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方法文章

一个 体外 检测tRNA-异戊烯基转移酶活性的实验方法

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DOI：

10.3791/58100

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2018年10月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Genome Sciences, University of Washington, 3Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种对酵母RNA修饰酶Mod5进行生化表征的实验方案，并讨论了该方案如何应用于其他RNA修饰酶的研究。

摘要

N6-异戊烯基腺苷RNA修饰在原核生物和真核生物中具有多种功能且高度保守。其中一种高度保守的N6-异戊烯基腺苷修饰发生在部分tRNA的A37位点。该修饰通过增强tRNA与核糖体的亲和力，提高翻译效率和保真度。在真核生物中，负责该修饰的酶若发生突变，与多种疾病状态相关，包括线粒体功能障碍和癌症。因此，了解这些酶的底物特异性和生化活性，对于理解正常和病理状态下的真核生物生物学至关重要。已有多种方法被用于表征i6A修饰。本文描述了一种直接检测Mod5介导异戊烯基化的方法。该方法利用重组异戊烯基转移酶与RNA孵育，随后进行RNase T1消化，并通过一维凝胶电泳分析检测i6A修饰。此外，还讨论了该方案在表征其他RNA修饰酶方面的潜在适用性。

引言

已鉴定出至少163种不同的转录后RNA修饰，这些修饰赋予RNA多种且依赖于具体环境的功能，直接影响RNA的结构，并调控RNA与其他分子的相互作用1,2。随着对RNA修饰种类和数量的认识不断加深，开发能够可靠检测RNA修饰及其催化酶的分析方法变得至关重要。

最早被发现的RNA修饰之一发生在tRNA的第37位碱基，该位置位于反密码子3'端的相邻处3,4。异戊烯基从二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）转移到腺苷37的N6位（i6A37）3,5，该修饰存在于部分细胞质和线粒体tRNA中。i6A37通过增强tRNA与核糖体的亲和力，提高翻译的保真度和效率4,6，并且i6A37在细菌的应激反应中具有重要作用7。执行该修饰的酶被称为tRNA异戊烯基转移酶，在细菌8,9、真菌10、线虫11、植物12和高等真核生物13（包括人类14）中高度保守。

人类tRNA异戊烯基转移酶基因TRIT1的突变与人类疾病相关。例如，TRIT1基因的突变与一种严重的线粒体疾病相关，该疾病可能由线粒体蛋白质合成缺陷引起15,16。此外，TRIT1被描述为一种肿瘤抑制基因17,18，并涉及多种癌症，包括黑色素瘤19、乳腺癌20、胃癌21和肺癌22,23。最后，TRIT1和Mod5（Saccharomyces cerevisiae）异戊烯基转移酶是易于聚集的蛋白质，可形成类朊病毒淀粉样纤维24,25,26。这些发现可能提示tRNA异戊烯基转移酶与神经退行性疾病有关，但目前尚未有直接证据支持这一观点。

鉴于异戊烯基转移酶在翻译过程和疾病中的作用，能够直接测量i6A 异戊烯基转移酶活性对于在正常和疾病状态下深入理解这些酶的作用机制至关重要。目前已有越来越多的方法可用于检测 i6RNA 修饰，包括 体外 异戊烯化检测，i缺失情况下的阳性杂交6A（PHA6）检测、薄层色谱法（TLC）、氨基酸接纳活性检测以及质谱分析方法（详见参考文献） 4).

