分析耦合星形胶质细胞网络的大小、形状和方向性

摘要

本文介绍了一种评估星形胶质细胞网络结构的实验方案。该方法可最大限度地减少偏差，提供对这些网络的描述性测量指标，如细胞数量、大小、面积以及在核团内的位置。各向异性通过矢量分析进行评估。

摘要

越来越多的研究表明，星形胶质细胞不仅在突触和单细胞水平上调节神经元功能，还在神经网络水平上发挥调节作用。星形胶质细胞通过缝隙连接相互紧密连接，而这些连接处的耦合是动态且高度受调控的。近年来逐渐形成的一个新概念是，星形胶质细胞的功能具有特异性，并且会根据其所关联的神经环路功能进行适应性调整。因此，需要建立能够测量星形胶质细胞网络多种参数的方法，以更准确地描述其通信和耦合所遵循的规律，并进一步理解其功能。

本文利用图像分析软件（例如，ImageJFIJI），介绍了一种用于分析通过染料偶联揭示的星形胶质细胞网络共聚焦图像的方法。该方法可实现：1）对标记细胞进行自动化且无偏倚的检测；2）计算网络的大小；3）计算染料在网络内扩散的优先方向；4）将网络重新定位至感兴趣区域。

该分析可用于表征特定区域的星形胶质细胞网络，比较与不同功能相关的不同区域的网络，或比较在不同条件下获得的、对细胞间偶联产生不同影响的网络。这些观察结果可能引出重要的功能学思考。例如，我们分析了三叉神经核团中的星形胶质细胞网络，在此前的研究中已证明，该区域星形胶质细胞的偶联对于神经元从紧张性放电转变为节律性爆发放电至关重要¹。通过测量该核团中星形胶质细胞网络的大小、空间局限性及其优势取向，我们可以对其所限定的功能域提出假设。已有若干研究表明，其他多个脑区（包括桶状皮层、外侧上橄榄核、嗅球小球层、丘脑感觉核团以及视觉皮层等）也可能受益于类似的分析方法。

引言

许多研究描述了神经元与星形胶质细胞在亚细胞或突触水平上的相互对话如何影响神经元功能和突触传递。已明确星形胶质细胞对周围神经元活动具有敏感性；事实上，它们表达多种神经递质的受体，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰胆碱和三磷酸腺苷（ATP）（参见先前发表的综述^2,3,4）。反过来，星形胶质细胞的突起包绕突触结构，并通过调节细胞外离子稳态以及释放多种因子或递质（如谷氨酸、D-丝氨酸和ATP），在突触部位及突触外位点影响神经元活动^5,6,7。

有研究提出，星形胶质细胞还能够在网络层面调节神经元功能。证据表明，星形胶质细胞之间的耦合在空间上受到调控，并与具有明确解剖分区区域（如具有感觉表征的区域）中的神经元分段相对应，这表明星形胶质细胞倾向于与执行相同功能的其他星形胶质细胞发生耦合，而不仅仅是与邻近的细胞耦合。例如，在外侧上橄榄核中，大多数星形胶质细胞网络的排列方向与音调定位轴垂直⁸；而在桶状皮层或嗅小球中，星形胶质细胞之间的通讯在同一个桶状结构或嗅小球内部更强....

方案

所有实验程序均遵守加拿大卫生研究院的规定，并已获得蒙特利尔大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 大鼠脑切片的制备

1. 配制1 L蔗糖溶液（表1）以及1 L标准人工脑脊液（aCSF）（表2).
2. 用95% O₂和5% CO₂的混合气体对蔗糖溶液进行鼓泡处理₂ 和 5% CO₂ （碳合气）30 分钟，然后置于 -80 °C 约30分钟，直至溶液冷却但未完全冻结。使用此冰冻蔗糖溶液作为脑组织切片的切割缓冲液。从冷冻箱取出后，应始终保持在冰上。
3. 在整个实验过程中用含碳氧混合气的 aCSF 持续充气。此溶液用于脑片储存，以及作为进行星形胶质细胞膜片钳记录和生物胞素灌注的灌流缓冲液。准备一个脑片恢复孵育槽，以便在脑片切制完成后立即放置。
   注意：切片恢复保持室可自行定制，主要由一个小室构成，小室底部带有网格，悬浮于盛有aCSF的大室中，大室中插入一根导管，用于从底部通入碳氧混合气体。
4. 使用15至21日龄的Sprague-Dawley大鼠，无性别或品系特异性偏倚。在麻醉诱导舱中使用异氟烷（1 mL异氟烷）对动物进行麻醉。通过轻轻夹捏动物的后肢足垫或尾巴来检查麻醉深度。
5. 使用断头台处死大鼠，用剪刀剪开颅骨，并用扁平刮勺迅速将脑组织从颅腔中取出。
6. 将脑组织浸....

