本文介绍了一种评估星形胶质细胞网络结构的实验方案。该方法可最大限度地减少偏差，提供对这些网络的描述性测量指标，如细胞数量、大小、面积以及在核团内的位置。各向异性通过矢量分析进行评估。
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摘要
摘要
越来越多的研究表明，星形胶质细胞不仅在突触和单细胞水平上调节神经元功能，还在神经网络水平上发挥调节作用。星形胶质细胞通过缝隙连接相互紧密连接，而这些连接处的耦合是动态且高度受调控的。近年来逐渐形成的一个新概念是，星形胶质细胞的功能具有特异性，并且会根据其所关联的神经环路功能进行适应性调整。因此，需要建立能够测量星形胶质细胞网络多种参数的方法，以更准确地描述其通信和耦合所遵循的规律，并进一步理解其功能。
本文利用图像分析软件（例如，ImageJFIJI），介绍了一种用于分析通过染料偶联揭示的星形胶质细胞网络共聚焦图像的方法。该方法可实现：1）对标记细胞进行自动化且无偏倚的检测；2）计算网络的大小；3）计算染料在网络内扩散的优先方向；4）将网络重新定位至感兴趣区域。
该分析可用于表征特定区域的星形胶质细胞网络，比较与不同功能相关的不同区域的网络，或比较在不同条件下获得的、对细胞间偶联产生不同影响的网络。这些观察结果可能引出重要的功能学思考。例如，我们分析了三叉神经核团中的星形胶质细胞网络，在此前的研究中已证明，该区域星形胶质细胞的偶联对于神经元从紧张性放电转变为节律性爆发放电至关重要1。通过测量该核团中星形胶质细胞网络的大小、空间局限性及其优势取向，我们可以对其所限定的功能域提出假设。已有若干研究表明，其他多个脑区（包括桶状皮层、外侧上橄榄核、嗅球小球层、丘脑感觉核团以及视觉皮层等）也可能受益于类似的分析方法。
引言
许多研究描述了神经元与星形胶质细胞在亚细胞或突触水平上的相互对话如何影响神经元功能和突触传递。已明确星形胶质细胞对周围神经元活动具有敏感性；事实上，它们表达多种神经递质的受体，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、乙酰胆碱和三磷酸腺苷（ATP）（参见先前发表的综述2,3,4）。反过来，星形胶质细胞的突起包绕突触结构，并通过调节细胞外离子稳态以及释放多种因子或递质（如谷氨酸、D-丝氨酸和ATP），在突触部位及突触外位点影响神经元活动5,6,7。
有研究提出，星形胶质细胞还能够在网络层面调节神经元功能。证据表明，星形胶质细胞之间的耦合在空间上受到调控，并与具有明确解剖分区区域（如具有感觉表征的区域）中的神经元分段相对应，这表明星形胶质细胞倾向于与执行相同功能的其他星形胶质细胞发生耦合，而不仅仅是与邻近的细胞耦合。例如，在外侧上橄榄核中，大多数星形胶质细胞网络的排列方向与音调定位轴垂直8；而在桶状皮层或嗅小球中，星形胶质细胞之间的通讯在同一个桶状结构或嗅小球内部更强，而在相邻结构之间较弱9,10。在这两种情况下，星形胶质细胞网络均朝向嗅小球或桶状结构的中心排列9,10。
我们最近发现，星形胶质细胞活动通过降低细胞外 Ca²⁺ 浓度来调节神经元放电2+ ([Ca2+]e），可能是通过释放S100β（一种Ca2+结合蛋白11该效应在三叉神经主感觉核背侧部（NVsnpr）的一群三叉神经节律性神经元中得到证实，该区域被认为在咀嚼运动的产生中起重要作用，其机制在于这些神经元的节律性放电依赖于一种持续性钠电流（persistent Na⁺ current）。+ 由[Ca浓度降低所促进的电流2+]e11,12这些神经元中可诱发节律性放电 "生理上" 通过刺激其输入或人工降低[Ca2+]e我们进一步证明，星形胶质细胞间的耦合是神经元节律性放电所必需的1这提出了星形胶质细胞网络可能形成特定的功能域，在其中神经元活动能够实现同步与协调的可能性。为了验证这一假设，我们首先需要建立一种方法，以严格记录这些网络在NVsnpr中的组织结构。