一个 体外 异戊烯基化实验已有所描述，该实验利用 14C-DMAPP 和未标记的 tRNA。在此实验中，放射性碳从 14通过异戊烯基转移酶催化C-DMAPP反应。尽管该检测方法具有高度灵敏性，但通常难以确定被修饰的具体残基9,20,27PHA6 测定依赖于体积较大的 i6一种干扰杂交的修饰 32P标记的探针覆盖修饰位点。因此，在不存在i的情况下，杂交信号更强6一种改良方法18,28,29PHA6 检测具有高灵敏度，能够分析从细胞裂解物中提取的总 RNA。此外，通过设计针对目标 RNA 的特异性探针，该方法具备较强的目标灵活性。然而，PHA6 检测仅限于表征探针靶向区域内残基发生的修饰，因此较难识别新的修饰位点。另外，由于结合缺失提示存在修饰，其他影响 RNA 结合的修饰或突变将干扰数据分析。

另一种方法结合了苄基二乙氨基乙基（BD）纤维素层析与氨基酸接受活性，以后者作为检测指标6tRNA 的修饰30该方法可直接检测i的功能6一种改良方法，但它是检测 i 的间接途径6一种修饰，且缺乏将修饰定位到 RNA 中特定残基的分辨率。已采用薄层色谱法（TLC）检测总的 tRNA i6A修饰。在此方法中，内部 32P标记的tRNA被消化为单核苷酸，随后通过二维薄层色谱分析鉴定异戊烯化修饰。该方法在检测总i6在给定的RNA样本中，尽管存在特定修饰，但在消化后所有序列信息均会丢失；因此，研究者无法确定哪些残基发生了修饰31.

最近，已开发出液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），可对不同物种、细胞类型及实验条件下总RNA修饰进行定量比较32,33,34。该方法的局限性在于，难以确定修饰核苷所来源的RNA分子中的具体修饰类型及其位置34。此外，实施此类实验所需的专业知识和仪器设备也限制了该方法的实用性。

此外，已开发出多种新一代测序技术，用于在转录组范围内定位RNA修饰34。利用针对特定修饰的抗体对RNA进行免疫沉淀（RIP-Seq），可使研究人员鉴定出所有含有该特定修饰的序列35,36。另外，基于逆转录酶的方法，如Chem-Seq和非随机错配测序，则依赖于在修饰位点处逆转录反应受到的干扰37,38,39。尽管这些技术具有在转录组范围内定位RNA修饰的优势，但RIP-Seq和Chem-Seq技术分别受限于缺乏针对每种特定修饰的可靠抗体或反应性化学试剂34。此外，执行Chem-Seq和非随机错配测序所需的逆转录酶可能受到稳定RNA二级结构的阻碍。由于tRNA具有高度修饰性和结构稳定性，使用这些技术对其进行分析尤为困难。迄今为止，尚无基于新一代测序的技术被用于定位i6A修饰34。

在此，我们介绍一种简单直接的检测i的方法6tRNA 修饰 体外该方法利用RNA与重组蛋白的孵育 S. cerevisiae 异戊烯基转移酶（Mod5），随后进行RNase T1消化及一维凝胶电泳分析以定位i6A修饰。该方法直接且分析数据所需的专业技术较少。此外，该方法可适用于其他RNA修饰酶，包括那些共价改变RNA分子量或改变RNA在凝胶中迁移能力的酶。

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方案

注意：本方案改编自参考文献24。

1. 获取目的 RNA 和酶

  1. 使用 体外 转录的RNA内部标记有 32P，以及在体内表达并纯化的重组His6-Mod5 E. coli，如先前所述24.
    1. 介绍 体外 转录RNA（第3节），使用T7 RNA聚合酶，在未标记的ATP、UTP、CTP、GTP和10 µCi经凝胶纯化、乙醇沉淀的α-ATP存在下进行，将产物重悬于1x TE（10 mM Tris-HCl pH 7.5，0.1 mM EDTA）中，于-80 °C保存24.
  2. 或者，获取 commercially available 荧光标记的RNA。在任何首选表达系统中表达目标酶。
    注意：RNA 内部的荧光标签可能改变 RNA 的结构以及酶对 RNA 的识别。

