评估感染寨卡病毒的Ifnar1-/-小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞应答

摘要

本文描述了一种用于评估Zika病毒（ZIKV）感染的Ifnar1^-/-小鼠模型中免疫豁免器官内抗原特异性T细胞反应的实验方案。该方法对于研究ZIKV疫苗的细胞保护机制和免疫病理发生机制至关重要，同时也可用于评估疫苗的有效性。

摘要

寨卡病毒（ZIKV）可诱导免疫豁免器官中的炎症反应例如，大脑和睾丸），导致吉兰-巴雷综合征并损害睾丸组织。在寨卡病毒感染过程中，已发现免疫细胞会浸润至这些组织中。然而，寨卡病毒感染期间，这些免疫细胞在免疫保护和/或免疫病理发生中的细胞学机制仍 largely 未知。本文中，我们描述了评估寨卡病毒感染小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞功能的方法。这些方法包括：a）在Ifnar1^-/- 小鼠；b) 组织病理学、免疫荧光和免疫组织化学检测，用于检测脑、睾丸和脾脏中的病毒感染与炎症；c) 基于寨卡病毒（ZIKV）来源的T细胞表位四聚体的制备；d) 检测从脑、睾丸和脾脏中分离的单核细胞内ZIKV特异性T细胞。利用这些方法，可检测浸润至免疫豁免器官的抗原特异性T细胞，并评估这些T细胞在感染过程中的功能：潜在的免疫保护作用 通过 病毒清除和/或免疫病理发生以加剧炎症。这些发现可能有助于阐明针对寨卡病毒（ZIKV）免疫接种所诱导的T细胞的作用。

引言

寨卡病毒（ZIKV）是一种通过蚊子传播的黄病毒，于1947年在乌干达首次从一只发热的恒河猴体内分离得到。近年来，由于ZIKV在美洲地区的迅速传播及其与小头症和吉兰-巴雷综合征之间出乎意料的关联，该病毒已成为一项公共卫生紧急事件^1,2,3。根据流行病学数据，估计每约4,000名感染的成年人中就有1人疑似因ZIKV感染而引发吉兰-巴雷综合征⁴。此外，在小鼠模型中已证实ZIKV与睾丸感染/损伤之间存在相关性，表明在某些情况下，ZIKV感染可突破血睾屏障，最终导致男性不育⁵。这些发现凸显了全面了解ZIKV感染过程中保护性或病理性免疫反应诱导机制的重要性。

关于寨卡病毒（ZIKV）的细胞免疫应答，仍有许多未知之处。在感染ZIKV的猴子和人类中，已观察到针对衣壳蛋白、包膜蛋白以及非结构蛋白1（NS1）的CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答^6,7,8。在小鼠模型中，多项研究表明CD8⁺ T细胞在控制ZIKV复制方面发挥保护作用^9,10,11。重要的是，Jurado et al. 研究表明，ZIKV感染会导致血脑屏障破坏，并在Ifnar1^-/-小鼠睾丸中引起CD8⁺效应T细胞的血管周围浸润。此外，他们发现CD8⁺ T细胞可引发ZIKV相关的瘫痪症状，并可能参与新生儿脑部免疫病理过程。在之前的研究中，我们制备了ZIKV-E_294-302四聚体，并证实ZIKV特异性的CD8⁺ T细胞存在于感染ZIKV的Ifnar1^-/-小鼠的脑组织和脊髓中，这一发现可能对ZIKV疫苗的设计与开发具有重要意义¹⁰。

为应对预防寨卡病毒（ZIKV）感染的紧急疫苗需求，目前已有多种疫苗处于临床前研发阶段，包括RNA疫苗、重组载体疫苗以及纯化蛋白亚单位疫苗。其中质粒DNA疫苗已进入I期临床试验¹²。因此，评估ZIKV疫苗的安全性和有效性至关重要。这类疫苗的一个优势在于能够诱导特异性T细胞应答，这可能对抵抗ZIKV感染具有重要意义。通过使用源自ZIKV的T细胞表位相关四聚体，可在接种腺病毒载体ZIKV疫苗的小鼠中检测到疫苗诱导的T细胞免疫反应，研究结果表明M和E糖蛋白均能诱导强烈的抗原特异性CD8⁺ T细胞免疫反应¹³。

