本文介绍了一种对酵母RNA修饰酶Mod5进行生化表征的实验方案，并讨论了该方案如何应用于其他RNA修饰酶的研究。
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方法文章
一个 体外 检测tRNA-异戊烯基转移酶活性的实验方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
N6-异戊烯基腺苷RNA修饰在原核生物和真核生物中具有多种功能且高度保守。其中一种高度保守的N6-异戊烯基腺苷修饰发生在部分tRNA的A37位点。该修饰通过增强tRNA与核糖体的亲和力，提高翻译效率和保真度。在真核生物中，负责该修饰的酶若发生突变，与多种疾病状态相关，包括线粒体功能障碍和癌症。因此，了解这些酶的底物特异性和生化活性，对于理解正常和病理状态下的真核生物生物学至关重要。已有多种方法被用于表征i6A修饰。本文描述了一种直接检测Mod5介导异戊烯基化的方法。该方法利用重组异戊烯基转移酶与RNA孵育，随后进行RNase T1消化，并通过一维凝胶电泳分析检测i6A修饰。此外，还讨论了该方案在表征其他RNA修饰酶方面的潜在适用性。
引言
已鉴定出至少163种不同的转录后RNA修饰，这些修饰赋予RNA多种且依赖于具体环境的功能，直接影响RNA的结构，并调控RNA与其他分子的相互作用1,2。随着对RNA修饰种类和数量的认识不断加深，开发能够可靠检测RNA修饰及其催化酶的分析方法变得至关重要。
最早被发现的RNA修饰之一发生在tRNA的第37位碱基，该位置位于反密码子3'端的相邻处3,4。异戊烯基从二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）转移到腺苷37的N6位（i6A37）3,5，该修饰存在于部分细胞质和线粒体tRNA中。i6A37通过增强tRNA与核糖体的亲和力，提高翻译的保真度和效率4,6，并且i6A37在细菌的应激反应中具有重要作用7。执行该修饰的酶被称为tRNA异戊烯基转移酶，在细菌8
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方案
注意：本方案改编自参考文献24。
1. 获取目的 RNA 和酶
- 使用 体外 转录的RNA内部标记有 32P，以及在体内表达并纯化的重组His6-Mod5 E. coli，如先前所述24.
- 介绍 体外 转录RNA（第3节），使用T7 RNA聚合酶，在未标记的ATP、UTP、CTP、GTP和10 µCi经凝胶纯化、乙醇沉淀的α-ATP存在下进行，将产物重悬于1x TE（10 mM Tris-HCl pH 7.5，0.1 mM EDTA）中，于-80 °C保存24.
- 或者，获取 commercially available 荧光标记的RNA。在任何首选表达系统中表达目标酶。
注意：RNA 内部的荧光标签可能改变 RNA 的结构以及酶对 RNA 的识别。
2. 制备20%变性聚丙烯酰胺凝胶
注意：为了获得足够的RNA片段分辨率，建议使用40 cm长的垂直板状凝胶。凝胶的宽度取决于待分析样品的数量。
- 彻底清洁玻璃板....
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结果
Mod5 在有或无 DMAPP 的条件下与酪氨酸 tRNA 或丝氨酸 tRNA 共同孵育。修饰反应完成后，产物经 RNase T1 消化，该酶可切割所有鸟苷酸的 3' 端，生成 3' 鸟苷单磷酸（GMP）24 (图1）。RNA 的完全消化会产生可预测的放射性标记片段模式（图2A），随后在20%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。DMAPP向RNA转移异戊烯基会导致含有修饰位点的片段发生迁移率偏移。图1).
该方案可可靠地检测由Mod5介导修饰的经典与非经典tRNA残基的异戊烯化修饰24例如，Mod5 被预测可修饰一组含有先前描述的 AAA 的 tRNA<.......
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讨论
RNA修饰被不断证实其在细胞及生物体功能中发挥着日益重要且多样化的作用。因此，开发用于研究RNA修饰酶的检测方法对于深入理解生物学基本机制至关重要。本方案描述了一种高分辨率的 体外 表征Mod5 tRNA修饰活性的检测方法。
该方案具有显著优势，可直接且易于解读地检测异戊烯基化。所描述的方案可用于对异戊烯基转移酶进行可靠的生化表征。此外，该系统可与酶突变体或修饰的RNA底物联用，从而直接确定特定残基或结构域在修饰过程中的作用。为进一步提高分辨率，该方案可轻松扩展，加入其他核糖核酸酶（如RNase P1和/或RNase A）的平行消化步骤，分别切割所有四种核苷酸或特异性切割C和U位点。
该检测方法的一个局限性在于其通量相对较低，因此可实际分析的RNA数量少于RNA测序和质谱分析方法34。因此，不建议将本方案用于旨在全转录组范围内鉴定RNA修饰位点的研究者。本方案最适合那些希望研究特定RNA修饰酶对特定目标RNA作用的研究人员。然而，许多用于全转录组范围鉴定RNA修.......
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致谢
我们感谢 David Engelke 博士对本文手稿提供的指导和有益的建议。PJS - Ball State 大学实验室启动资金；DAB - 项目编号 1R15AI130950-01。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 尿素凝胶浓缩液 | 国家诊断公司 | EC-833 | 作为试剂盒的一部分 |
| 尿素凝胶稀释液 | 国家诊断公司 | EC-833 | 作为试剂盒的一部分 |
| 尿素凝胶缓冲液 | 国家诊断公司 | EC-833 | 作为试剂盒的一部分 |
| 10x TBE | 国家诊断公司 | EC-833 | 作为试剂盒的一部分 |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′，N′- 四甲基乙二胺（TMED） | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl₂2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | 赛默飞世尔科技 | AM2694 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | 赛默飞世尔科技 | EN0541 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| 二甲苯青 | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| <强>仪器与耗材 | |||
| 短玻璃板（20-40 cm 宽 × 40 cm 长） | The Gel Company | ||
| 长玻璃板（20-40 厘米 宽 x 40 厘米 长） | The Gel Company | ||
| 垂直电泳装置 | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL一次性注射器 | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| 不锈钢文件夹夹 | 艾迪科学 | 1066 | |
| 磷屏检测 | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| 塑料封口膜 | （当地杂货店） |
参考文献
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guid....
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重印与许可