以往关于星形胶质细胞网络的研究主要以细胞数量、连接密度以及覆盖的面积来描述其耦合程度。对星形胶质细胞网络形态及染料耦合方向的评估，大多通过比较在桶状皮层9、海马13,14,15、丘脑的桶状核区16、外侧上橄榄核8、嗅球小球10以及皮层14中沿两个轴（x轴和y轴）方向的网络大小来进行。本文所述方法可实现对网络中标记细胞的无偏计数，并估算其覆盖的面积。我们还开发了用于定义网络内耦合的优先取向，并判断该优先取向是否指向核团中心或其他方向的分析工具。与以往方法相比，本方案提供了一种描述诸如背侧三叉神经主感觉核等缺乏明确解剖分区结构中星形胶质细胞网络组织与取向的手段。在上述研究中，网络取向通常被描述为与结构自身已有明确记录的形态之间的关系（例如，丘脑中的桶状核、皮层中的桶状结构、海马和皮层中的分层结构、嗅球中的小球结构等）。此外，矢量分析方法使得在不同条件下揭示的耦合取向之间可进行比较。为了分析这些参数是否随网络在核团内的位置而变化，我们还建立了一种方法，将每个网络相对于核团边界进行定位还原。这些工具可轻松适用于其他脑区，用于研究耦合细胞网络。
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方案
所有实验程序均遵守加拿大卫生研究院的规定，并已获得蒙特利尔大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 大鼠脑切片的制备
- 配制1 L蔗糖溶液（表1）以及1 L标准人工脑脊液（aCSF）（表2).
- 用95% O₂和5% CO₂的混合气体对蔗糖溶液进行鼓泡处理2 和 5% CO2 （碳合气）30 分钟，然后置于 -80 °C 约30分钟，直至溶液冷却但未完全冻结。使用此冰冻蔗糖溶液作为脑组织切片的切割缓冲液。从冷冻箱取出后，应始终保持在冰上。
- 在整个实验过程中用含碳氧混合气的 aCSF 持续充气。此溶液用于脑片储存，以及作为进行星形胶质细胞膜片钳记录和生物胞素灌注的灌流缓冲液。准备一个脑片恢复孵育槽，以便在脑片切制完成后立即放置。
注意：切片恢复保持室可自行定制，主要由一个小室构成，小室底部带有网格，悬浮于盛有aCSF的大室中，大室中插入一根导管，用于从底部通入碳氧混合气体。 - 使用15至21日龄的Sprague-Dawley大鼠，无性别或品系特异性偏倚。在麻醉诱导舱中使用异氟烷（1 mL异氟烷）对动物进行麻醉。通过轻轻夹捏动物的后肢足垫或尾巴来检查麻醉深度。
- 使用断头台处死大鼠，用剪刀剪开颅骨，并用扁平刮勺迅速将脑组织从颅腔中取出。
- 将脑组织浸入冰冻的蔗糖基溶液中约30秒，然后连同溶液一起转移至培养皿中。若沿横断面切片，使用剃刀刀片切除待切区域的前部和后部组织。
- 将剩余的脑组织块以其头端朝下粘附，继续进行脑切片的切割（350 µm 使用振动切片机在基于蔗糖的培养基中切出脑片（厚度为……）。随后，将收集的脑片转移至盛有通入碳氧混合气体（carbogenated aCSF）的恢复孵育 chamber 中，在室温（RT）下保存，直至使用（至少预留1小时恢复时间）。
注意：该领域最近的进展允许将脑切片孵育时间延长至24小时 体外 条件17.
