方法文章

利用外照射放疗在小型动物模型中靶向选择性治疗多能干细胞来源的畸胎瘤

DOI：

10.3791/58115

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2019年2月17日

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, Stanford University School of Medicine, 3Medical Service, Cardiology Section, Veteran Affairs Palo Alto Health Care System, 4Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 5Department of Radiology, Molecular Imaging Program, Stanford University School of Medicine, 6Peking University Shenzhen Health Science Institute, 7Department of Radiation Oncology, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

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针对多能干细胞来源畸胎瘤的治疗策略研究对于干细胞治疗的临床转化具有重要意义。本文中，我们描述了一种实验方案：首先在小鼠体内生成干细胞来源的畸胎瘤，随后利用小型动物照射器在活体中选择性靶向并治疗这些肿瘤。

摘要

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受害者数量不断增长 "干细胞旅游" 全球范围内未经规范监管的干细胞移植已引发人们对干细胞移植安全性的担忧。尽管目前临床普遍采用已分化细胞而非未分化细胞进行移植，但移植时残留的未分化干细胞或已分化细胞发生的自发突变仍可能导致畸胎瘤的形成。由于干细胞治疗常被递送至解剖学上敏感的部位，即使微小的肿瘤也可能造成严重的临床后果，导致失明、瘫痪、认知异常及心血管功能障碍。此外，这些部位的手术干预途径往往受限，使患者可选的治疗方案极为有限。因此，控制干细胞的异常行为对于干细胞治疗的临床转化至关重要。

外照射放疗是一种有效的靶向治疗手段，可在减少畸胎瘤负荷的同时，最大限度地降低对周围器官的损伤。此外，该方法避免了与基因操作或病毒转导干细胞相关的临床安全性和有效性问题。本文介绍一种在小鼠体内建立多能干细胞来源畸胎瘤并应用外照射放疗在活体中选择性消融这些肿瘤的实验方案。

引言

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在过去的几十年中，干细胞疗法在组织再生领域的应用遇到了诸多障碍，阻碍了其高效地进入临床应用。这些障碍包括细胞在递送部位的滞留率低、干细胞的免疫原性以及形成畸胎瘤的肿瘤化潜能1。致瘤性尤其令人关注，因为它可能对接受干细胞移植的患者造成伤害2。由于未受监管的干细胞注射导致肿瘤形成的病例已在多个临床环境中被报道3,4,5。畸胎瘤形成的风险是多能干细胞（PSC）研发中最常被提及的临床问题，已导致多项备受关注的胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）临床试验被推迟或取消6,7,8,9。因此，若此类医源性肿瘤发生，亟需开展转化研究以提供适当的治疗方案。

迄今为止，控制干细胞异常行为的大多数策略都集中在减少具有致瘤潜能的PSC数量2,10

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方案

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本动物实验经斯坦福大学机构审查委员会和实验室动物护理行政小组批准并监督实施。

1. 诱导多能干细胞的细胞培养

  1. 在涂有基底膜基质（例如 Matrigel，下文简称基质）的6孔板上培养通过慢病毒重编程获得的人iPSCs。
  2. 每天更换iPSCs的培养基，使用富含补充物的培养基（见材料表），在37 °C、5% CO2条件下培养。
  3. 当细胞达到80–90%融合度时（约每4天一次），每孔加入1 mL重组细胞解离酶（见材料表），在37 °C孵育5分钟。
  4. 5分钟后，通过移液将细胞从孔中解离，转移至15 mL离心管中，并在300 x g条件下离心。
  5. 离心后，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含有Y27632抑制剂（按1:1,000稀释）的富含补充物的培养基中（见材料表）。
  6. 对解离后的细胞进行计数，并以2 x 105 至 4 x 105 的密度接种于基质包被的6孔板中。

2. 使用双融合报告基因转导iPSCs

  1. 按照常规方法在6孔板中传代iPSCs，并加入含有6 µg/mL聚凝胺的富集培养基（见....

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结果

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注射后的小鼠通常在4–8周内会形成畸胎瘤，这可通过生物发光成像（BLI）确认（图2）。在细胞接种一个月后，对肿瘤部位施加累计剂量为18 Gy的照射，可导致肿瘤显著缩小，并伴随荧光素酶信号的明显下降（图2）。重要的是，距离照射部位5 mm处的正常组织未显示出明显损伤（图3）。

动物放射治疗流程图，包含CT成像、靶区识别和照射时机。
图1：使用EBRT治疗肿瘤的实验方案示意图。（A

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讨论

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来自"干细胞旅游"受害者的临床前数据和个案报道证实，畸胎瘤的发生风险是与PSC治疗相关的一个严重缺陷23。因此，制定谨慎的策略以预防和治疗干细胞疗法相关的肿瘤性风险，是推动再生性干细胞疗法向临床转化的重要一步。本文中，我们描述了一种在小鼠模型中利用EBRT治疗PSC相关畸胎瘤的方法，并通过BLI成像展示了照射后肿瘤的动态萎缩过程。

我们利用通过慢病毒重编程方法制备的人诱导性多能干细胞（iPSCs），将其注射到裸鼠模型中，以在体内重现畸胎瘤的形成过程。使用裸鼠可避免因跨物种细胞注射导致的早期免疫排斥反应。尽管使用免疫缺陷小鼠会增强致瘤潜能，但相同的实验方案也可应用于使用小鼠多能干细胞（PSCs）的免疫健全小鼠。我们进一步将本研究中使用的PSCs转导了双融合报告基因，从而实现对体内移植细胞进行连续的生物发光成像。报告基因成像技术的使用使得无需依赖尸检和组织学分析，即可对PSC或PSC衍生物在体内的分布、肿瘤大小或生长情况进行连续追踪24。先前的研究已证实生物发光成像（BLI）.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢美国国立卫生研究院提供的支持，包括项目 R01 HL134830（PKN）、K08 HL135343（KS）和 5F32HL134221（JWR）；霍华德·休斯医学研究所（ASL）；以及斯坦福心血管研究所（ASL）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
诱导性多能干细胞对照品系Stanford UniversityNguyen LabiPSC细胞培养
Corning Matrigel 基底膜基质 354234Fisher ScientificCB-40234iPSC细胞培养
Essential 8 培养基ATCC-全球生物资源中心30-2203iPSC细胞培养
TrypLE EGibco12605-036iPSC细胞培养
Y27632 抑制剂 2 HCl（ROCK 抑制剂）Fisher ScientificS104950MGiPSC细胞培养
慢病毒CyagenP170721-1001cjn双融合报告基因转导iPSC
Polybrene 感染/转染试剂Millipore SigmaTR-1003-G双融合报告基因转导iPSC
由泛素启动子驱动的Fluc-eGFP报告基因Stanford UniversitySam Gambhir 实验室双融合报告基因转导iPSC
D-荧光素Perkin Elmer122799双融合报告基因转导iPSC及生物发光成像
流式细胞仪（BD FACSARIA III）BD Biosciences FACSAria双融合报告基因转导iPSC
微孔板荧光分光光度计（Glomax Navigator 系统）Promega Bio Systems, Sunnyvale, CAGM2000双融合报告基因转导iPSC
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer124262生物发光成像
异氟烷Sigma-AldrichCDS019936辐照
X-Rad SmART 图像引导辐照仪 Precision X-ray Inc., North Branford, CTX-Rad SmART辐照
RT_Image 软件包Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)RT_Image v0.2β辐照

参考文献

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  1. Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
  2. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapi....

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