病毒感染期间，T细胞受体（TCR）识别主要组织相容性复合物（MHC）分子呈递的肽类抗原，是T细胞介导的宿主保护机制中的重要环节¹⁴。基于这一理论，四聚体技术是一种独特的工具，可用于阐明抗原特异性T细胞在调控免疫应答中的作用¹⁵。本方案描述了建立ZIKV感染的Ifnar1^-/-小鼠模型，并利用四聚体技术检测小鼠脾脏、脑组织和睾丸中反应性T细胞的方法。此外，我们使用ZIKV-E_294-302四聚体检测并评估ZIKV疫苗（AdC7-M/E）在免疫小鼠中诱导的T细胞免疫反应性。本研究为探究免疫豁免器官中的T细胞应答提供了指导，并为胎盘或胎儿脑组织中的潜在应用提供了参考。

方案

动物实验已获得中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所机构动物护理和使用委员会的批准。所有实验均按照该机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案进行。

1. 病毒感染

1. 保持成年（6 8周龄的 Ifnar1^-/- 在标准的无特定病原体（SPF）条件下饲养（50%雄性和50%雌性）的小鼠，并给予其正常的食物和水。
2. 感染 Ifnar1-/- 小鼠^-/- 感染寨卡病毒（ZIKV）的小鼠 通过 100 的眶后接种 µL of ZIKV 在含有 1 x 10 的磷酸盐缓冲液（PBS）中⁴ 病毒的蚀斑形成单位（FFUs）。同样，给予对照小鼠等体积的PBS。
   警告：应在ABSL2条件下感染小鼠，并在生物安全柜中对感染病毒的小鼠进行这些操作。
3. 每天监测小鼠的体重和临床症状（震颤、步态不稳、双侧弛缓性后肢麻痹）持续15天。

2. 使用ZIKV疫苗进行免疫接种

1. 使用 Ifnar1-/- 小鼠^-/- （50% 雄性和 50% 雌性）6 至 8 周龄小鼠。将小鼠饲养在标准 SPF 条件下，温度为 18–29 °C，12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水。
2. 免疫 Ifnar1-/- 小鼠^-/- 用ZIKV疫苗免疫小鼠：注射100 µAdC7-M/E 的 L [4 x 10¹⁰ （病毒颗粒）在PBS缓冲液中 通过 使用1 mL注射器和23号针头进行肌内注射（i.m.途径）。
3. 同样，向对照小鼠注射等体积的PBS。

3. 从脾脏中分离单核细胞

注意：脾脏单核细胞的分离方法如先前所述¹⁶。

1. 在接种后第7天，使用5%异氟烷与100%氧气（流速为1 L/min）对已免疫并感染寨卡病毒（ZIKV）的小鼠进行麻醉。通过颈椎脱位法处死小鼠，随后立即将整只小鼠浸入75%乙醇中。
   注意：从本步骤开始，所有实验操作均应在生物安全柜中以无菌方式执行。
2. 使用针头将已处死（先前已感染/免疫）的小鼠四肢固定在泡沫板上，腹部朝上。
3. 用无菌手术刀沿腹中线切开皮肤至胸腔，用剪刀剪开腹肌，暴露腹腔，并轻轻移除肝脏。
   注：位于胃左侧的长条状深红色器官为脾脏。
4. 取出脾脏，用PBS冲洗3次以去除血液，然后将其置于1.5 mL冰上预冷的罗斯韦尔·帕克纪念研究所培养基（RPMI）中。保持脾脏处于冰上。
5. 为制备脾脏单细胞悬液，将器官置于置于50 mL离心管上方的无菌40 µm孔径细胞筛网上，并加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）的冰上预冷RPMI培养基。使用5 mL注射器的推杆机械性研磨器官，并持续添加培养基，直至器官完全通过筛网。
6. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在4 °C条件下以600 × g离心5分钟，弃去上清液。
7. 用5 mL红细胞裂解缓冲液（NH₄Cl、Na₂EDTA 和 KHCO₃；见材料表）重悬细胞，室温孵育裂解反应5–6分钟。
8. 加入10 mL冰上预冷的RPMI/FBS培养基终止红细胞裂解，在4 °C条件下以600 × g离心5分钟，弃去上清液。
9. 用10 mL完全RPMI培养基（含10% vol/vol FBS和100 U/mL青霉素-链霉素的RPMI）重悬细胞。取10 µL细胞悬液转移至小离心管中，与10 µL 0.4% wt/vol台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数细胞数量。

