为了以可靠且可重复的方式，扩大全球实验室评估肺癌患者是否适合接受帕博利珠单抗治疗的能力，我们开发了一种检测方法，该方法在广泛使用的免疫组织化学自动染色仪上采用22C3抗体浓缩液，适用于活检和细胞学标本。
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摘要
摘要
帕博利珠单抗单药治疗已被批准用于PD-L1表达的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的一线和二线治疗。PD-L1免疫组织化学（IHC）22C3伴随诊断检测法通过检测肿瘤组织中的PD-L1表达水平，提供肿瘤比例评分（TPS），该方法已获得验证。我们开发了一种经过优化的实验室自建检测方法（LDT），该方法在广泛使用的IHC自动染色仪上采用22C3抗体（Ab）浓缩液，适用于活检和细胞学标本。本研究使用120对配对的完整肿瘤组织切片与活检样本，以及70对配对的活检与细胞学样本（支气管冲洗液，n = 40；胸腔积液，n = 30）评估PD-L1 TPS。在两个TPS临界值（≥1%、≥50%）下，基于22C3抗体浓缩液的LDT在活检样本（约100%）与细胞学样本（约95%）之间均显示出与PD-L1 IHC 22C3伴随诊断检测结果高度一致的符合率。本文所介绍的优化LDT方法利用22C3抗体浓缩液对肿瘤组织及细胞学标本中的PD-L1表达进行检测，将有助于全球各地的实验室以可靠且可重复的方式评估NSCLC患者是否适合接受帕博利珠单抗单药治疗。
引言
近期的临床试验表明，帕博利珠单抗（pembrolizumab）在治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者中具有疗效。帕博利珠单抗是一种人源化的单克隆IgG4 kappa同型抗体，可阻断程序性细胞死亡受体1（PD-1）与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用1,2,3,4。
目前，帕博利珠单抗被批准用于治疗PD-L1表达的非小细胞肺癌（NSCLC），适用于PD-L1表达肿瘤比例评分（TPS）≥50%且无表皮生长因子受体（EGFR）或间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因组肿瘤异常的初治患者3，以及既往接受过治疗且PD-L1 TPS≥1%的患者1。
通过免疫组织化学法（IHC）检测的PD-L1蛋白表达已被广泛用作抗PD-1/PD-L1治疗的预测性生物标志物检测方法。在帕博利珠单抗的临床试验中，采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，通过PD-L1 IHC 22C3伴随诊断检测法测定肿瘤比例评分（TPS）5。该检测方法已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，并在欧洲获得CE认证，用于测定肿瘤PD-L1 TPS5。
对于使用22C3抗体浓缩液的实验室自建检测（LDT）方法，在不同机构间建立可靠的高质量PD-L1肿瘤比例评分（TPS）评估的全球统一标准至关重要，以支持关于患者是否符合帕博利珠单抗治疗资格的临床决策。目前大量病理科实验室无法获得配套诊断试剂PD-L1 IHC 22C3检测试剂盒。因此，开发可靠且结果一致的LDT方法，并使其兼容其他广泛可用的免疫组化自动染色平台，显得尤为必要。
此外，有必要利用细胞学样本建立实验室自建检测方法（LDT），因为细胞学样本是晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者最常可获得的唯一标本类型。PD-L1免疫组化22C3伴随诊断检测仅针对手术切除标本、穿刺活检标本以及能够获得至少100个肿瘤细胞的支气管镜标本进行了验证。尽管上述标本类型常可获取，但细胞学标本更易于采集，并且在某些医疗机构中是最常见的可用标本类型6,7。然而，目前尚无经过验证的诊断检测方法可用于评估细胞学样本中的PD-L1表达水平；开发与细胞学样本兼容的可靠LDT将有助于进一步提升PD-L1检测的质量。
此外，在建立LDT的临床验证时，免疫组化（IHC）的操作应尽可能与相应的经临床验证的商用检测试剂盒保持一致8。例如，为在连续切片中获得相同的信号，需验证若干关键步骤，包括抗体滴定、预处理延迟时间、孵育时间以及信号放大系统9。
我们近期开发了一种经过优化的实验室自建检测方法，采用22C3抗体浓缩液来评估肿瘤活检及细胞学样本中的PD-L1表达水平10,11我们发现与LDT具有高度一致性 与 的 "金标准" PD-L1 IHC 22C3 检测10,11该经过临床验证的方案将支持在全球各地区开展可靠、高质量的PD-L1检测。
