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方法文章

1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

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DOI：

10.3791/58135

⸱

2018年8月20日

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University

本文内容

摘要

一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。

摘要

本报告重点介绍一种N端1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成方法，以及对其形成的自组装超分子结构的表征。该合成路线采用固相肽合成法，在树脂上将二硫杂环戊烷前体分子3-(乙酰硫基)-2-(乙酰硫甲基)丙酸与肽链偶联，并在肽链从树脂上最终裂解之前，利用微波辅助去除N端硫乙酸保护基，从而获得1,2-二硫杂环戊烷修饰的肽。通过高效液相色谱（HPLC）纯化得到源自阿尔茨海默病相关Aβ肽成核核心的1,2-二硫杂环戊烷修饰肽后，该肽可自组装形成交叉-β结构的淀粉样纤维。本文提供了利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、圆二色光谱（CD）和透射电子显微镜（TEM）对淀粉样纤维进行表征的实验方案。目前，可将N端引入1,2-二硫杂环戊烷基团的方法应用于已有明确特征的自组装肽体系，作为模型系统，用于开发组装后修饰策略，并探索超分子肽纳米纤维表面的动态共价化学。

引言

固相肽合成中涉及的稳定肽键形成化学，以及对肽序列长度和组成的可控性，使得能够自组装形成超分子结构的肽成为被广泛研究的领域。控制和稳定肽自组装结构的因素，包括侧链空间位阻和静电相互作用、氢键以及疏水效应1，构成了一套设计原则。随着对这些基本设计原则的研究不断深入，肽自组装的逻辑下一步是拓展基于肽的结构和功能的多样性。尽管通过调节肽序列或组装条件，自组装肽已被用作多种生物医学应用中的多功能生物材料2,3,4，但针对肽纳米纤维在组装后进行修饰的策略开发5,6,7,8,9仍是一个相对未被充分探索的领域。

在超分子结构表面发生的动态二硫键交换与巯基化学反应，是有望开发新型功能性生物材料的研究领域之一。已有研究报道将1,2-二硫戊环基团（通常为硫辛酸（la）或天冬蒜氨酸（aa）的衍生物）引入脂质体系统10,11、嵌段共聚物12,13，以及作为表面有序锚定基团14,15。本文中，我们报道了一种自组装肽的设计与表征，该肽源自与阿尔茨海默病相关的Aβ肽成核核心，并在其N端修饰了1,2-二硫戊环功能基团16,17。所形成的超分子纤维现可作为实验平台，用于研究淀粉样纤维超分子表面的二硫键交换及巯基反应活性18。