4. 从脑和睾丸中分离单核细胞

1. 用5%异氟烷（在100%氧气中，流速为1 L/min）对感染ZIKV的雄性小鼠进行麻醉，接种后第7天实施安乐死。通过颈椎脱位处死小鼠，随后立即将整只小鼠浸入75%乙醇中。
   注意：从本步骤开始，所有实验操作均须在生物安全柜中无菌进行。脑和睾丸中单核细胞的分离步骤如前所述。¹⁷.
2. 将一只（已安乐死的、先前感染过的）雄性小鼠俯卧固定在切板上。
3. 用直的1×2齿镊固定头皮，使用虹膜剪在头皮正中做一纵向切口以暴露颅骨。
4. 用尖头镊子夹住眼眶两侧并固定脑组织。将尖头虹膜剪的一侧刀尖插入 枕骨大孔 并向颅骨侧方剪开。另一侧重复此步骤。
5. 使用锋利的虹膜剪从同一腔体开始，沿中线向上朝鼻部小心剪开。尽量保持剪刀尖端接近表面，以避免损伤脑组织。
6. 用镊子提起脑组织，使用锋利的虹膜剪小心分离颅神经纤维。用镊子取出脑组织，放入含有5 mL冰冻RPMI/10% FBS培养基的15 mL离心管中。
7. 用镊子夹住腹部皮肤，使用锋利的虹膜剪沿纵轴切开皮肤和腹壁，暴露腹部最下端。将睾丸轻轻推至切口处。用镊子轻柔牵拉脂肪层，暴露两侧圆形的睾丸。
8. 使用锋利的虹膜剪仔细解剖脂肪层和附睾。用镊子将睾丸放入含有5 mL冰冻RPMI/10% FBS培养基的15 mL离心管中。
9. 为了从脑或睾丸组织制备单细胞悬液，将器官置于带有100 μm孔径的无菌细胞筛上 µ将组织置于50 mL离心管顶部的m网筛上，加入2 mL预冷的RPMI/10% FBS培养基。使用5 mL注射器的推杆碾压组织，并持续加入培养基，直至组织完全通过网筛。
10. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，于600 x g 4℃下5分钟 °C. 移除上清液。
11. 用5 mL 30%密度梯度介质重悬细胞，然后缓慢将其加入含有2 mL 70%密度梯度介质的15 mL离心管中。
12. 关闭刹车并以4离心试管 °C 在 800 × 下 g 孵育30分钟。从中间层收集淋巴细胞。
13. 将中间层转移至新的15 mL离心管中，加入10 mL冷的RPMI/10% FBS培养基，于300 x g 4℃下离心10分钟 °C. 移除上清液。
14. 用 10 mL 冰冷的 RPMI/FBS 培养基重悬细胞，并在 600 x g 4℃下5分钟 °C. 去除上清液。
15. 用10 mL完全RPMI培养基重悬细胞，并按照步骤3.9计数细胞数量。