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方案
所有操作均已获得当地伦理委员会（人类研究伦理委员会，尼斯大学医疗中心/肿瘤库 BB-0033-00025）的批准。
注意：本方案已针对在商用全自动免疫组化染色仪（以下简称自动染色仪，参见材料表）上使用22C3抗体浓缩液进行肿瘤活检和细胞学样本检测进行了专门优化。
1. 肿瘤组织样本的制备
- 将肿瘤组织置于包埋盒中的10%中性缓冲福尔马林（NBF）中固定。
注意：近端肺部肿瘤的组织通常由肺科医生在中度镇静下通过支气管镜检查获取。对于外周病灶和弥漫性肺部疾病，应进行经支气管或穿刺活检。这些操作通常在手术室或重症监护室中进行。 - 将包埋盒中的组织进行石蜡包埋。
注意：固定可在解剖后立即通过灌注或浸入法完成，通常需要8–10小时。固定液体积应为标本体积的15–20倍。不建议将活检组织固定超过10小时，因为过度固定可能导致抗原掩蔽。在室温下，固定速度约为1 mm/h。 - 使用组织处理机（参见材料表）对固定后的组织样本进行石蜡浸润。
注意：脱水过程依次通过浓度递增的三种酒精浴（70%、 85%和 90%）完成，最后通过三次无水酒精浴彻底去除水分。透明步骤使用三次甲苯浴完成，石蜡浸润则在热石蜡浴（44–60 °C）中进行。 - 将组织置于装有熔化石蜡的模具中（参见材料表），等待其凝固。
- 使用切片机将石蜡包埋的组织切成3 μm厚度的切片。
- 将石蜡带转移至带正电荷的显微镜玻片上（参见材料表）。
- 在37 °C下干燥玻片1小时。
注意：为保持抗原性，组织切片应储存在2–8 °C（优先）或室温不超过25 °C的条件下，并在切片后15天内完成染色。
2. 细胞学样本的制备
- 使用保存液收集支气管灌洗液（见材料表）。
注：此步骤采用标准支气管镜技术。- 灌洗待取样的支气管区域，将灌洗液收集至洁净容器中。用患者的姓名、出生日期和标本来源标记容器。
- 将支气管灌洗液转移至50 mL锥形管中，加入2 g DL-二硫苏糖醇粉末（见材料表），涡旋振荡30分钟，然后在室温下以250 × g 离心5分钟。
- 弃去上清液，加入10 mL黏液溶解液（见材料表）。
- 以中等速度（9级）振荡样品20分钟，并在室温下以250 × g 离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀转移至含有10%中性缓冲福尔马林（NBF）的收集管中。
- 向细胞沉淀中加入4滴细胞块制备试剂（见材料表）。
- 将细胞沉淀转移至包埋盒中，用10% NBF固定，然后进行石蜡包埋，用于制备细胞块并切片（见步骤1.1–1.7）。
3. PD-L1 染色检测
- 打开自动染色机和计算机。
- 双击自动染色机图标并选择用户。
- 点击“创建标签”，然后点击“方案”。
- 双击22C3方案。
注意：首先通过点击“创建方案”将该方案安装到自动染色机的计算机中。完整方案作为 补充文件1提供。 - 在标签上填写患者的编号，然后点击“打印”。
- 将标签贴在载玻片上。
- 按下所选抽屉的按钮，打开载玻片抽屉。
- 将贴好标签的载玻片放置在加热垫上，标签面朝上且朝内。
- 关闭载玻片抽屉。
- 取下试剂瓶盖，将试剂加载到试剂架上。
- 打开染色机罩盖，将试剂架放置在试剂转盘上，确保其安装到位并固定牢固。
- 关闭罩盖。
- 在软件中点击将要使用的仪器，然后点击“运行”。
- 免疫组化染色程序结束后，用自来水冲洗载玻片数秒，并加入一滴清洗液。
- 依次用100%乙醇和95%乙醇各浸泡数秒，对载玻片进行再水化处理。
- 将载玻片放入封片机中，进行盖玻片的自动加载。
4. PD-L1 染色结果的判读
注意：PD-L1 免疫组织化学检测的判读应由具备资质的病理学家进行。
- 在检查患者标本之前，通过分析阳性和阴性对照来评估 PD-L1 染色的质量。
注意：如果对照染色结果不可接受，则患者标本的检测结果视为无效。 - 在显微镜下确认存在至少 100 个可评估的活肿瘤细胞。
注意：当患者标本中肿瘤细胞少于 100 个时，应予以报告。 - 在 4X 低倍放大下，评估所有保存良好的阳性及阴性肿瘤区域。
注意：在低倍放大下，部分细胞膜染色或弱强度（1+）的细胞膜染色可能难以识别。 - 对部分或完整的细胞膜染色进行评分。
注意：胞质染色不应纳入结果判读。 - 通过评估保存良好肿瘤区域内 PD-L1 阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的比例，计算 TPS。
注意：仅应评估活肿瘤细胞。所有其他细胞成分，如免疫细胞、坏死细胞、正常细胞和人为假象，均应排除在评估之外。