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方案

1. 1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成与纯化

  1. 二硫环前体 3-(乙酰硫基)-2-(乙酰硫甲基)丙酸的合成19
    1. 将 1 g 3-溴-2-(溴甲基)丙酸（1 当量）溶于少量 1 M NaOH（约 4 mL）中，加入 25 mL 圆底反应瓶，于 55 °C 搅拌。用隔垫密封反应瓶，并置于氮气氛围下。
    2. 配制含 1.49 g 硫代乙酸钾（3.2 当量）的溶液，溶于 4 mL 去离子水和 3 mL 2 M 硫酸（H2SO4）中，原位生成硫代乙酸 in situ。
    3. 用一次性塑料 10 mL 注射器吸取硫代乙酸溶液，并在注射器上安装针头。通过针头穿刺隔垫，将溶液逐滴加入反应瓶中。在 55 °C 下继续反应过夜。
    4. 使用甲醇与二氯甲烷（1:9）混合液作为展开剂，在硅胶 60 F254 薄层色谱板上监测反应进程。用溴甲酚绿染色显色。产物的 Rf = 0.57。
    5. 反应完成后冷却至室温，用 2 M H2SO4 将混合物酸化至 pH 1。有黄色油状物析出。
    6. 用冷氯仿（40 mL × 3）萃取产物。合并有机相，用硫酸镁干燥。减压除去氯仿。
    7. 通过核磁共振（NMR）波谱法确认分离产物 1 的结构，如 图 1B 和 C 所示。预期结果如下：1H NMR，CDCl3，300 MHz：δ = 10.1（宽峰，1 H），3.2（多重峰，4 H），2.9（多重峰，1 H），2.4（单峰，6 H）；13C NMR，CDCl3，75 MHz：δ = 195.1（CH3COS-），177.6（-COOH），45.1（-CH2S-），30.5（CH），29.2（-SCOCH3）。
      注：产物为黄色油状物，总收率为 83%。无需进一步纯化即可使用。
  2. 固相肽合成及二硫环前体的树脂上偶联
    注：以下所述固相肽合成在自动肽合成仪上进行，遵循制造商推荐的操作流程。可根据其他商用仪器或特殊氨基酸的使用情况调整设置和试剂。
    1. 称取 0.156 g Rink 酰胺 4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂（0.1 mmol），置于反应容器中。在合成开始前，用二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂至少 15 分钟。
    2. 按序列称取每种芴甲氧羰基（Fmoc）保护氨基酸 4 当量（0.4 mmol），以及每种氨基酸对应的 0.152 g N,N,N’,N’-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)六氟磷酸铀（0.4 mmol，HBTU）。每个试剂盒均包含 Fmoc 保护氨基酸和 HBTU。
    3. 在合成仪上完成所有合成前检查（补充试剂、冲洗试剂管线、为所有试剂瓶加压）后，将氨基酸试剂盒按 C’ 到 N’ 末端方向放入转盘中。在最后一个氨基酸位置后放置一个空试剂盒，用于最终的 N 端 Fmoc 脱保护步骤。
    4. 使用推荐的标准设置合成肽段。
      1. 用 5 mL 含 20% 哌啶的 DMF 溶液脱除树脂上的 Fmoc 保护基（5 分钟 × 2 次）。
      2. 偶联前用 DMF 洗涤树脂（6 × 5 mL）。
      3. 单次偶联步骤中，向含 Fmoc 保护氨基酸和 HBTU 的混合物中加入 4 mL 0.4 M N-甲基吗啉 DMF 溶液。活化 Fmoc 保护氨基酸溶液 30 秒后转移至反应容器。
        注：自动肽合成仪在偶联反应期间，每 30 秒通入 N2 气体鼓泡搅拌 20 分钟。若为手动合成，将反应容器置于轨道摇床上，以低速持续振荡完成偶联步骤。
      4. 排尽溶液，用 DMF 洗涤树脂（3 × 5 mL）。
      5. 按 C’ 到 N’ 末端方向，对序列中每个 Fmoc 保护氨基酸重复步骤 1.2.4.1 至 1.2.4.4，以合成目标肽段。
    5. 完成最终 N 端脱保护后，将树脂转移至一次性带滤膜注射器中。用 DMF（3 × 5 mL）和二氯甲烷（DCM，3 × 5 mL）洗涤树脂。
      注：DCM 洗涤后，树脂可在真空干燥器中储存。若此前已储存，偶联前需确保用 DMF 充分溶胀树脂。