5. 四聚体的制备

1. 构建表达 H-2D 胞外域的质粒^b C末端带有生物素化位点标签的 α3 个结构域和 β₂使用带有 NdeI 和 XohI 限制性酶切位点的 pET28a 载体¹⁸.
2. 表达并制备H-2D包涵体^b 和 β₂如先前所述²⁰.
3. 复性并纯化MHC/肽复合物H-2D^b-_294-302.
   1. 配制200 mL复性溶液［100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、400 mM L-精氨酸、2 mM EDTA-Na、5 mM GSG和0.5 mM GSSG］。加入蛋白酶抑制剂：2 mL苯甲基磺酰氟（PMSF，储存液100 mM）、100 µL 浓缩液（2 mg/mL），以及 100 µ亮抑蛋白酶肽（抑肽酶）L（储存液 2 mg/mL）。将缓冲液在 4℃ 冷却 °30 分钟，4 °C
   2. 加入 H-2D^b, β₂m，并将肽加入复性溶液中。
      1. 注射 500 µL of β₂m 溶解于胍溶液（30 mg/mL 储存液）中，使用注射器。操作时，采用23 G针头与5 mL注射器，将 β₂m 逐滴加入复性溶液中。在 4 °C 下以 150 rpm 的速度持续缓慢搅拌溶液。 °C.
      2. 之后 β₂m 溶解于复性溶液后，重新溶解 2 mg 的 E_294-302 200 中的肽 µL 的 DMSO，并使用移液器迅速将其注入复性溶液中。在 4 ℃ 下以 150 rpm 的速度缓慢搅拌溶液。 °15 分钟，4 °C
      3. 注射1.5 mL H-2D^b 溶解于胍溶液中。保持搅拌子以150 rpm旋转，以促进H-2D的复性。^b 4 ℃时 °C 培养 8–10 小时。
         注意：将溶液置于冷藏室中的密闭盒内。
   3. 在加压室中使用10 kDa膜浓缩复性后的蛋白。将缓冲液[20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，50 mM NaCl]置换至加压室中，并浓缩至终体积为30–50 mL。
   4. 将复性溶液转移至离心管中，在2,500 x g 4℃下孵育15分钟 °C.
   5. 小心将上清液转移至10 kDa离心过滤器中，并进一步浓缩至终体积为500 µL 在 2,500 × 下 g 30分钟
   6. 将上清液转移至新离心管中，在12,000 x g 15分钟。使用S200 10/300 GL凝胶过滤层析纯化蛋白。
   7. 收集MHC复合物峰，并浓缩至终体积为350 µL.
4. 要生成一个500-µL 反应体系中进行生物素标记时，按以下顺序加入试剂：100 µL 溶液 A [0.5 M bicine (pH 8.3)]，100 µL 溶液 B（100 mM ATP，100 mM MgOAc，200 µΜ 生物素），100 µL 的额外 d-生物素（500 µΜ 生物素），20 µL BirA酶（60 µ克），0.5 µL 泡沫抑素（2 mg/mL），以及 0.5 µL 亮抑蛋白酶肽（2 mg/mL）。4℃下将反应管孵育过夜 °C.
   警告：切勿向生物素化反应中添加任何EDTA。
5. 使用 S200 10/300 GL 凝胶过滤柱纯化 MHC，以去除多余的生物素。
6. 利用链霉亲和素迁移实验测定生物素化效率¹⁸.
   1. 在冰上孵育样品A、B和C三个样品30分钟，然后通过10% SDS-PAGE分析结果。样品A包含8 µL 生物素标记的 MHC 分子和 2 µ交换缓冲液 L，样品 B 8 µL 生物素化 MHC 分子和 2 µL 链霉亲和素（20 mg/mL），以及样品 C 的 2 µL链霉亲和素（20 mg/mL）和8 µL 洗脱缓冲液。
      注意：切勿煮沸样本。
7. 形成生物素化MHC分子的多聚体。
   1. 通过混合生物素标记的E蛋白_294-302 肽-H₂D^b 以1:5的摩尔比与藻红蛋白标记的链霉亲和素形成复合物，以确保所有生物素化的MHC分子完全结合。
   2. 计算四聚化反应所需的链霉亲和素-偶联物用量。
      1. 根据蛋白质浓度和摩尔质量确定MHC/肽复合物的摩尔数（示例：1.8 mg总蛋白 = 40 nmol）。
      2. 通过将MHC/肽的摩尔数除以5来计算所需链霉亲和素偶联物的摩尔数（示例：40/5 = 8 nmol链霉亲和素偶联物）。
      3. 计算所需链霉亲和素的量（以 µg）根据链霉亲和素偶联物而定（例如：链霉亲和素-PE [300,000 g/M]） → 8 nmol 需要 = 2,400 g。
   3. 将链霉亲和素-藻红蛋白分为10份样品，每份加入含有生物素化E的离心管中_294-302 肽-H₂D^b 复合物，间隔20分钟。加载最后一个样品后，将反应管在4℃孵育 °4°C 避光孵育过夜。
8. 将多聚化试剂加入100 kDa超滤离心管中，通过2,000 x g离心浓缩 g 4 ℃时 °C 至一体积 <100 µL.
9. 用 PBS（pH 8.0）将旋涡管中的样品稀释至 4 mL，再次浓缩 <100 µL.
10. 用 PBS（pH 8.0）重复缓冲液置换步骤 4 次。
11. 再次加水至总体积500 µL 用 PBS（pH 8.0）进行浓缩，将样品浓缩至浓度约为 2–2.5 mg/mL，离心力为 2,000 x g 4 ℃时 °C. 将样品避光保存于 4 °C.

