利用外照射放疗在小型动物模型中靶向选择性治疗多能干细胞来源的畸胎瘤

摘要

针对多能干细胞来源畸胎瘤的治疗策略研究对于干细胞治疗的临床转化具有重要意义。本文中，我们描述了一种实验方案：首先在小鼠体内生成干细胞来源的畸胎瘤，随后利用小型动物照射器在活体中选择性靶向并治疗这些肿瘤。

摘要

受害者数量不断增长 "干细胞旅游" 全球范围内未经规范监管的干细胞移植已引发人们对干细胞移植安全性的担忧。尽管目前临床普遍采用已分化细胞而非未分化细胞进行移植，但移植时残留的未分化干细胞或已分化细胞发生的自发突变仍可能导致畸胎瘤的形成。由于干细胞治疗常被递送至解剖学上敏感的部位，即使微小的肿瘤也可能造成严重的临床后果，导致失明、瘫痪、认知异常及心血管功能障碍。此外，这些部位的手术干预途径往往受限，使患者可选的治疗方案极为有限。因此，控制干细胞的异常行为对于干细胞治疗的临床转化至关重要。

外照射放疗是一种有效的靶向治疗手段，可在减少畸胎瘤负荷的同时，最大限度地降低对周围器官的损伤。此外，该方法避免了与基因操作或病毒转导干细胞相关的临床安全性和有效性问题。本文介绍一种在小鼠体内建立多能干细胞来源畸胎瘤并应用外照射放疗在活体中选择性消融这些肿瘤的实验方案。

引言

在过去的几十年中，干细胞疗法在组织再生领域的应用遇到了诸多障碍，阻碍了其高效地进入临床应用。这些障碍包括细胞在递送部位的滞留率低、干细胞的免疫原性以及形成畸胎瘤的肿瘤化潜能¹。致瘤性尤其令人关注，因为它可能对接受干细胞移植的患者造成伤害²。由于未受监管的干细胞注射导致肿瘤形成的病例已在多个临床环境中被报道^3,4,5。畸胎瘤形成的风险是多能干细胞（PSC）研发中最常被提及的临床问题，已导致多项备受关注的胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）临床试验被推迟或取消^6,7,8,9。因此，若此类医源性肿瘤发生，亟需开展转化研究以提供适当的治疗方案。

迄今为止，控制干细胞异常行为的大多数策略都集中在减少具有致瘤潜能的PSC数量^2,10遗憾的是，仅有少量残留细胞（例如.，1 × 10⁴ 至 1 × 10⁵ 细胞¹¹) 是畸胎瘤形成所必需的，这一浓度远低于目前现有检测方法的检测限^12,13使用这些预分离方法的其他局限性包括效率低、成本高，依赖于单细胞悬液，这可能不适用于较新的组织工程方法，以及可能损害细胞存活和移植效果。

目前很少有研究探讨畸胎瘤形成后的治疗方案。其中研究最为深入的策略之一是在干细胞中引入"自杀"基因^14,15。该方法通过基因改造干细胞，使其携带一种可诱导的促凋亡基因，该基因可在细胞注射后通过药物刺激被激活，从而在注射细胞形成畸胎瘤时提供补救措施。然而，这种方法存在明显缺陷，包括对多能干细胞（PSCs）进行基因修饰可能带来的脱靶效应，以及逐渐产生药物耐药性的风险¹⁶。另一种类似策略是利用小分子化合物，通过抑制抗凋亡通路来选择性地诱导PSCs死亡¹⁷。其他研究团队则采用针对多能性表面标志物（如足细胞样蛋白-1（PODXL））的抗体来靶向清除PSCs¹⁸。若小分子或抗体给药时机过早，可能显著影响PSCs的治疗潜力；而若给药过晚，则可能丧失治疗效果。此外，以这种方式使用的小分子和抗体所产生的全身性效应尚未得到充分研究。

治疗这些肿瘤的另一种方法依赖于使用外照射放射治疗（EBRT）。EBRT 是目前治疗实体瘤所采用的主要手段之一¹⁹。EBRT 技术的进步，包括质子束和立体定向放射外科的发展，使得能够更精确地靶向病灶结构，同时避免对正常组织造成损伤，从而使适形 EBRT 成为处理解剖学敏感结构中畸胎瘤形成的理想选择²⁰。此外，该方法避免了对干细胞进行基因操作或病毒转导，而这些操作均存在额外的临床安全性和有效性问题¹⁵。最后，微型辐照装置的技术进步使得 EBRT 可应用于啮齿类动物模型²¹。

