使用膝关节测量仪评估大鼠膝关节屈曲挛缩中特定组织的贡献

摘要

本实验方案的目的是测量大鼠膝关节的伸展活动范围。可通过该方法量化各种增加膝关节僵硬程度的疾病的影响以及治疗措施的有效性。

摘要

正常的膝关节活动范围（ROM）对健康至关重要，能够使人完成行走、爬楼梯和坐下等基本活动。活动范围丧失被称为关节挛缩，会导致发病率升高。由于已形成的膝关节挛缩难以逆转，因此早期发现非常重要，了解其发生的风险因素尤为关键。大鼠是一个良好的研究模型，可用于评估干预措施的效果，原因在于大鼠膝关节解剖结构与人类相似，能够耐受长时间的膝关节屈曲固定，且其力学数据可与膝关节组织的组织学和生物化学分析结果相互关联。

我们采用自动化关节测量仪，展示了一种经过验证的、精确的、可重复的、不受操作者影响的方法，用于在特定扭矩下测量大鼠膝关节的伸展活动范围（ROM）。该关节测量仪可用于确定各种干预措施对大鼠膝关节活动范围的影响。

引言

关节活动范围（ROM）的完整对于健康和福祉至关重要¹。关节被动活动范围的丧失称为挛缩²。关节挛缩可由多种情况引起，包括长期卧床、瘫痪、关节成形术、烧伤、感染以及神经系统疾病^1,3,4,5。膝关节挛缩可能导致残疾，因为它会加速关节退化，增加跌倒风险，并对个体完成基本功能活动（如行走、坐立和爬楼梯）的能力产生不利影响^6,7。

一旦形成，膝关节挛缩难以治疗，因此确定哪些患者最易发生此状况，对于预防挛缩及相关并发症至关重要⁸。实验设计旨在评估：1）导致或影响膝关节挛缩的条件；2）挛缩的严重程度；3）其时间进程；4）参与挛缩的组织；5）挛缩的可逆性；以及6）各种预防性和治疗性干预措施对膝关节活动范围（ROM）的效果。对于所有这些实验，一种有效、客观、精确且可重复的ROM测量方法至关重要。其他辅助性指标（如能量消耗、组织形态计量学、基因表达和蛋白质含量）有助于理解关节挛缩的病理生理机制，但机械性活动受限才是限制患者功能并导致残疾的直接因素。该研究领域面临的一些挑战包括膝关节ROM在实验检测中方法的异质性，以及定量数据的缺乏⁹。多种不同实验方法的使用导致各实验室之间的结果无法相互比较，从而引发了关于导致关节挛缩的条件（如关节固定或关节成形术）的争议¹⁰。因此，亟需一种在干预后实验性测量关节ROM的自动化方法。

本文介绍了一种无需依赖操作者、有效、精确且可重复的实验方案，用于评估大鼠膝关节活动范围（ROM）。该方法采用自行设计的关节测量仪与数码相机联用，精确测量膝关节伸展时的活动范围。我们测试了不同固定时间对膝关节活动范围的影响。随后，描述了如何利用骨骼解剖标志点，在预设扭矩条件下，对所获得的数字图像进行活动范围测量的方法。总体而言，这些方法能够可靠地测量大鼠膝关节活动范围，并提供定量数据。

