的关键策略。我们近期发表的研究25中已成功应用了该方法。本文提供了一种经济高效的实验方案，利用该策略在骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中实现目标构建体的稳定表达。本方案成本较低且操作简便，同时可获得非常理想的结果。所用试剂价格合理，即使在经费较为有限的情况下也可常规使用。本方案中Plat-E细胞的转染采用聚乙烯亚胺（PEI）作为转染试剂。与其他化学转染试剂相比，PEI成本极低，而其转染效率与大多数广泛使用的商业化试剂相当。然而，在此步骤中也可使用多种市售的其他转染试剂替代PEI，且不会降低转染效率。一般而言，适用于常用HEK293细胞的转染方案通常也适用于Plat-E细胞。另一项节约成本的措施是使用含细胞因子的上清液替代纯化的重组细胞因子。使用上清液需要一定的优化过程，但一旦建立了标准制备流程并严格执行，不同...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由捷克科学基金会（GACR）（项目编号 16-07425S）、查理大学资助局（GAUK）（项目编号 923116）以及捷克共和国科学院分子遗传学研究所的机构资助（RVO 68378050）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270用于培养基补充
KHCO3Lachema, Brno, 捷克共和国N/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)A9434
青霉素BB Pharma AS, Prague, 捷克共和国N/APENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
链霉素Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137硫酸链霉素粉末
庆大霉素Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, 捷克共和国N/A
聚乙烯亚胺，线性，分子量 25,000Polyscience, Warrington, PA, USA23966
聚凝胺Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
PBS由捷克共和国布拉格IMG ASCR媒体设施内部配制N/A
APC抗小鼠/人CD11b抗体，克隆M1/70BioLegend (San Diego, CA, USA)101212用于流式细胞术分析
PE抗小鼠F4/80抗体，克隆BM8BioLegend (San Diego, CA, USA)123110用于流式细胞术分析
APC抗小鼠CD11c抗体，克隆N418BioLegend (San Diego, CA, USA)117310用于流式细胞术分析
M-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)315-02
GM-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAH1398流式细胞术分析使用浓度为1-2 µg/mL

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