本文中，我们演示了通过将人源iPSCs注射到小鼠体内，建立畸胎瘤形成的小动物模型。随后，我们展示了如何应用外照射放射治疗（EBRT）选择性地在体内清除这些肿瘤，同时最大程度减少对周围组织的损伤。该方法为PSC来源的畸胎瘤提供了靶向治疗手段，避免了生物分子和肽类的全身递送以及PSC基因操作所带来的脱靶效应。出于研究目的，我们提供一个可选步骤：通过报告基因转导干细胞，利用生物发光成像（BLI）追踪肿瘤对放射治疗的反应。

方案

本动物实验经斯坦福大学机构审查委员会和实验室动物护理行政小组批准并监督实施。

1. 诱导多能干细胞的细胞培养

1. 在涂有基底膜基质（例如 Matrigel，下文简称基质）的6孔板上培养通过慢病毒重编程获得的人iPSCs。
2. 每天更换iPSCs的培养基，使用富含补充物的培养基（见材料表），在37 °C、5% CO₂条件下培养。
3. 当细胞达到80–90%融合度时（约每4天一次），每孔加入1 mL重组细胞解离酶（见材料表），在37 °C孵育5分钟。
4. 5分钟后，通过移液将细胞从孔中解离，转移至15 mL离心管中，并在300 x g条件下离心。
5. 离心后，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含有Y27632抑制剂（按1:1,000稀释）的富含补充物的培养基中（见材料表）。
6. 对解离后的细胞进行计数，并以2 x 10⁵ 至 4 x 10⁵ 的密度接种于基质包被的6孔板中。

2. 使用双融合报告基因转导iPSCs

1. 按照常规方法在6孔板中传代iPSCs，并加入含有6 µg/mL聚凝胺的富集培养基（见材料表）。
   注意：为获得最高的转导效率，理想的克隆大小为每克隆200–400个细胞。
2. 使用SW-29转子在4 °C条件下以50,000 × g离心2小时，通过沉降离心法浓缩携带由人泛素启动子-C驱动的萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白（FLuc-eGFP）的自失活慢病毒。
3. 将病毒浓缩液以感染复数（MOI）为10的条件加入6孔板中的iPSCs中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。
   注意：感染复数是通过荧光激活细胞分选（FACS）扫描分析单体荧光蛋白的表达水平确定的。
4. 次日，在室温下以300 × g离心6孔板中的iPSCs 6分钟，去除病毒。
5. 每天更换富集培养基（见材料表），并按既定方案进行传代。使用荧光显微镜评估eGFP的大致转导效率。
6. 当至少30–40%的细胞表达eGFP时，即可进行FACS分选。若eGFP表达率达到30–40%，则继续对表达eGFP的hiPSCs进行FACS分选。
7. 为体外确认FLuc活性，将经FACS分选获得的表达GFP的细胞以每孔5,000个细胞的密度接种。
8. 将转导细胞与未转导细胞（作为阴性对照）分别与生物发光报告探针D-荧光素（100 μmol/L）孵育6小时，随后使用微孔板荧光光谱仪检测生物发光信号。

3. 在免疫缺陷小鼠背部 flank 区域移植 PSCs 以形成畸胎瘤

1. 向培养中携带双融合报告基因（FLuc-GFP）的人iPSCs的6孔板中每孔加入1 mL重组细胞解离酶混合液（参见第2部分），孵育5分钟。
2. 孵育结束后，通过移液吹打使细胞分散并充分表达。加入等体积的培养基，然后在250 x g 4 分钟。
3. 离心结束后，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 30 µL 基质中，并置于冰上以维持其活性，待注射前使用。确认收获量为 1 x 10⁶ 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
4. 若使用双融合报告基因转染的细胞，将双阳性FACS细胞（来自第2部分）重悬于30 µL基质中。
5. 使用2%异氟烷（1 L/min氧气）诱导8-10周龄裸鼠麻醉，随后以2%异氟烷（1 L/min氧气）维持麻醉。
6. 使用28.5 G注射器，将细胞/基质混合物（参见 材料表) 悬液注入皮下空间 侧腹，目标注射总量为 5 x 10³ 至 5 × 10⁶ 细胞（每次注射约100 μl）。
7. 若计划长期饲养小鼠并预期肿瘤生长较大，应考虑选择更偏尾侧的注射位点。 
8. 麻醉后的动物置于加热垫上恢复，直至能够自主活动（通常 <1小时，监测呼吸频率及脚趾皮肤颜色，直至可行走。 

4. 移植细胞的生物发光成像（BLI）以评估细胞存活及畸胎瘤生长

1. 在接种后的预定时间点，对小鼠进行腹腔注射（IP），每公斤体重注射375 mg的报告探针D-Luciferin。
2. 腹腔注射后10分钟，对麻醉动物进行生物发光信号成像（操作步骤按3.5所述），持续30分钟，每5分钟采集一次，每次采集时长为1分钟。
   注意： 建议每周进行一次图像采集。成像过程中通过吸入异氟烷维持麻醉状态。 通过 鼻锥
3. 进行数据分析时，在生物发光成像信号上绘制感兴趣区域（ROI），然后根据采集时间进行归一化，以每秒每平方厘米每球面度最大光子数（photons/s/cm²/sr）为单位量化发射信号。²/sr

