在此，我们介绍一种实验方案 体内 GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）对初始CD4 T细胞（T细胞）活化、增殖及Th1分化的检测。此外，本方案还描述了骨髓及T细胞的分离、树突状细胞的生成，以及树突状细胞与T细胞的过继性转移。
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本文内容
摘要
摘要
初始CD4 T细胞活化、增殖及其向辅助性T细胞1（Th1）分化的定量分析是评估T细胞在免疫应答中作用的有效方法。本方案描述了 体外 骨髓（BM）前体细胞分化为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导的树突状细胞（DCs）。该方案还描述了将负载卵清蛋白肽（OVAp）的GM-CSF来源DCs及来自OTII转基因小鼠的初始CD4 T细胞进行过继转移，以分析 体内 活化、增殖及转输的CD4 T细胞向Th1的分化。该方案克服了单纯 体内 因无法特异性地操控或筛选目标细胞群体而受到限制的方法。此外，本方案还允许在 体内 环境，从而避免可能发生的功能性因素改变 体外 并包含完整器官中特有的细胞类型及其他因素的影响。该方案是研究树突状细胞（DCs）和T细胞变化的有力工具，可调节适应性免疫应答，有望为理解多种免疫相关疾病的起源或发展提供重要结果。
引言
CD4 T细胞和树突状细胞（DCs）等抗原呈递细胞（APCs）是介导针对微生物病原体免疫反应所必需的成分1,2。在外周淋巴器官中，CD4 T细胞通过识别APC呈递的特异性抗原而被激活3,4,5。活化的CD4 T细胞增殖并分化为具有特定功能的效应性Th细胞，这些细胞对于正确适应性免疫应答的建立至关重要6,7。对这些过程的调控对于产生有效的适应性免疫防御至关重要，既能清除病原体，又避免造成有害的组织损伤8。Th细胞根据其表面分子、转录因子和效应细胞因子的表达或产生情况进行分类，并在应对病原体时发挥必要且精确的功能1。Th1细胞亚群表达转录因子T-bet和细胞因子干扰素γ（IFNγ），参与宿主对胞内病原体的防御1。对初始CD4 T细胞的活化、增殖及Th1分化进行定量分析，是评估T细胞在免疫应答中作用的有效手段。
本方案可实现....
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方案
实验方案经卡洛斯三世国家心血管研究中心基金会（CNIC）和马德里自治区政府批准，符合西班牙及欧洲的指导方针。小鼠在特定无病原体（SPF）条件下饲养，并通过吸入二氧化碳（CO2）实施安乐死。
1. 从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓细胞
注意：C57BL/6 同源近交小鼠品系携带差异性白细胞标记 Ptprca，通常称为 CD45.1 或 Ly5.1；而野生型 C57BL 品系携带 Ptprcb 等位基因，即 CD45.2 或 Ly5.2。可通过流式细胞术利用特异性抗体区分 CD45.1 与 CD45.2 亚型。CD45.1、CD45.2 以及 CD45.1/CD45.2 小鼠均可作为细胞供体或过继性转移的受体，从而利用流式细胞术追踪不同细胞群体。建议优先选用年龄和性别匹配、且年龄小于 12 周的雄性或雌性小鼠。
- 股骨和胫骨的制备
- 按照机构动物护理委员会批准的方案对小鼠实施安乐死。
- 用70%乙醇喷洒动物体表，对后肢进行消毒。
- 使用无菌剪刀、镊子和手术刀。用手术刀在皮肤上切开，并去除包括后肢覆盖皮肤在内的小鼠远端皮肤。剥离小腿肌肉周围的皮肤，并完全将皮肤从腿部去除（图2....
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结果
图1 展示了本方案中所述的步骤。 图2 展示了小鼠骨髓细胞的分离与培养。在这些培养物中加入GM-CSF和LPS可使 体外 树突状细胞的生成与成熟 图3 展示了所获得的树突状细胞（DCs）分化与成熟的流式细胞术分析。将负载OVAp的GM-CSF诱导的骨髓来源DCs与经活细胞示踪染料标记的CD4/OTII T细胞过继转移至小鼠体内。 图4 显示用于分离CD4/OTII T细胞的淋巴结位置。 图5 显示一个配有 70 µm 尼龙滤膜和注射器活塞用于匀浆淋巴结和脾脏。 图6 显示将CD4/OTII T细胞经尾静脉注射至眶后丛，以及将负载OVAp的GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）皮下注射至足垫。CD.......
