Method Article

耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性分析

DOI:

10.3791/58116

⸱

October 4th, 2018

 ,  , 
1Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central, and Département de Neurosciences, Université de Montréal, 2Faculté de Médecine Dentaire, Université de Montréal

In This Article

Summary

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在这里, 我们提出了一个评估胶质网络组织的协议。所述方法最大限度地减少偏倚, 以提供这些网络的描述性度量, 如细胞计数、大小、面积和原子核内的位置。各向异性的评估与矢量分析。

Abstract

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越来越清楚的是, 星形胶质细胞调节神经元功能不仅在突触和单细胞水平, 而且在网络水平。星形胶质细胞通过缝隙连接紧密相连, 通过这些结点的耦合是动态和高度调节的。一个新的概念是, 胶质功能是专门的和适应的功能, 神经元电路与他们的联系。因此, 需要测量胶质网络各种参数的方法, 以便更好地描述其通信和耦合的规则, 进一步了解它们的功能。

在这里, 利用图像分析软件 (ImageJFIJI), 描述了一种分析染料耦合胶质网络共焦图像的方法。这些方法允许 1) 自动和无偏检标记的细胞, 2) 计算网络的大小, 3) 计算染料在网络内传播的优先方向, 4) 在感兴趣的区域内重新定位网络.

该分析可用于描述某一特定区域的胶质网络, 比较与不同功能相关的不同区域的网络, 或比较在不同条件下获得的网络对耦合有不同的影响。这些观察可能会导致重要的功能考虑。例如, 我们分析了三叉核的胶质网络, 我们以前曾表明, 胶质耦合对于神经元将其射击模式从补品转变为有节奏的1的能力至关重要。通过测量这个原子核中胶质网络的大小、约束和优先方向, 我们可以建立它们所限制的功能域的假说。一些研究表明, 一些其他的大脑区域, 包括桶皮质, 侧高橄榄, 嗅觉肾小球, 以及丘脑和视觉皮层的感觉细胞核, 可以从类似的分析中获益。

Introduction

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许多研究已经描述了神经元-星形胶质细胞在子蜂窝或突触水平上的对话如何对神经元功能和突触传递产生影响。研究表明, 星形胶质细胞对周围神经元活动敏感;事实上, 他们有许多神经递质的受体, 包括谷氨酸, GABA, 乙酰胆碱和 ATP (见以前发表的评论2,3,4)。作为回报, 胶质处理 ensheath 突触元素, 并通过调节细胞外离子动态平衡和释放几个因素或发射机, 如谷氨酸、d-丝氨酸和 ATP, 影响到 extrasynaptic 的神经活动。5,6,7。

星形胶质细胞也可以在网络水平上调节神经元功能的想法已经出现, 证据表明胶质耦合是空间调控的, 对应于具有清晰解剖特征的区域的神经元分割。划分 (如与感官表示的区域), 表明星形胶质细胞将对其他功能相同的星形胶质细胞, 而不仅仅是那些附近的。例如, 在外侧高级橄榄, 大多数胶质网络是定向正交到 tonotopic 轴8, 而在桶皮层或 olfactoty 肾小球, 星形胶质细胞之间的通信更强在桶或肾小球并且....

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Protocol

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加拿大卫生研究所规定的所有程序, 并经蒙特利尔大学动物保育和使用委员会批准。

1. 大鼠脑切片的制备

  1. 制备 1 l 的蔗糖基溶液 (表 1) 和 1 l 的标准人工脑脊髓液 (aCSF) (表 2)。
  2. 气泡的蔗糖为基础的解决方案, 混合 95% O2和 5% CO2 (卡波金) 为30分钟之前, 将其放置在-80 °c 约30分钟, 直到解决方案是冷的, 但不是完全冻结。用这种冰冷的蔗糖作为切片的切削缓冲。把它放在冰上, 一旦它从冰箱里取出。
  3. 通过整个实验, aCSF 与卡波金的气泡。将此解决方案用于切片存储, 并将其作为灌注缓冲器, 在该缓冲区中对星形胶质细胞进行补丁夹紧和 biocytin 填充。准备一个切片恢复保持室, 以存放脑切片, 一旦他们被削减。
    注: 切片回收保持室可以是定制的, 主要包括一个小井与网在底部悬浮在一个较大的井, 填补了 aCSF, 其中一管插入, 以使卡波金从底部。
  4. 使用15到21天大的大大鼠, 没有任何性别或应变特异性的偏见。麻醉动物与异氟醚 (1 毫升异氟醚在麻醉诱导室)。通过轻轻捏紧动物的后爪或尾部, 检查麻醉深度。
  5. 斩首老鼠使用断头台, 用剪刀剪下头骨, 用平铲快速地从颅骨上取出大脑。
  6. 将大脑浸泡在冰冷的....