结果

脑内细胞间的耦合并非静态，而是受到多种因素动态调控。所描述的方法旨在分析不同条件下显现的星形胶质细胞网络，并理解其在NVsnpr中的组织方式。这些结果已发表¹。我们在三种不同条件下，对NVsnpr背侧部单个星形胶质细胞进行生物胞素填充：静息状态（无任何刺激的对照条件）、无Ca²⁺环境，以及对投射至该核团的感觉纤维进行电刺激后。每种条件下星形胶质细胞生物胞素填充的实验设置如图6A-C左侧所示。

在对照条件下观察到生物胞素标记细胞的网络，证实了NVsnpr星形胶质细胞在静息状态下存在基础的细胞间偶联。在11个测试样本中，生物胞素扩散形成的网络由11 ± 3个细胞组成（图6A 中间图，图6D

讨论

存在多种电生理学方法可用于评估星形胶质细胞之间的功能耦合^23,24然而，这些方法无法提供有关星形胶质细胞网络解剖结构排列的信息。已有大量研究表明 "染料或示踪剂偶联"，如本研究中所示，仅发生在通过电生理方法检测到的部分偶联细胞中^25,26,27，表明该方法检测到的细胞数量被低估。然而，这仍是观察偶联现象的最佳方法。当使用分子量小于1-1.2 KDa的示踪分子穿透间隙连接时，可获得更强的染料偶联。²⁰通过监测荧光葡萄糖衍生物（2-NBDG）或荧光标记物（如某些Alexa染料或Lucifer Yellow）的扩散，可实现对耦合的活体可视化。¹³但由于其分子较小，生物胞素能产生更好的效果，并可在固定组织中进行定量分析。因此需注意，该.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher Chemicals	S671-3
KCl	Fisher Chemicals	P217-500
KH2PO4	Fisher Chemicals	P285-500
MgSO4	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500
C6H12O6 无水葡萄糖	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 二水合物	Sigma	C70-500
蔗糖	Sigma	S9378
D-葡萄糖酸钾盐	Sigma	G45001
MgCl2 无水	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris 盐	Sigma	A9062
GTPTris 盐	Sigma	G9002
生物胞素	Sigma	B4261
甘珀酸二钠盐	Sigma	C4790
亲和素-生物素复合物：ABC试剂盒	Vestor Laboratories	PK-4000
链霉亲和素-Alexa 594	Molecular Probes	S11227
曲拉通	Fisher Chemicals	BP151-500
二甲苯	Fisher Chemicals	X5-1
水性封片剂1：Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
甲苯基合成树脂封片剂：Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
载玻片干燥台	Fisherbrand	11-474-470
振动切片机	Leica	VT 1000S
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-544A
显微镜载玻片 ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
多聚甲醛	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 共聚焦显微镜	Olympus
40X 水浸物镜	Olympus	LUMPLFLN40XW
20X 水浸物镜	Olympus	XLUMPLFL20XW
4X 水浸物镜	Olympus	XLFLUOR4X/340
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P97
显微操作器	Sutter Instrument	MP 225
CCD相机	Sony	CX-ST50
黑白监视器	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular Devices	1322A
膜片钳放大器	Axon Instrument	Mulitclamp 700A
电生理数据采集软件	Molecular Devices	pClamp 8
电生理数据分析软件	Molecular Devices	Clampfit 8
成像分析软件	ImageJFIJI	开源软件，包含插件包的FIJI版本
矢量图像编辑器	Adobe	Illustrator CS4
电子表格应用程序	Microsoft Office	Excel 2010