6. 流式细胞术

1. 将细胞悬液（来自步骤 3.9 和/或步骤 4.15）在 4 °C 下孵育 °C 与 0.1 µ每20 L加入抗小鼠CD16/CD32 Fc受体阻断试剂 µL（稀释因子1:200）孵育10分钟，以防止非特异性结合。
2. 将四聚体管在20,000 x g下离心 g 在 4 ℃ 下至少孵育 15 分钟 °C.
3. 加入20 µ将 1 × 10⁵ 个细胞悬液加入至 96 孔板中⁶ 每孔细胞数
4. 准备足量的 E_294-302 四聚体混合物用于染色所有实验管。为避免移液误差，配制时总体积需额外增加15%。将E_294-302 四聚体（2 mg/mL，1 µL/test) 于FACS缓冲液（PBS，0.5% FBS）中，使20 µE蛋白的L区域_294-302 将四聚体混合物加入每个检测样本中。
5. 加入20 µE蛋白的L区域_294-302 将四聚体混合物加入96孔板中。此步骤结束时，每个孔中的终体积应为40 µL. 将培养板在室温下避光孵育 30 分钟。
6. 加入一抗（FITC偶联或APC偶联的抗-CD3抗体（0.2 mg/mL）、PerCP偶联的抗-CD8抗体（0.2 mg/mL）），于1 µL/test 加入细胞悬液中，然后在 4 ℃ 下孵育 °室温避光孵育30分钟。
7. 用 2 mL FACS 缓冲液洗涤细胞 2 次，每次洗涤后以 600 × g 离心 g 5 分钟。小心吸除上清液，并用 200 µL FACS缓冲液
8. 将样品暂时储存在 4 °避光保存直至进行流式细胞术分析。
9. 采用以下设门策略进行流式细胞术分析。
   1. 在前向散射（FSC）对角聚集的单细胞群上创建门控 与 侧向散射（SSC）面积。
   2. 然后，圈选 CD3⁺ 通过侧向散射（SSC）识别细胞 与 CD3；接着对CD3设门⁺ CD8⁺ 细胞；最后，概述 CD8⁺ 四聚体⁺ 细胞¹⁹.

7. 组织病理学、免疫荧光和免疫组织化学检测

1. 组织病理学检测
   1. 在接种寨卡病毒（ZIKV）后第7天，采集感染ZIKV的Ifnar1^-/-小鼠的脑和睾丸组织，并用4%中性缓冲甲醛固定。
      警告：多聚甲醛具有毒性，请穿戴适当的个人防护装备。
   2. 将组织包埋于石蜡中。
   3. 使用振动切片机以5 mm厚度对组织进行切片。
   4. 用苏木精和伊红（H&E）对组织染色。
2. 免疫组织化学检测
   1. 根据先前描述的方法²¹对组织切片进行脱蜡、复水及抗原修复。
   2. 用含3% H₂O₂的PBS（pH 7.6）处理组织切片，室温孵育10分钟，随后用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭10分钟。
   3. 将组织切片与大鼠抗小鼠CD3抗体（稀释比例：1/1,000）在室温下孵育8小时，然后于4 °C过夜孵育。
   4. 用PBS冲洗组织，随后加入3滴生物素标记的二抗（稀释比例：1/1,000），室温孵育2小时，再加入3滴亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（稀释比例：1/200），室温孵育30分钟。
   5. 按照先前所述方法²²，使用3滴3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（稀释比例：1/1,000）显色。
   6. 用Mayer氏苏木精对组织切片进行复染。
3. 免疫荧光检测
   1. 将冷冻睾丸切片（6 mm）在室温下空气中干燥10分钟。
   2. 用预冷的丙酮固定10分钟。
   3. 用PBS洗涤切片3次，并在37 °C下用封闭缓冲液（1% BSA、0.3% Triton、1× PBS）封闭30分钟。
   4. 将组织切片与Z6一抗（20 µg/mL）在4 °C下过夜孵育。
   5. 用PBS冲洗组织，然后加入二抗（稀释比例：1/200），在37 °C孵育1小时。
   6. 用PBS洗涤组织切片，并按照制造商说明使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（稀释比例：1/1,000）对细胞核进行复染。