2. 星形胶质细胞的 Sulforhodamine 101 (SR-101) 标记
- 将水浴锅预热至 34 °C，并将两个切片孵育 chamber 置于其中。将其中一个切片孵育 chamber 中加入含 1 μM SR-101 的 aCSF 溶液，另一个仅加入 aCSF。
- 将切片在含有 1 µM SR-101 的孵育 chamber 中孵育 20 分钟，然后将其转移至第二个孵育 chamber 中，以洗去组织中多余的 SR-101。在 34 °C 下继续孵育 20 分钟或更长时间，随后将含有切片的孵育 chamber 置于室温下保存，直至后续使用18。
3. 星形胶质细胞膜片钳与生物胞素填充
- 选择一片脑片并将其放入显微镜的记录室中。用于记录星形胶质细胞时，使用电阻为4-6 MΩ的电极，并填充基于葡糖酸钾的溶液（见表3）。
- 在视觉引导下，利用显微操作器将记录电极对准SR-101标记的星形胶质细胞，如图1所示。避免选择位于脑片表面的细胞，因为这些细胞更可能受损或已失去与邻近细胞的连接。
- 为防止生物胞素在组织中泄漏，应尽量减少向膜片钳电极施加的正压，并仅在电极接近待记录的星形胶质细胞时施加（在1 mL注射器中施加0.1–0.4 mL）。
- 在形成膜片钳之前，调整电极的偏移电压和电容补偿。校正液接电位，因为准确且精确的电压指令对实验至关重要19。
- 将电极移至足够接近星形胶质细胞的位置，以观察到正压引起的凹陷。随后撤除正压，并缓慢施加轻微负压。当封接电阻达到100 MΩ时，将细胞钳制在-70 mV。等待封接电阻升至1–3 GΩ。持续施加负压直至进入细胞内。施加负压时需格外小心，因为星形胶质细胞非常脆弱。
- 评估已形成膜片钳的细胞的电生理特性。在电压钳模式下，采用持续600 ms的斜坡电压指令（从-120 mV至+110 mV）进行全细胞电流-电压关系记录。在电流钳模式下，执行阶梯式IV协议，即注入持续1000 ms、步长为100 pA、范围从-1至1 nA的电流脉冲，全细胞记录的采样率为10 kHz。
注意：星形胶质细胞表现出线性的电流-电压关系，无任何整流现象（如图1B所示），且在膜去极化时不会产生动作电位（图1C）。静息膜电位（RMP）应稳定，且不应高于-60 mV。在某些脑区，星形胶质细胞的静息膜电位比NVsnpr区更超极化。 - 在每隔5分钟执行一次阶梯式IV协议的同时，让生物胞素在星形胶质细胞内扩散30分钟。
- 小心回撤并脱离膜片钳电极，避免损伤已记录的星形胶质细胞，并在将电极移出记录室前立即记录电极的偏移值。将该数值从膜电位记录中扣除。
- 将脑片留在记录室中静置至少15分钟（此外还需加上30分钟的注射时间），以使示踪剂从被记录的星形胶质细胞扩散至整个耦合细胞网络。
注意：为显示耦合细胞网络，应在目标核团中仅记录单个细胞。若需多次尝试才能成功形成膜片钳，则应舍弃该样本，并尝试在对侧或另一片脑片上进行记录。 - 在组织上做标记或切口以辨识脑片的朝上面，先将脑片转移至含有正常aCSF的培养皿中，再转入4%多聚甲醛（PFA）溶液中。于4 °C下孵育过夜。
警告：PFA具有极高毒性。操作时须佩戴防护装备并在通风橱中进行。确保所有接触过PFA的材料（如刷子、离心管等）不得接触组织回收保存室、孵育室或其他用于新鲜组织记录的器材。
4. 生物胞素显影
- 荧光链霉亲和素显影
- 在室温下用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 2 次。随后，在含有 4% 非离子型去污剂的 PBS 中，以 1/200 的稀释比例加入与荧光染料偶联的链霉亲和素，于室温孵育 4 小时，以显影生物素标记物。
- 在室温下用 0.1 M PBS 清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。将切片用含水封片剂封固于载玻片上，确保注射侧朝上，加盖盖玻片，并用指甲油封边。
- DAB 显影
注意：当无法使用荧光检测时，可采用 DAB（3,3-二氨基联苯胺）显影。在此情况下，为便于比较，应仅使用一种显影方法。- 在室温下用 PBS 清洗脑切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。随后在 PBS + 0.5% H2O2 中于室温孵育 1 小时。