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Results

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大脑细胞之间的耦合不是静止的, 而是由许多因素动态调节的。介绍了在不同条件下胶质网络的分析方法, 并对其在 NVsnpr 中的组织进行了了解。这些结果已经发表在1。在三种不同的条件下, 我们在 NVsnpr 的背部进行了 biocytin 填充单星形胶质细胞的充填: 休息 (在没有任何刺激的情况下控制条件下), 在 Ca2 +自由条件, 并继电刺激投射到细胞核的感官纤维。对每个条件下的星形胶质细胞的 biocytin 填充实验设置在图 6A的左侧进行了说明。

在控制条件下观察到 biocytin 标记细胞的网络, 并证实了 NVsnpr 星形胶质细胞在静止时的基底状态。在11个测试的病例中, biocytin 扩散显示了由 11 3 细胞组成的网络 (图

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Discussion

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有许多电生理方法来评估星形胶质细胞23,24之间的功能耦合。然而, 这些方法并没有提供有关胶质网络解剖安排的信息。一些研究已经表明, "染料-或示踪-耦合", 在这里做, 只发生在一小部分的耦合细胞检测的电生理方法25,26,27, 表明,使用此方法检测到的单元格数被低估。然而, 这仍然是最好的方法, 以可视化的耦合。当使用小于1-1 的分子示踪剂时, 可以获得更大的染料耦合. 2 KDa 渗透缝隙连接20。通过监测荧光葡萄糖衍生物 (2-NBDG) 或荧光标记 (如一些 Alexa 染料或路西法黄) 的扩散, 可以进行耦合的实时可视化, 但由于其体积较小, biocytin 产生更好的结果, 并允许定量的固定组织。因此, 应该指出, 用这种.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作由加拿大卫生研究所资助, 赠款/奖励编号: 14392。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher ChemicalsS671-3
KClFisher ChemicalsP217-500
KH2PO4Fisher ChemicalsP285-500
MgSO4Fisher ChemicalsM65-500
NaHCO3Fisher ChemicalsS233-500
C6H12O6 葡萄糖无水费舍尔化学品D16-500
CaCl2 二水合SigmaC70-500
蔗糖SigmaS9378
D-葡萄糖酸钾盐SigmaG45001
MgCl2 无水SigmaM8266
HEPESSigmaH3375
EGTASigmaE4378
ATPTris 盐SigmaA9062
GTPTris 盐SigmaG9002
生物胞素SigmaB4261
卡苯酚酮二钠盐SigmaC4790
亲和素-生物素复合物 ： ABC 试剂盒Vestor laboratoriesPK-4000
链霉亲和素-alexa 594分子探针S11227
TritonFisher ChemicalsBP151-500
二甲苯费舍尔化学X5-1
水性封固剂 1 ： Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
甲苯基合成树脂封固剂 ： PermountFisher ChemicalsSP15-100
载玻片干燥台Fisherbrand11-474-470
振动切片机LeicaVT 1000S
显微镜盖玻Fisherbrand12-544A
显微镜载玻片 ColorFrostFisherbrand12-550-413
PFAFisherchemicals04042-500
奥林巴斯 FluoView FV 1000 共聚焦显微镜奥林巴斯
40X 水浸镜头奥林巴斯LUMPLFLN40XW
20X 水浸镜头奥林巴斯XLUMPLFL20XW
4X 水浸镜头奥林巴斯XLFLUOR4X/340
微量移液器拉拔器萨特仪器P97
显微作器萨特仪器MP 225
相机 CCD索尼CX-ST50
黑白显示器索尼SSM-125
Digidata分子器件1322A
膜片钳放大器轴突仪Mulitclamp 700A
电生理学采集软件Molecular devicespClamp 8
电生理学分析软件Molecular devicesClampfit 8
成像分析软件ImageJFIJI开源软件。斐济版本包括插件包。
矢量图像编辑器AdobeIllustrator CS4
电子表格应用程序Microsoft OfficeExcel 2010
片

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
  2. Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and sign....

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