结果

通过这些方法，我们建立了一种寨卡病毒（ZIKV）感染的小鼠模型。将6至8周龄的Ifnar1^-/-小鼠通过眶后注射接种1 × 10⁴ 焦点形成单位（FFU）的ZIKV。感染ZIKV后，Ifnar1^-/-小鼠表现出明显的病理症状和体征（图1A），以及体重变化（图1B）。小鼠脑组织出现明显水肿和充血（图1C），同时睾丸逐渐萎缩（图1D）。此外，在脑和睾丸组织中均观察到明显的病理改变和组织破坏（图2A）。我们通过免疫荧光检测法在脑和睾丸组织中检测到ZIKV的存在（图2B）。免疫染色显示脑和睾丸组织中存在高水平的病毒载量（图2B）。免疫组织化学结果显示，感染ZIKV后小鼠脑组织中有大量CD3⁺ T细胞浸润（图2C）。

为检测和评估寨卡病毒（ZIKV）特异性T细胞反应，我们制备了小鼠MHC-I H-2D^b-E_294-302 四聚体。肽段E_294-302可促进H-2D^b正确复性，并获得大量可溶性MHC-I分子（图3A）。在迁移实验中，可观察到生物素标记效率较高（图3B）。随后，制备了三种链霉亲和素荧光标记（APC、PE和BV421）的pMHC-I四聚体，用于检测ZIKV特异性T细胞（图3C）。与APC和BV421标记的四聚体相比，PE标记的四聚体检测特异性CD8⁺ T细胞的效率更高，但差异无统计学意义。

使用 E_294-302 四聚体，我们通过流式细胞术在感染寨卡病毒（ZIKV）后第7天的小鼠脾脏中检测到ZIKV特异性T淋巴细胞（3.49 ± 0.45%）。此外，与本方案第3节所述方法类似，在接种AdC7-M/E疫苗4周后，也在脾脏中检测到ZIKV特异性T淋巴细胞（6.89 ± 1.36%）（图4）。

此外，我们检测了寨卡病毒（ZIKV）感染后浸润到免疫豁免器官（如脑和睾丸）中的淋巴细胞。通过设门选择脑和睾丸总淋巴细胞中的CD3⁺CD8⁺ T细胞。在脑（占CD3⁺CD8⁺ T细胞的42.2%）和睾丸（占CD3⁺CD8⁺ T细胞的26.4%）的淋巴细胞中，均可检测到较高比例的E_294-302四聚体特异性T细胞（图5）。

图 1：Ifnar1^-/- 小鼠中寨卡病毒（ZIKV）感染的表征。 6–8 周龄的 Ifnar1^-/- 小鼠通过眶后注射接种 10⁴ 焦点形成单位（FFU）的 ZIKV，以注射 PBS 的小鼠作为未感染对照组。监测了感染后 Ifnar1^-/- 小鼠的（A）形态学变化和（B）体重变化。红色箭头指示感染后 Ifnar1^-/- 小鼠出现脊髓麻痹和运动性轻瘫。在接种后第 7 天采集（C）脑组织，以及在接种后第 0、7、14 和 30 天采集（D）睾丸组织。图中展示了来自小鼠的脑和睾丸的代表性图像，并附有标尺以指示大小。误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。每组每项实验使用 n = 10 只小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：在ZIKV感染的Ifnar1^-/-小鼠脑组织和睾丸组织中检测ZIKV病毒和淋巴细胞。（A）该图显示了ZIKV感染小鼠在接种后第7天（d post-inoculation）脑组织和睾丸组织的组织病理学变化，并与阴性对照组进行比较。比例尺 = 25 µm（左图）和 50 µm（右图）。（B）采用抗ZIKV Z6抗体（绿色）进行免疫荧光染色。所有组织样本均来自接种后第7天的ZIKV感染小鼠。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 50 µm。（C）免疫组织化学结果显示CD3⁺ T细胞在脑组织和睾丸组织中显著浸润。比例尺 = 25 µm（左图）和 50 µm（右图）。紫色表示苏木精染色，棕色表示CD3抗体染色。请点击此处查看该图的高清版本。