5. 使用临床前图像引导照射器进行畸胎瘤照射（图1）

1. 在击倒箱中使用1 L/min流速的100%氧气混合2%异氟烷麻醉小鼠。待小鼠完全麻醉后，将其转移至图像引导的临床前辐照仪的床面上（参见 材料表). 通过持续吸入2%异氟烷维持麻醉 通过 鼻锥
2. 使用40 kVp、2 mA的X射线束，以360°范围内采集400张投影图像的方式获取显微CT图像，并将其重建为各向同性像素尺寸为0.2 mm的体数据图像。
3. 使用 RT_Image 软件包（http://rtimage.sourceforge.net/）根据微计算机断层扫描（micro-CT）图像规划放射治疗方案，并实施治疗。
   注意： 治疗方案采用两束225 kVp的X射线，其方向经过调整，使射线穿过浅表靶向畸胎瘤，同时掠过小鼠其他部位的体表，并避开深层内脏器官。根据每季度的系统校准数据调整射线照射时间，以确保靶向肿瘤中心的剂量达到6 Gy。
4. 连续三天重复治疗过程，使目标肿瘤的总照射剂量达到18 Gy。
5. 对动物进行常规的术后护理。

结果

注射后的小鼠通常在4–8周内会形成畸胎瘤，这可通过生物发光成像（BLI）确认（图2）。在细胞接种一个月后，对肿瘤部位施加累计剂量为18 Gy的照射，可导致肿瘤显著缩小，并伴随荧光素酶信号的明显下降（图2）。重要的是，距离照射部位5 mm处的正常组织未显示出明显损伤（图3）。

图1：使用EBRT治疗肿瘤的实验方案示意图。（A

讨论

来自"干细胞旅游"受害者的临床前数据和个案报道证实，畸胎瘤的发生风险是与PSC治疗相关的一个严重缺陷²³。因此，制定谨慎的策略以预防和治疗干细胞疗法相关的肿瘤性风险，是推动再生性干细胞疗法向临床转化的重要一步。本文中，我们描述了一种在小鼠模型中利用EBRT治疗PSC相关畸胎瘤的方法，并通过BLI成像展示了照射后肿瘤的动态萎缩过程。

我们利用通过慢病毒重编程方法制备的人诱导性多能干细胞（iPSCs），将其注射到裸鼠模型中，以在体内重现畸胎瘤的形成过程。使用裸鼠可避免因跨物种细胞注射导致的早期免疫排斥反应。尽管使用免疫缺陷小鼠会增强致瘤潜能，但相同的实验方案也可应用于使用小鼠多能干细胞（PSCs）的免疫健全小鼠。我们进一步将本研究中使用的PSCs转导了双融合报告基因，从而实现对体内移植细胞进行连续的生物发光成像。报告基因成像技术的使用使得无需依赖尸检和组织学分析，即可对PSC或PSC衍生物在体内的分布、肿瘤大小或生长情况进行连续追踪²⁴。先前的研究已证实生物发光成像（BLI）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
诱导性多能干细胞对照品系	Stanford University	Nguyen Lab	iPSC细胞培养
Corning Matrigel 基底膜基质 354234	Fisher Scientific	CB-40234	iPSC细胞培养
Essential 8 培养基	ATCC-全球生物资源中心	30-2203	iPSC细胞培养
TrypLE E	Gibco	12605-036	iPSC细胞培养
Y27632 抑制剂 2 HCl（ROCK 抑制剂）	Fisher Scientific	S104950MG	iPSC细胞培养
慢病毒	Cyagen	P170721-1001cjn	双融合报告基因转导iPSC
Polybrene 感染/转染试剂	Millipore Sigma	TR-1003-G	双融合报告基因转导iPSC
由泛素启动子驱动的Fluc-eGFP报告基因	Stanford University	Sam Gambhir 实验室	双融合报告基因转导iPSC
D-荧光素	Perkin Elmer	122799	双融合报告基因转导iPSC及生物发光成像
流式细胞仪（BD FACSARIA III）	BD Biosciences	FACSAria	双融合报告基因转导iPSC
微孔板荧光分光光度计（Glomax Navigator 系统）	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	双融合报告基因转导iPSC
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	生物发光成像
异氟烷	Sigma-Aldrich	CDS019936	辐照
X-Rad SmART 图像引导辐照仪	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	辐照
RT_Image 软件包	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	辐照