2. 制备20%变性聚丙烯酰胺凝胶

注意：为了获得足够的RNA片段分辨率，建议使用40 cm长的垂直板状凝胶。凝胶的宽度取决于待分析样品的数量。

  1. 彻底清洁玻璃板。首先用肥皂和水清洗，再用去离子水充分冲洗，最后用异丙醇和无绒布擦拭清洁。
  2. 组装玻璃板和间隔片。
  3. 混合以下试剂以配制 100 mL 的 20% 丙烯酰胺、7.5 M 尿素、1× TBE 凝胶：80 mL 尿素凝胶浓缩液（含 237.5 g/L 丙烯酰胺、12.5 g/L 亚甲基双丙烯酰胺、7.5 M 尿素的去离子水溶液），10 mL 尿素凝胶稀释液（7.5 M 尿素的去离子水溶液），以及 10 mL 尿素凝胶缓冲液（0.89 M Tris-硼酸-20 mM EDTA 缓冲液，pH 8.3，含 7.5 M 尿素）。
    注意：凝胶溶液的体积必须根据凝胶的尺寸进行调整。
  4. 加入 40 µL N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和 800 µL 新鲜配制的 10% 过硫酸铵（APS）。
  5. 用大号注射器吸取凝胶溶液，并注入玻璃板之间。倾注时用手指轻敲玻璃板，以防止气泡形成。
  6. 让凝胶静置固化 30 分钟。
  7. 使用长尾夹将已固化的凝胶固定在垂直电泳装置上。
  8. 向上下缓冲液室中加入 1× TBE 缓冲液。
  9. 在上样前两小时，以 20 mA 电流预电泳 2 小时，使缓冲液界面迁移速度超过最小的寡核苷酸；否则，最小的核苷酸和寡核苷酸容易在缓冲液前沿处压缩变形。

3. RNA 异戊烯基化检测

  1. 在最终体积为 17 µL 的反应体系中配制反应液，其中包含 58 mM Tris-HCl（pH 7.2）、1.2 mM ATP、5.8 mM MgCl2、0.2 mM DMAPP、10 U 核糖核酸酶抑制剂（例如，SuperRNaseIn）、40,000 CPM 的内部32P 标记 RNA、5.3 µM Mod5 以及 1.2 mM 2-巯基乙醇。
  2. 在 37 °C 下孵育反应液 1 小时。
  3. 使用 2.5 倍体积（42.5 µL）的 100% 乙醇和 1/10 倍体积（1.7 µL）的 3.5 M 乙酸钠（pH 5.5）对 RNA 进行乙醇沉淀，并在 -20 °C 下放置 1 小时或过夜。
  4. 在 4 °C、15,400 x g 条件下离心 RNA 样品 20 分钟。
  5. 小心移除上清液，并用 500 µL 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。
  6. 在 15,400 x g、4°C 条件下离心样品 5 分钟。
  7. 小心移除上清液，并将 RNA 沉淀在空气中干燥 15 分钟，或直至所有乙醇完全挥发。
  8. 将 RNA 沉淀重悬于 10 µL 的 8 M 尿素中。
  9. 加入 150 U 的 RNase T1，并在 37 °C 下孵育过夜。
  10. 加入 2 µL 的 6x 上样缓冲液（60% 甘油，0.1% 二甲苯蓝腈）。
  11. 将每种 RNA 样品取 10 µL 加样至预先运行的 20% 聚丙烯酰胺、7.5 M 尿素凝胶上（参见实验方案第 2 节）。
    注：可额外加入放射性标记的 RNA 分子量标准作为迁移率参照。
  12. 在 25 mA 条件下电泳 2 小时。
  13. 停止电泳，将凝胶从装置中取出。
  14. 分开两块玻璃板之间的密封，取下其中一块玻璃板，使凝胶保留在"底部"玻璃板上。
    注：此步骤中需注意避免撕裂凝胶。
  15. 在凝胶上覆盖一层塑料保鲜膜，然后在磷屏上曝光 3 小时。或者，也可将凝胶置于层析滤纸上，使用凝胶干燥仪干燥后再进行磷屏曝光。
  16. 使用磷成像仪对磷屏进行成像。