方案

所采用的大鼠膝关节固定模型已获得渥太华大学动物护理与兽医服务部门及当地伦理委员会的批准。

1. 动物准备

1. 在预定的固定期结束时，通过给予二氧化碳对大鼠实施安乐死。
   注：此处我们采用了一种使用一块金属板和两枚螺钉的固定模型（一枚螺钉插入股骨近端，另一枚插入胫骨远端），该方法避免了对膝关节结构的任何破坏，并维持膝关节屈曲135°的位置，如先前所述⁶。随着时间推移，该模型可导致膝关节屈曲挛缩¹¹。
2. 用吸水且防水的保护垫覆盖关节测量仪将要放置的区域及其周围区域。实验过程中需佩戴手套、实验服和眼部防护装置。
3. 使用手术刀切开皮肤，暴露金属板和螺钉（参见步骤1.1后的注释）；近端的螺钉位于股骨近端，远端的螺钉位于胫骨远端。通过触诊定位螺钉。一旦螺钉头部暴露，使用螺丝刀将其拆除。
   注：在固定期间，螺钉头部可能被软组织覆盖。若发生此情况，使用手术刀轻轻去除组织，暴露螺钉头部。
4. 螺钉拆除后，手动或使用解剖器械包中的镊子移除金属板。
5. 使用剪刀和镊子对下肢进行去皮处理，将皮肤从下方筋膜上分离并去除。

2. 动物在电机驱动关节测量仪上的定位

注意：所有测试均应在室温下进行。此处，关节测量仪由标准的北美 120 V 输入电源供电。适配器输出为 12 V 和 500 mA。

1. 将待测动物侧卧放置，实验侧肢体（待测肢体）朝上（图 2）。
   1. 将股骨固定在关节测量仪底座集成的带槽金属夹具中。使用精密螺丝刀穿过肌肉组织，在大转子远端位置安装夹具以固定股骨。调整股骨外侧髁，使其对准关节测量仪的旋转中心（图 1，2）。
   2. 将带有两个直立支柱的可动臂置于肢体后方，位于跟骨稍上方位置，以便在电动机启动后推动膝关节进入被动伸展状态。
   3. 使用六角扳手拧紧夹具底部，确保股骨牢固固定。
2. 使用螺丝刀确认相机已正确安装在关节测量仪上，并设置为手动对焦模式。将相机对焦于股骨髁部位。
3. 根据待测膝关节活动范围（ROM）的方向及大鼠的体位，在关节测量仪上选择旋转方向（顺时针或逆时针）。
4. 同时按下电源和启动按钮以激活关节测量仪电机。
   注意：必须同时按下电源和启动按钮是设备的安全设计，可防止意外启动。
   1. 观察关节测量仪电机以 6.6 RPM 的速度运转，当达到第一个预设扭矩时停止 2.1 秒。
   2. 注意：当达到第一个预设扭矩时，相应的 LED 指示灯会亮起，数码相机将自动拍摄膝关节图像。
      注意：图像拍摄完成后，关节测量仪将继续施加下一个更高的预设扭矩。在完成四个预设扭矩的施加后，设备将自动停止。一旦大鼠被固定在关节测量仪上并开始测试，单侧膝关节的总测试时间约为 18.8 秒。具体时间可能因关节挛缩程度不同而略有差异。所获取的图像用于测量每个扭矩下的关节伸展角度。

3. 使用电机驱动的关节测量仪捕捉膝关节伸展角度

注意：每次施加扭矩后，当电机停止时，会触发数码相机拍摄一张图像。相机安装在支架上，正对被测膝关节的上方，并聚焦于股骨髁。

1. 使用同一只动物的同一膝关节继续在不同条件下进行测试，例如，在切断后方跨关节肌肉以分离挛缩的关节源性（非肌源性）成分后，或使用另一只动物的膝关节进行测试。
   1. 完成肌腱切断术时，应从靠近膝关节的近端开始解剖，确保不损伤关节囊。
      注意：在肢体处于伸展状态并施加扭矩设定值4（17.53 N-cm）时完成肌腱切断术最为方便。随后，重复步骤2.1至3.1。
2. 当两只后肢在所有实验条件（例如，肌腱切断术前和术后）下均完成测试后，应按照机构规程处理动物尸体及所有生物危害性材料，并清洁关节测量仪。