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讨论
本方案可用于表征骨髓来源树突状细胞（BM-derived DCs）调控初始CD4 T细胞活化、增殖和分化的潜能。此外，该方案也可用于评估CD4 T细胞对骨髓来源树突状细胞调控作用的敏感性。利用本方案，可体内（in vivo）检测上述事件的变化。
根据所研究的假设，可以使用多种T细胞与树突状细胞（DC）的组合。例如，可分析特定基因的敲入或敲除对CD4 T细胞活化、增殖或Th1分化的效应，或评估特定刺激诱导CD4 T细胞反应的效率。这些操作可在DC、CD4 T细胞或两种细胞上分别进行。因此，可将来自野生型或基因修饰小鼠的CD4 T细胞与来自野生型小鼠的DC相结合，反之亦然。
本方案可通过流式细胞术和抗CD45.1与CD45.2抗体来区分不同细胞群体的来源。实际上，CD45.1/CD45.1和CD45.2/CD45.2小鼠可作为所用任何细胞类型的供体，或作为过继转移实验中的受体，二者可任意组合使用。例如，CD4 T细胞可来源于CD45.1/CD45.1/OTII小鼠，而CD45.2/CD45.2小鼠则可作为树突状细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
感谢 Simon Bartlett 博士在英文编辑方面提供的帮助。本研究获得了卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III，ISCIII）基金（PI14/00526；PI17/01395；CP11/00145；CPII16/00022）、Miguel Servet 计划和拉蒙·阿雷塞斯基金会（Fundación Ramón Areces）的资助，并由欧洲区域发展基金（Fondo Europeo de Desarrollo Regional，FEDER）共同资助。国家心血管研究中心（CNIC）由经济、工业和竞争力部（Ministerio de Economía, Industria y Competitividad，MEIC）、Pro CNIC 基金会支持，并被认定为 Severo Ochoa 卓越研究中心（SEV-2015-0505）。RTF 由拉蒙·阿雷塞斯基金会和 CNIC 资助，VZG 由 ISCIII 资助，BHF 由 12 de Octubre 医院健康研究研究所（Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre，imas12）资助，JMG-G 由 ISCIII Miguel Servet 计划和 imas12 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙醇 | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| 剪刀 | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| 镊子 | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| 手术刀 | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | 100片装刀片 |
| 胎牛血清 | SIGMA | F7524 | |
| 青霉素/链霉素 | LONZA | DE17-602E | |
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI） | GIBCO | 21875-034 | |
| 无菌培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 25号针头 | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml 注射器 | Novico | N15663 | |
| 15 ml 锥形管 | Falcon | 352096 | |
| 50 ml 锥形管 | Falcon | 352098 | |
| 70 μm 尼龙网滤器 | BD Falcon | 352350 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | SIGMA | R7757 | 100 ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| 牛血清白蛋白 | SIGMA | A7906 | 100 g |
| 台盼蓝 | SIGMA | 302643-25G | |
| 培养板 | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES） | Cambrex | BE17-737E | |
| β-巯基乙醇 | Merck | 8-05740-0250 | |
| 丙酮酸钠 | LONZA | BE13-115E | |
| L-谷氨酰胺 | LONZA | BE17-605E | |
| 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） | Prepotech | 315-03 | |
| 脂多糖（LPS） | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96孔板 | Costar | 3799 | |
| v450 标记抗小鼠 CD11b 抗体 | BD Biosciences | 560455 | |
| PE 标记抗小鼠 CD64 抗体 | BioLegend | 139303 | |
| PE 标记抗小鼠 CD115 抗体 | BioLegend | 135505 | |
| FITC 标记抗小鼠 CD11c 抗体 | BioLegend | 117305 | |
| FITC 标记抗小鼠 MHCII 抗体 | BioLegend | 125507 | |
| APC 标记抗小鼠 CD86 抗体 | BioLegend | 105011 | |
| APC 标记抗小鼠 CD80 抗体 | BioLegend | 104713 | |
| 流式细胞仪管 | Zelian | 300800-1 | PS 12×75 5 mL |
| OTII 卵清蛋白肽 | InvivoGen | 323-339 | |
| 生物素化抗小鼠 CD8α 抗体 | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| 生物素化抗小鼠 IgM 抗体 | BioLegend | 406503 | |
| 生物素化抗小鼠 B220 抗体 | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| 生物素化抗小鼠 CD19 抗体 | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| 生物素化抗小鼠 MHCII (I-Ab) 抗体 | BioLegend | 115302 | |
| 生物素化抗小鼠 CD11b 抗体 | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| 生物素化抗小鼠 CD11c 抗体 | BioLegend | 117303 | |
| 生物素化抗小鼠 CD44 抗体 | BioLegend | 103003 | |
| 生物素化抗小鼠 CD25 抗体 | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| 生物素化抗小鼠 DX5 抗体 | BioLegend | 108903 | |
| 链霉亲和素包被的磁珠 | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| 磁性细胞分选仪 | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS 分选仪 |
| 分离柱 | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE 标记抗小鼠 CD4 抗体 | BioLegend | 100408 | |
| APC 标记抗小鼠 CD3 抗体 | BioLegend | 100235 | |
| FITC 标记抗小鼠 CD8 抗体 | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet 示踪剂 | Thermofisher | C34557 | |
| APC 标记抗小鼠 CD25 抗体 | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 标记抗小鼠 CD69 抗体 | BioLegend | 104518 | |
| PerCP-Cy5.5 标记抗小鼠 CD45.1 抗体 | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC 标记抗小鼠 CD45.1 抗体 | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PE-Cy7 标记抗小鼠 CD45.1 抗体 | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC 标记抗小鼠 CD45.2 抗体 | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| 离子霉素 | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| 佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（PMA） | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A（BD GolgiPlug） | BD | 555029 | |
| 多聚甲醛 | Millipore | 8-18715-02100 | |
| 细胞内透化缓冲液 | eBioscience | 00-8333 | |
| APC 标记抗小鼠 IFNγ 抗体 | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc阻断剂（抗小鼠 CD16/CD32） | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 小鼠 | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ 细胞分析仪 | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI 溶液 | Thermofisher | 62248 |
参考文献
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lym....
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重印与许可