- 在室温下用 PBS 清洗切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。然后将切片置于亲和素-生物素复合物染色液中，该溶液由 PBS、0.1% 非离子型去污剂及标准亲和素-生物素复合物过氧化物酶染色试剂盒试剂按 1/100 稀释而成，于室温孵育 24 小时。
- 在室温下用 PBS 清洗切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。随后将切片置于 PBS + 0.05% DAB 溶液中孵育 20 分钟，再转移至 PBS + 0.05% DAB + 0.5% H2O2 溶液中。
警告：DAB 具有极高毒性。操作时须在通风橱内佩戴防护装备。当切片转移至 PBS 时，显色反应即停止。 - 在室温下用 PBS 清洗切片，每次 10 分钟，共洗 5 次。将切片封固于载玻片上（确保注射侧朝上），并在 34 °C 的玻片干燥台上过夜干燥。
- 将载玻片依次浸入 70%、95% 和 100% 的酒精浴中各 1 分钟，最后浸入二甲苯中 1 分钟。
- 使用基于甲苯的合成树脂封片剂封固载玻片，加盖盖玻片，并用指甲油封边。
5. 网络成像
- 使用配备 20X 和 4X 物镜（或可适当观察网络所在核区域全貌的物镜）以及可检测荧光染料的激光器的激光扫描共聚焦显微镜，观察星形胶质细胞网络（本实验中使用 Alexa-594）。
- 使用 20X 放大倍数对标记细胞的网络进行 z 轴层扫成像。设置分辨率为 800 x 800 像素，扫描速度为 12.5 μs/像素。
注意：为完整成像整个网络，通常需要采集多个 z 层堆栈，且每个网络所需的堆栈数量需单独调整。分辨率和扫描速度可调整，但所有数据的成像必须使用相同的设置。 - 使用 4X 放大倍数对网络及感兴趣区域进行成像。
注意：4X 成像用于确定网络在目标核团中的位置。务必同时在透射光下对同一视野进行成像。当无法从共聚焦荧光图像中辨识核团边界时，该透射图像将提供重要参考。
6. 图像分析
- 数据准备
- 使用软件 ImageJFIJI（在 https://fiji.sc/ 下载）。打开文件后，在“Bio-Formats Import Options”窗口中点击“OK”。
- 重新定义一个z轴堆栈，使其仅包含最终z轴堆栈所需的光学切片（图 2A），点击工具栏中的“Stack”旋钮（查找时，先选择 stk | Z 投影）。在投影类型设置中选择“最大强度投影”（Max Intensity）图 2A）。保存文件并将其命名为“stack file”。
- 如果成像文件包含多个通道，将其拆分为仅保留星形胶质细胞网络成像的通道（Image | Color | Split Channels）。
- 检查图像的像素设置 [图像 | 属性 | 像素（像素维度设为“1”）]。
- 使用减去背景工具（Process | Subtract Background）去除生物胞素标记的背景。使用预览功能设置滚球半径，通常设置为50像素（图2B).
- 如有需要，在减去背景步骤之后使用去除异常值工具（Process | Noise | Remove Outliers）。在“Which Outliers”设置中选择“Bright”图 2C）。使用预览功能设置半径和阈值。使用此工具时需谨慎，因为它可能会导致数据模糊，如图所示 图 2D.
注意：该工具可去除由链霉亲和素非特异性沉积引起的小斑点（如白色箭头所示） 图2B 和 2C 分别在治疗前和治疗后。 - 调整阈值（图像 | 调整 | 阈值）。选择“默认”和“B”&“W”模式（图 2E）。点击“Apply”。
注意：可以使用自动调整，但更推荐使用两个滑块进行手动调整。此步骤的目的是在不丢失任何标记细胞的前提下最大限度地降低背景噪声。 - 使用二值化处理工具将图像转换为二值图像（Process | Binary | Make Binary），如图所示 图 2F将文件保存为TIFF格式，并命名为“binary file”。
- 细胞计数
- 检查测量功能的设置（Analyze | Set Measurement）。选择“Centroid”选项。
- 在“二值图像”上使用“分析颗粒”工具（图 3A) 上一步骤（分析 | 分析颗粒）中生成的（图3C 在左侧）。在“显示”设置中选择“轮廓”（Outlines）图3C）。这将生成一个新文件，显示检测结果图3B).