    6. 将二硫环前体（1）偶联至树脂上肽链的 N 端：加入 4 当量的 1、5 mL DMF、4 当量 HBTU 和 10 当量 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）。将偶联混合物预活化 10 分钟后，加入含树脂的滤膜注射器中。
    7. 振荡偶联反应 2 小时。2 小时后，用 DMF（3 × 5 mL）洗涤树脂，并重复偶联反应，继续振荡过夜。
    8. 第二次偶联完成后，用 DMF（3 × 5 mL）和 DCM（3 × 5 mL）洗涤树脂。
      注：此时可将树脂在真空条件下储存，直至裂解。
  3. 硫代乙酸脱保护及肽段从树脂上裂解
    1. 为脱除 N 端二硫环前体上的硫代乙酸保护基，将干燥的树脂转移至 10 mL 微波反应管中，加入 2 mL DMF。使树脂溶胀，加入小磁力搅拌子，低速磁力搅拌重悬 15 分钟。
    2. 加入 2 mL 浓氨水，用硅胶隔垫密封反应管，将反应管放入微波反应器中，在 75 °C 条件下搅拌反应 45 分钟。
    3. 微波反应完成后，将树脂转移至洁净的一次性带滤膜注射器中。用 DMF（2 × 5 mL）和甲醇（MeOH，2 × 5 mL）洗涤。
    4. 加入浓氨水与甲醇（1:4）的混合溶液，总体积为 5 mL。振荡过夜，以促进二硫环内二硫键的分子内氧化。
    5. 用 MeOH（2 × 5 mL）和 DCM（3 × 5 mL）洗涤树脂。
      注：此时可将干燥的树脂在真空干燥器中储存。
    6. 向含树脂的注射器中加入裂解液，轻轻振荡 1.5 小时。所用裂解液为 95% 三氟乙酸（TFA）、2.5% 三异丙基硅烷（TIPS）和 2.5% 水，总体积为 5 mL。
      警告：仅可在通风橱中操作。TFA 具有挥发性和腐蚀性。
      注：对于大多数肽序列和氨基酸侧链保护基，上述裂解液已足够；但对于某些氨基酸侧链保护基（特别是含 Cys、Met、Trp 和 Arg 的肽段）或其他树脂化学体系，可能需要使用其他裂解液20。
    7. 将粗肽通过带滤膜注射器逐滴加入含 25 mL 冷乙醚的 50 mL 锥形管中进行沉淀。肽段以白色固体析出。在 1300 × g 条件下离心 10 分钟收集肽沉淀。小心倾去乙醚至废液容器中。
    8. 向锥形管中加入另 25 mL 乙醚，涡旋重悬沉淀。再次在 1300 × g 条件下离心 10 分钟，倾去乙醚。真空干燥沉淀。
  4. 1,2-二硫环修饰肽的纯化
    注：通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化粗肽。收集并合并肽峰，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认分子量。
    1. 将粗肽沉淀溶于少量含 0.1% TFA 的乙腈中。由于肽段具有疏水性和聚集倾向，可在 40 °C 下温和加热以助溶解。
      注：避免高温或超声处理，以防发生潜在的二硫键交换反应21,22,23。
    2. 为准备 1 mL 用于 HPLC 纯化的粗肽溶液，将 400 μL 浓缩的乙腈肽储备液加入含 600 μL 含 0.1% TFA 的 H2O 中，经 22 μm 注射器滤器过滤后转入 HPLC 进样瓶。可额外加入 5% 异丙醇以防止肽段聚集和沉淀。
    3. 使用 C-18 半制备柱，以乙腈/水线性梯度（20 分钟内从 15% 升至 55%）进行肽段纯化，流速为 3 mL/min。设置紫外检测器在 222 nm（肽键骨架）和 330 nm（二硫键）处检测。收集并合并目标峰（图 2A）。
    4. 采用反射模式 MALDI-TOF 质谱仪确认肽产物的分子量（图 2B）。分析时，将 0.5 μL 收集的峰样品与 0.5 μL 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质（10 mg/mL DHB 溶于含 0.1% TFA 的 50% 乙腈溶液）混合点样于 MALDI 板上。
      注：MALDI-TOF 质谱中常见的加合物包括钠盐和钾盐加合峰（[M+Na]+ 和 [M+K]+）。若盐加合峰抑制主峰 [M+H]+ 信号，建议在分析前对样品进行脱盐处理。此外，在 1,2-二硫环修饰肽中也可检测到氧化峰 [M+O]+。有研究报道，使用 DHB 基质时 MALDI 电离过程可能引发激光诱导氧化，可通过调节样品浓度、溶剂和激光强度等因素减少该类氧化伪影24。
    5. 经 MALDI-TOF 确认分子量正确后，将肽溶液快速冷冻并冻干。将冻干肽粉在真空条件下保存，直至后续使用。