图3ZIKV特异性pMHC-I四聚体的制备 (AE的结合_294-302 H-2D^b 由一个 体外 复性。蓝色表示 H-2D^b-_294-302 蛋白。橙色代表不含肽段的阴性对照。B该图展示了 H-2D^b-_294-302 移位实验。C对照组使用PBS作为模拟处理。采用三种带有链霉亲和素荧光标记（APC、PE和BV421）的pMHC-I四聚体来检测ZIKV特异性T细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4： ZIKV感染及疫苗免疫小鼠脾脏中病毒特异性CD8⁺ T细胞的流式细胞术分析。 6-8周龄的Ifnar1^-/-小鼠分别接种10⁴个蚀斑形成单位（FFU）的ZIKV，或单剂量4 × 10¹⁰个病毒颗粒的AdC7-M/E，或PBS作为阴性对照。感染后第7天或免疫后第4周，收集小鼠脾细胞并进行流式细胞术分析。数据以均值±标准差表示。统计学分析采用单因素方差分析（无显著性：P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。

图5： 寨卡病毒（ZIKV）感染小鼠脑和睾丸中病毒特异性CD8⁺ T细胞的设门策略及代表性结果。图中展示了（A）脑组织和（B）睾丸组织中浸润淋巴细胞的代表性图谱。通过连续设门选择具有淋巴样散射特征（lymphoid-scatter⁺）且CD3⁺的细胞群，进一步对其中CD8⁺细胞设门，用于表位特异性T细胞的分析。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

免疫原性T细胞表位在针对病原体的细胞免疫中发挥重要作用²³。因此，在免疫豁免器官中检测寨卡病毒（ZIKV）特异性T细胞，是研究机体对自然ZIKV感染T细胞应答的关键方法。同时，T细胞应答检测也是评估病毒疫苗有效性的有力工具。本文展示了一套完整的实验可视化方案，包括从ZIKV感染小鼠的脾脏、脑和睾丸中分离淋巴细胞，制备免疫优势表位E_294-302四聚体，以及识别ZIKV感染小鼠免疫豁免器官中的ZIKV特异性CD8⁺ T细胞。

先前的一项研究表明，可在男性患者的精液中检测到活的寨卡病毒（ZIKV）或其RNA，这表明ZIKV能够穿越血睾屏障并在生殖系统中自我复制²⁴。此前，我们还发现ZIKV可导致小鼠睾丸损伤并引发雄性不育²⁵。ZIKV感染可在恒河猴中引起病毒血症，且可在中枢神经系统（CNS）及内脏器官中检测到病毒RNA。免疫组织化学分析显示，ZIKV特异性抗原存在于CNS及多个外周器官中²⁶。此外，在小鼠模型中，ZIKV感染可在脾脏和中枢神经系统诱导强烈的抗病毒CD8⁺ T细胞反应²⁶。

与以往的研究相比，本研究建立了在脑和睾丸等免疫豁免部位检测寨卡病毒（ZIKV）特异性CD8⁺ T细胞反应的系统性方法。评估ZIKV感染小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞的功能具有重要意义。利用四聚体技术检测免疫豁免器官中ZIKV特异性CD8⁺ T细胞反应，将极大增进我们对ZIKV感染及其宿主免疫应答的理解。通过使用E_294-302四聚体，可利用流式细胞术分离脑和睾丸中的病毒特异性T细胞，以研究ZIKV感染期间的保护作用及免疫病理机制。同时，该方法有助于研究人员进一步探究CD8⁺ T细胞在控制ZIKV感染或加剧这些器官免疫病理过程中的功能。