- 调整参数：大小（若仅检测细胞，可使用30至6000之间的数值）和圆度（设定0到1之间的区间，其中“1”代表完美的圆形，“0”代表任意形状），以优化检测结果图3C，左侧部分）。单击“OK”开始检测。
注意：检测完成后将出现两个表格：1）标题为“Summary”的表格，提供检测到的细胞数量；2）标题为“Results”的表格图3C，右侧部分）提供每个细胞的x轴和y轴坐标。 - 将数值复制并粘贴到电子表格应用程序中。将此表格保存为“检测表”。同时将生成一个包含检测到的细胞图像的文件（图3B）。将此文件另存为名为“detection file”的TIFF文件。
- 如果网络中两个或更多标记的细胞因彼此过于接近，被“分析粒子”工具识别为单个细胞，则使用分水岭工具（Process | Binary | Watershed） 在二值图像上 在应用“分析颗粒”工具之前，重新执行“分析颗粒”的步骤。
注意：分水岭工具会在极为接近的细胞之间生成宽度为1像素的分界线。当标记明确无误时，可使用细胞计数插件进行分析，也可手动完成。
- 测量星形胶质细胞网络面积
- 使用 Image J 中的检测文件来测量网络的表面积。
- 使用多边形选择工具（在工具栏中左键单击该按钮以选中），勾勒一个连接网络外部边缘所有细胞的多边形图4A)。左键单击开始绘制多边形，右键单击闭合多边形。
注意：该多边形将被定义为感兴趣区域（ROI），其表面将被测量以确定网络的表面积。 - 打开测量设置窗口（Analyze | Set Measurements），选择“Area”选项。打开ROI管理器（Analyze | Tools | ROI Manager）图 4B）。然后，通过点击“Add”将绘制的多边形添加到ROI Manager中（图 4B）并点击 ROI 管理器中的“Measure”按钮运行测量。
注意：面积测量结果将显示在表格中，单位为像素。请勿忘记使用所用显微镜的转换系数将该数值转换为实际单位 μm2.
- 主方向向量的测定
- 确定已穿孔的细胞
- 在 ImageJ/FIJI 中打开堆栈文件，并根据标记信号强度较高来识别堆栈文件中的已记录细胞（图4C然后，在电子表格应用程序中打开名为“detection table”的文件，找到与 patched 细胞对应的编号及其坐标。
- 若无法准确确定已穿刺的细胞，可使用 ImageJ/FIJI 中的多边形工具，圈出成像的耦合细胞网络中生物胞素沉积较密集的区域，并将该位置视为已穿刺细胞的位置。图 4D).
- 使用 ROI Manager（分析 | 工具 | ROI Manager）。然后，在打孔细胞位置绘制一个 ROI，并将其添加到 ROI Manager 中（参见 图 4B).
- 设置测量（分析 | 设置测量），并选择“质心”选项。
- 在 ROI 管理器中，点击“Measure”以获取所追踪区域质心的坐标。将这些坐标用作该特定网络的参考点。
- 参照翻译
- 使用以下公式计算每个细胞相对于被记录星形胶质细胞的坐标：
使用：
作为特定细胞的坐标； 
作为打孔细胞（或网络的参考点）的坐标； 
作为新参考系中某个特定细胞的坐标。
注意：以所记录的星形胶质细胞为参考，表达每个细胞坐标的相对位置，是计算从该星形胶质细胞出发的向量的重要步骤。使用 ImageJ/Fiji 时需注意，任何图像的坐标参考点均位于图像的左上角。
- 使用以下公式计算每个细胞相对于被记录星形胶质细胞的坐标：
- 优势取向主矢量的测定
- 使用以下公式计算优势取向主矢量的坐标：
使用：(
作为优势取向主矢量的坐标； 
以膜片钳记录细胞为参照，获得网络中每个细胞的坐标。
注意：对于网络中的每个细胞，均根据 patched 星形胶质细胞的坐标确定一个矢量。网络优势取向的主矢量是所有这些矢量的总和。 - 将主向量的长度（由上述公式计算所得坐标确定）除以网络中细胞数量减一（由于记录细胞的坐标不包含在内），以标准化数值并实现不同网络间的比较。该分析的示意图如下所示 图5.