4. 膝关节活动范围测量分析

1. 使用 ImageJ 分析 ROM。
   注意：此处使用的是版本 1.45s。
2. 打开由安装在大鼠关节测量仪上的相机拍摄的数字图像文件。
   注意：执行分析的人员应对动物的实验分组情况设盲（例如，固定组与对照组）。
3. 从主工具栏中选择角度工具，通过绘制股骨线（从股骨夹具中点至股骨外侧髁，与股骨干对齐，图 2）和胫骨线（从股骨外侧髁至外踝，图 2）来标定股胫角。
   注意：股胫角对应于在每个预设扭矩下达到的最大膝关节伸展角度。
4. 点击分析|测量使用测量工具，显示上述两条线所计算出的角度。采用 0° 表示完全伸展的惯例。

结果

不同固定时间下膝关节伸展角度的变化总结显示，随着固定时间的延长，所形成的关节挛缩更为严重。使用 ImageJ 获得的代表性结果如图3所示。

以一种有效、精确、可重复且不受操作者影响的方式测量大鼠膝关节最大伸展角度，从而减少数据中的偏倚。在本示例中，我们评估了7只大鼠在持续固定16周后的膝关节最大伸展角度，比较了被固定的（实验侧）肢体与未固定的对侧肢体。固定肢体的选择在每只大鼠之间交替进行（例如，大鼠1固定右膝，大鼠2固定左膝）。进行角度测量的研究人员在测量过程中对哪一侧肢体被固定保持盲态。结果如图3所示。对于被固定的膝关节，其最大伸展能力较对侧有所降低。跨关节肌肉的切断可消除屈曲挛缩中的肌源性成分。在肌腱切断术后，实验侧和对侧膝关节的最大伸展能力均有所提高；然而，实验侧膝关节仍表现出屈曲挛缩（

讨论

大鼠膝关节测量仪的开发旨在对干预后大鼠膝关节的最大伸展角度进行可重复且可靠的测定。该装置的优点包括通过恒定的力臂长度和伸展力，在膝关节处稳定地产生扭矩。另一优点是可将扭矩设定在特定水平，从而对同一关节进行重复测试，以评估不同关节结构（如肌肉、关节囊或韧带）对膝关节活动范围（ROM）的影响。例如，在对完整关节进行测试后，可切断后侧跨关节的膝部肌肉，再重复使用关节测量仪进行测试，以确定关节源性因素对伸展受限的贡献¹¹。

关节测量仪优化测量准确性和精确性的特定机械特征包括带槽夹具，该夹具设计用于防止测试过程中股骨旋转（图1）。远端的两个金属直立柱从后方接触腿部，以顺时针方向推动膝关节伸展，并在测试过程中最大限度降低胫骨相对于股骨向后脱位的风险（图1）。立柱的高度以及上部直立连接杆的前部悬伸部分确保胫骨不会从立柱上滑脱。直立立柱能够旋转并保持在距跟骨近端的胫骨上的位置，从而确保扭矩恒定。依次测试四个扭矩水平：2.53 N·c...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
关节测量仪	The Ottawa Hospital Rehabilitation Centre - Rehabilitation Engineering	N/A
相机	Canon	EOS-500D	通常称为 EOS Rebel T1i
ImageJ	美国国立卫生研究院	版本 1.45s
吸水垫	VWR	820202-845
解剖工具包	Fisher	08-855	工具包包含：  镊子：中等尖头，镍镀层  剪刀：1.5 英寸（40 mm）刀片，不锈钢  解剖刀手柄：镍镀层  刀片：不锈钢，每包3片  滴管：玻璃材质  弯头解剖针：不锈钢针体，带塑料手柄  直头解剖针：不锈钢针体，带塑料手柄 Vinylite 尺子 6 英寸（15 cm）
精密螺丝刀	Mastercraft	057-3505-8
手术刀片 - #10	Fine Science Tools	10010-00
螺丝刀	Stanley	057-3558-2
六角扳手	Mastercraft	058-9684-2
通用交流转直流电源适配器	RCA	108004951