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结果

Mod5 在有或无 DMAPP 的条件下与酪氨酸 tRNA 或丝氨酸 tRNA 共同孵育。修饰反应完成后，产物经 RNase T1 消化，该酶可切割所有鸟苷酸的 3' 端，生成 3' 鸟苷单磷酸（GMP）24 (图1）。RNA 的完全消化会产生可预测的放射性标记片段模式（图2A），随后在20%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。DMAPP向RNA转移异戊烯基会导致含有修饰位点的片段发生迁移率偏移。图1).

该方案可可靠地检测由Mod5介导修饰的经典与非经典tRNA残基的异戊烯化修饰24例如，Mod5 被预测可修饰一组含有先前描述的 AAA 的 tRNA<...

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讨论

RNA修饰被不断证实其在细胞及生物体功能中发挥着日益重要且多样化的作用。因此，开发用于研究RNA修饰酶的检测方法对于深入理解生物学基本机制至关重要。本方案描述了一种高分辨率的 体外 表征Mod5 tRNA修饰活性的检测方法。

该方案具有显著优势，可直接且易于解读地检测异戊烯基化。所描述的方案可用于对异戊烯基转移酶进行可靠的生化表征。此外，该系统可与酶突变体或修饰的RNA底物联用，从而直接确定特定残基或结构域在修饰过程中的作用。为进一步提高分辨率，该方案可轻松扩展，加入其他核糖核酸酶（如RNase P1和/或RNase A）的平行消化步骤，分别切割所有四种核苷酸或特异性切割C和U位点。

该检测方法的一个局限性在于其通量相对较低，因此可实际分析的RNA数量少于RNA测序和质谱分析方法34。因此，不建议将本方案用于旨在全转录组范围内鉴定RNA修饰位点的研究者。本方案最适合那些希望研究特定RNA修饰酶对特定目标RNA作用的研究人员。然而，许多用于全转录组范围鉴定RNA修...

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致谢

我们感谢 David Engelke 博士对本文手稿提供的指导和有益的建议。PJS - Ball State 大学实验室启动资金；DAB - 项目编号 1R15AI130950-01。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
尿素凝胶浓缩液国家诊断公司EC-833作为试剂盒的一部分
尿素凝胶稀释液国家诊断公司EC-833作为试剂盒的一部分
尿素凝胶缓冲液国家诊断公司EC-833作为试剂盒的一部分
10x TBE国家诊断公司EC-833作为试剂盒的一部分
过硫酸铵（APS）Sigma-Aldrich7727-54-0
N,N,N′，N′- 四甲基乙二胺（TMED）Sigma-AldrichT9281
Tris 碱Sigma-AldrichT1503
硼酸Sigma-Aldrich10043-35-3
EDTASigma-Aldrich60-00-4
ATPSigma-Aldrich34369-07-8
MgCl₂2Sigma-Aldrich7786-30-3
DMAPPCaymen Chemical1186-30-7
Super RNaseIN赛默飞世尔科技AM2694
2-巯基乙醇Sigma-Aldrich60-24-2
乙醇Sigma-Aldrich64-17-5
乙酸钠Sigma-Aldrich127-09-3
Rnase T1赛默飞世尔科技EN0541
甘油Sigma-Aldrich56-81-5
二甲苯青Sigma-Aldrich2650-17-1
<强>仪器与耗材
短玻璃板（20-40 cm 宽 × 40 cm 长）The Gel Company
长玻璃板（20-40 厘米 宽 x 40 厘米 长）The Gel Company
垂直电泳装置The Gel CompanyS2-3040
50 mL一次性注射器Fisher Scientific03-377-26
不锈钢文件夹夹艾迪科学1066
磷屏检测Sigma-Aldrich28-9564-74
塑料封口膜（当地杂货店）

参考文献

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