- 使用以下公式计算优势取向主矢量的坐标：
- 确定已穿孔的细胞
- 目标细胞核内分析网络的定位
- 20X 与 4X 图像的对齐
- 使用4倍图像确定目标核团（NVsnpr）在细胞核中的位置。使用矢量图像编辑器打开4倍图像。
- 选择4X图像，并将其尺寸乘以5进行放大。尺寸设置窗口位于顶部水平工具栏的右侧部分。例如，对于一幅采样分辨率为800 × 800像素的4X图像，应将采样分辨率更改为4000 × 4000像素（如需设置工作单位为像素，请在文件选项卡下的“文档设置”中进行调整：文件 | 文档设置）。将文件以TIFF格式导出，并命名为“resized 4X”。
- 将图像的左上角与 Adobe Illustrator 文档的左下角对齐。
注意：该软件提供的坐标以左下角为参考点。 - 打开20倍图像的网络图像。使用“二值文件”或“检测文件”，因为它们更容易对齐。然后，调整20倍图像“二值文件”的不透明度工具，使其与重新调整大小的4倍图像对齐。
注：不透明度工具位于顶部水平工具栏中。 - 当对齐完成后，选择并按住移液器工具，使测量工具出现，然后在左侧工具栏中选择该工具。
- 使用测量工具点击20倍图像的左上角，以获取20倍参考点在调整大小后的4倍图像上的坐标。
注：这些坐标被称为20倍参考坐标系（20XR） 图5），将有助于在细胞核示意图上标示每个网络的位置。
- 目标细胞核的归一化
注意：为了汇总数据，将核（NVsnpr）归一化为矩形。步骤如下所述。- 在 ImageJFIJI 中打开 4X 缩放后的文件，使用多边形工具圈选神经核团（NVsnpr）。若神经核团边界无法看清，可使用明场透射光图像进行定位；此时需先将其重新缩放。
- 打开 ROI 管理器并添加绘制的 ROI。在“设置测量”中，选择“外接矩形”选项。
注：“边界矩形”选项用于计算所绘制细胞核周围的最小矩形。 - 点击“测量”。
注意：表格中显示矩形左上角坐标的 BX 和 BY：“矩形位置”，并提供宽度和高度。BX 和 BY 是边界矩形参考系的坐标，其参考如下
和 
.
- 标准化细胞核中每个网络位点的表达
- 以4X参照系表示每个细胞的坐标（黑色方框内 图5）使用以下公式：
其中：
是细胞在4倍参考坐标系中的坐标； 
为使用20倍物镜参考的细胞坐标（橙色方框在 图5）；以及 
是4倍图像中20倍参考点的坐标（20XR）。 - 以边界矩形坐标系（蓝色）表示细胞坐标 图5）使用以下公式：
何处：
是边界矩形坐标系中的细胞坐标； 
是细胞在4X参考系中的坐标；以及 
是4X图像中边界矩形参考系的坐标。 - 使用以下公式将边界矩形坐标系中的细胞坐标转换为边界矩形宽度和高度的百分比：
其中：
是细胞在边界矩形的宽度和高度百分比中的坐标； 
是边界矩形坐标系中的细胞坐标； 
是上述实验步骤中测量的边界矩形的宽度；以及 
是上述方案中测量的边界矩形的高度。 - 为在同一图中表示所有网络，需考虑切片的方向（左侧或右侧）。为标准化数据，将参考系统一设于切片的左侧。通过仅对 x 坐标应用以下公式，将右侧网络的坐标转换至左侧：
何处：
是切片右侧的 x 坐标；以及 
是切片左侧参考系中表示的新x坐标。
注意：也可以在分析前使用 ImageJ/FIJI 镜像图片（图像 | 变换 | 水平翻转）。 - 为表达优势取向主矢量的坐标，需对细胞坐标执行相同的步骤（步骤 6.5.3.1 至 6.5.3.4）。
注：以百分比表示坐标值可将数据整合为单个图示，其中核团（NVsnpr）被描绘为矩形。
- 以4X参照系表示每个细胞的坐标（黑色方框内 图5）使用以下公式：
- 20X 与 4X 图像的对齐
- 优势方向主向量角度差异的研究
注意：星形胶质细胞网络的角度差用于确定其优势取向是否朝向感兴趣核团的中心。要计算角度差（α，在 图5），即网络优势方向主向量（PD，图中红线）与参考方向之间的夹角 图5）以及连接点 P 与 C 的直线，将余弦定理应用于三角形 PDC（见插图 图5 和 补充方法).- 首先，利用以下公式，通过将勾股定理应用于笛卡尔坐标系，计算出不同的长度：
其中：P 和 C 的坐标为
和 
分别位于边界矩形参考系（如上所述计算得出）中。 - 使用以下公式计算弧度制的角差：
- 将角度差转换为度数（例如， 使用 Excel 软件中的 DEGREES 函数。
- 通过垂直条形图绘制所有角度差异进行汇总图7C 和 7D）并确定星形胶质细胞网络是否存在优势取向。
- 首先，利用以下公式，通过将勾股定理应用于笛卡尔坐标系，计算出不同的长度：
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结果
脑内细胞间的耦合并非静态，而是受到多种因素动态调控。所描述的方法旨在分析不同条件下显现的星形胶质细胞网络，并理解其在NVsnpr中的组织方式。这些结果已发表1。我们在三种不同条件下，对NVsnpr背侧部单个星形胶质细胞进行生物胞素填充：静息状态（无任何刺激的对照条件）、无Ca2+环境，以及对投射至该核团的感觉纤维进行电刺激后。每种条件下星形胶质细胞生物胞素填充的实验设置如图6A-C左侧所示。
在对照条件下观察到生物胞素标记细胞的网络，证实了NVsnpr星形胶质细胞在静息状态下存在基础的细胞间偶联。在11个测试样本中，生物胞素扩散形成的网络由11 ± 3个细胞组成（图6A 中间图，图6D
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讨论