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结果
采用本文所述方法，并结合该研究团队近期发表文献中详细描述的流程10,11，优化后的实验室自建检测方法（LDT）已在120例存档的非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）活检样本中完成临床验证，这些样本来自2007年3月至2016年3月期间在法国尼斯巴斯德大学医院接受手术切除或活检的患者。此外，为评估细胞学样本中PD-L1的表达情况，在70对配对组织活检样本和细胞块中评估了肿瘤比例评分（TPS），细胞块样本来源于支气管冲洗液（n = 40）或胸腔积液（n = 30）（样本采集时间为2014年7月至2016年11月，采集单位为法国尼斯巴斯德大学医院）。所有切片均在24小时内新鲜切割并完成染色。
使用22C3抗体浓缩液（LDT）与PD-L1 IHC 22C3伴随诊断试剂盒（金标准）对活检标...
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讨论
我们通过将使用22C3 PD-L1抗体浓缩液的优化实验室自建检测方法（LDT）与相应的临床验证商用检测试剂盒进行比较，完成了对该LDT的验证10,11。在≥1% TPS和≥50% TPS两个阈值下，基于22C3浓缩抗体的LDT在活检样本（约100%）和细胞学样本（约95%）中与PD-L1 IHC 22C3检测试剂盒测定的PD-L1免疫组化表达结果具有高度一致性。根据国际肺癌研究协会（IASLC）最近的建议，PD-L1阳性区域的选择应涵盖约10例PD-L1阴性样本、10例PD-L1阳性样本以及20例覆盖临床验证PD-L1 IHC检测线性动态范围的样本8。我们对120例活检样本和70例细胞学样本进行了验证研究。总体而言，无论TPS阳性阈值、样本类型或肿瘤组织学类型如何，其一致性均较高。本文所呈现的结果与其他既往研究一致，均显示组织和细胞学样本中具有高度一致性12,13
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
本研究由美国新泽西州凯尼尔沃思的默克公司（Merck & Co., Inc.）资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | 细胞学标本保存液 |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | 黏液溶解溶液 |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 组织包埋台系统 | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| SuperFrost Plus 显微镜载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-二硫苏糖醇粉末 | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax 涡旋振荡器 | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 抗 PD-L1 浓缩抗体 | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA 自动染色机 | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ 通用连接剂 | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP 多聚体 | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView 放大剂 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView 放大多聚体 | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView 铜增强剂 | Ventana | #760-700 | |
| 苏木精 II | Ventana | #790-2208 | |
| 蓝化试剂 | Ventana | #760-2037 | |
| 细胞条件调节液 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek 覆盖膜封片机 | Sakura | 4742 |
参考文献
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