为了分析免疫豁免器官中抗原特异性的鼠源CD8⁺ T细胞应答，我们制备了H-2D^b-E_294-302四聚体，并通过流式细胞术检测CD8⁺ T细胞。四聚体是检测抗原特异性T细胞的有力工具。本研究中，制备了三种不同荧光染料标记的链霉亲和素（APC、PE和BV421）。尽管APC、BV421和PE标记的四聚体在检测抗原特异性T细胞方面无显著统计学差异，但PE标记的pMHC-I四聚体获得的结果最佳。因此，本研究全程采用PE标记的四聚体。有趣的是，基于PE标记的H-2D^b-E_294-302四聚体，我们在脑和睾丸中均检测到较高比例的抗原特异性T细胞，表明病毒特异性T细胞具有从血液迁移至免疫豁免器官的能力。

然而，该方案存在一些局限性。H-2D^b-E_294-302 四聚体不适用于人T细胞的检测，因为四聚体检测依赖于MHC限制性。因此，仍需筛选由HLA限制的免疫优势肽。此外，眶后感染对寨卡病毒（ZIKV）感染有效，但对某些研究人员而言可能操作不便。因此，也推荐采用其他感染途径，包括腹腔、皮下或静脉注射。

在本方案中，一个关键步骤是从脑组织和睾丸组织中分离单核细胞。获得高质量的淋巴细胞至关重要，因此需要注意离心速度、组织研磨力度以及脑和睾丸组织的解剖操作。此外，在四聚体（tetramer）制备过程中，为防止蛋白质降解，使用蛋白酶抑制剂（如PMSF、pepstatin、leupeptin）是有帮助的。因此，在四聚体的制备过程中，向复性缓冲液中添加蛋白酶抑制剂，并在过程中进行缓冲液更换，是合理的操作。

综上所述，我们介绍了在ZIKV感染的Ifnar1^-/-小鼠模型中检测抗原特异性T细胞应答的方法，该方法针对免疫豁免器官中的免疫反应。该技术平台可广泛应用于研究那些能够突破血液与免疫豁免器官之间屏障的新发和再发病毒的免疫机制。此外，本研究可能为未来候选疫苗和免疫疗法的开发奠定基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Z6	本实验室		Ma W, Li S, Ma S, 等。寨卡病毒引起小鼠睾丸损伤并导致雄性不育。Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
荧光素标记的Affinipure山羊抗人IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
兔抗山羊IgG，FITC标记	CWBIO	CW0115
FITC抗小鼠CD3	Biolegend	17A2
APC抗小鼠CD3	Biolegend	100236
PerCP抗小鼠CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	有毒且具腐蚀性的试剂。 操作时需谨慎
链霉亲和素	BD	S4762-FZ	在PBS中配制成10 mg/mL的澄清溶液， 储存于-20 °C
胃蛋白酶抑制剂	Sigma	P4265-5MG	5 mg溶于2.5 mL DMSO中，分装后储存于-20 ºC
亮抑蛋白酶肽	Sigma	L8511	5 mg溶于2.5 mL dH2O中，分装后储存于-20 ºC
多肽	Scilight-peptide		必须用DMSO重悬，并储存于-20 °C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	必须储存于4 °C
DMSO	MP	219605590	室温保存。
APC标记的链霉亲和素	BD	554067	必须在 4 °C下储存和维持。切勿冷冻。
FITC标记的链霉亲和素	BD	554060	必须在 4 °C下储存和维持。切勿冷冻。
PE标记的链霉亲和素	BD	554061	必须在 4 °C下储存和维持。切勿冷冻。
BV421标记的链霉亲和素	BD	563259	必须在 4 °C下储存和维持。切勿冷冻。
PageRuler未染色蛋白分子量标准	Thermo Fisher Scientific	26614	必须储存于4 °C
细胞滤器	BF	BF10-5040	室温保存。
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	室温保存。
超速离心机	Thermo Fisher Scientific
FACS Cantol			流式细胞仪必须配备与所用染色方案兼容的激光器和滤光片。
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
红细胞裂解液	Solarbio	R1010	储存于4 °C。