存在多种电生理学方法可用于评估星形胶质细胞之间的功能耦合23,24然而，这些方法无法提供有关星形胶质细胞网络解剖结构排列的信息。已有大量研究表明 "染料或示踪剂偶联"，如本研究中所示，仅发生在通过电生理方法检测到的部分偶联细胞中25,26,27，表明该方法检测到的细胞数量被低估。然而，这仍是观察偶联现象的最佳方法。当使用分子量小于1-1.2 KDa的示踪分子穿透间隙连接时，可获得更强的染料偶联。20通过监测荧光葡萄糖衍生物（2-NBDG）或荧光标记物（如某些Alexa染料或Lucifer Yellow）的扩散，可实现对耦合的活体可视化。13但由于其分子较小，生物胞素能产生更好的效果，并可在固定组织中进行定量分析。因此需注意，该...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院资助，资助/奖项编号：14392。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Chemicals | S671-3 | |
| KCl | Fisher Chemicals | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemicals | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Chemicals | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | |
| C6H12O6 无水葡萄糖 | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 二水合物 | Sigma | C70-500 | |
| 蔗糖 | Sigma | S9378 | |
| D-葡萄糖酸钾盐 | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 无水 | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris 盐 | Sigma | A9062 | |
| GTPTris 盐 | Sigma | G9002 | |
| 生物胞素 | Sigma | B4261 | |
| 甘珀酸二钠盐 | Sigma | C4790 | |
| 亲和素-生物素复合物：ABC试剂盒 | Vestor Laboratories | PK-4000 | |
| 链霉亲和素-Alexa 594 | Molecular Probes | S11227 | |
| 曲拉通 | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| 二甲苯 | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| 水性封片剂1：Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 甲苯基合成树脂封片剂：Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| 载玻片干燥台 | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| 振动切片机 | Leica | VT 1000S | |
| 显微镜盖玻片 | Fisherbrand | 12-544A | |
| 显微镜载玻片 ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| 多聚甲醛 | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 共聚焦显微镜 | Olympus | ||
| 40X 水浸物镜 | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 20X 水浸物镜 | Olympus | XLUMPLFL20XW | |
| 4X 水浸物镜 | Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P97 | |
| 显微操作器 | Sutter Instrument | MP 225 | |
| CCD相机 | Sony | CX-ST50 | |
| 黑白监视器 | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular Devices | 1322A | |
| 膜片钳放大器 | Axon Instrument | Mulitclamp 700A | |
| 电生理数据采集软件 | Molecular Devices | pClamp 8 | |
| 电生理数据分析软件 | Molecular Devices | Clampfit 8 | |
| 成像分析软件 | ImageJFIJI | 开源软件，包含插件包的FIJI版本 | |
| 矢量图像编辑器 | Adobe | Illustrator CS4 | |
| 电子表格应用程序 | Microsoft Office | Excel 2010 |
参考文献
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