2. 超分子自组装结构的表征

  1. 淀粉样纤维的形成
    1. 制备自组装溶液时，使用分析天平称取1 mg肽类粉末。将其溶解于1.5 mL微量离心管中的混合溶液（pH 7.5）中，该混合液由20%乙腈和10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）组成，最终肽浓度为1 mg/mL的组装混合液。涡旋混匀组装溶液后，于室温下静置使其自组装。
  2. 淀粉样纤维的光谱表征
    1. 每隔几天通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）监测肽的组装过程。样品中未组装肽的红外特征表现为约1670 cm-1处的一个宽峰17。肽组装样品通常需要一到两周时间，该宽峰才会消失并达到成熟状态。
      1. 取8–10 μL组装溶液，将其作为薄层干燥于ATR金刚石晶体表面。在薄膜干燥过程中，监测1640至1630 cm-1范围内强而宽的水峰的消失情况。
      2. 采集1500–1800 cm-1范围内的红外光谱，平均扫描50次，分辨率为2 cm-1。每次样品扫描前，需先采集并扣除背景信号。β-折叠结构的红外特征为1625至1635 cm-1之间的尖锐峰（图3A）25,26。
    2. 利用圆二色光谱（CD）对肽组装形成的富含β-折叠的超分子结构进行表征。使用配备帕尔帖温控系统的CD圆二色光谱仪记录光谱。
      1. 将30 μL组装溶液加入光程为0.1 mm的微型比色皿中。
        注：需使用比色皿支架来夹持并定位短光程比色皿。
      2. 设置CD仪器参数如下：扫描波长范围为300 nm至180 nm，扫描速率为100 nm/min，带宽为1 nm，温度为25 °C，每次采集三次扫描的平均值。
      3. 采集缓冲液（20%乙腈/10 mM HEPES，pH 7.5）的光谱，并从每个样品光谱中扣除，作为对照。β-折叠结构的CD特征为约220 nm处的椭圆率最小值（图3B）27。
  3. 淀粉样纤维的显微镜观察
    1. 让肽样品静置两到三周，使其成熟为富含β-折叠的超分子结构。
      注：在组装过程的早期阶段也可使用透射电子显微镜（TEM）对组装体进行成像。
      1. 将10 μL肽组装溶液滴加至TEM碳支持膜载网上。
        注：注意勿使移液枪头接触载网表面。制样过程中应使用高精度自闭合镊子夹持TEM载网。
      2. 静置1–2分钟，使组装体吸附至载网表面。用滤纸轻触载网边缘，吸除多余液体。
      3. 通过向市售的4%醋酸铀酰溶液中加入100 μL去离子水，配制2%醋酸铀酰染色液。将10 μL 2%醋酸铀酰染色液滴加至载网表面，染色2–3分钟。染色后，用滤纸轻触载网边缘，吸除多余染色液。
      4. 将TEM载网置于真空干燥器中过夜。成像前保持真空储存。
      5. 使用透射电子显微镜对制备好的样品进行成像（图3C）。典型的显微镜参数如下：放大倍数范围为9,300X至23,000X，采用钨灯丝，加速电压为120 kV。
        注：可使用ImageJ软件测量所获TEM图像中超分子结构的平均纤维宽度28。
        警告：使用前请查阅所有相关化学品的安全数据表（SDS）。本实验中所涉及的1,2-二硫戊环修饰自组装肽的合成、纯化与表征过程中使用的多种化学品具有腐蚀性或毒性，必须在通风橱内操作。实验时务必穿戴适当的个人防护装备（包括护目镜、实验服、长裤和不露脚趾的鞋子）。

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结果

除了二硫戊环前体分子的初始一步合成外，其余1,2-二硫戊环修饰肽的合成均在固相载体上进行（图1A）。在将该二硫戊环前体偶联至仍连接在树脂上的肽链游离N端氨基之前，需通过1H和13C核磁共振（NMR）确认3-溴-2-(溴甲基)丙酸转化为3-(乙酰巯基)-2-(乙酰巯甲基)丙酸（图1B和C）。使用氢氧化铵在微波反应器中将硫代乙酰基脱保护生成巯基，随后在甲醇中过夜氧化形成1,2-二硫戊环，之后将1,2-二硫戊环修饰的肽从树脂上裂解下来。粗产物肽通过反相高效液相色谱（HPLC）纯化（图2A），并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认产物分子量（图2B）。

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讨论

本文详细讨论了一种N端1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与纯化方法，以及所形成的超分子结构的表征。本文报道的1,2-二硫杂环戊烷肽的合成具有多项优势，包括通过一步合成法制备二硫杂环戊烷前体3-(乙酰硫基)-2-(乙酰硫甲基)丙酸，以及在树脂上采用微波辅助去保护反应，使用氢氧化铵作为更安全的试剂去除前体上的硫代乙酰基保护基，从而生成氧化态的1,2-二硫杂环戊烷结构单元，替代了先前报道中使用的有毒肼类去保护方法29。该1,2-二硫杂环戊烷肽的整体固相合成路线（图1A）可通过改变序列长度和组成进行灵活调整，例如引入Fmoc保护的非天然氨基酸，或改变C端树脂化学，以适应多种不同的研究应用需求。

为了防止具有亲核侧链的氨基酸或带有保护基团的氨基酸在反应中产生不需要的肽副产物，应在裂解混合液中加入额外的捕获剂20。在进行树脂上微波去保护步骤之前，可先对少量树脂（少于总树脂量的10%）进行测试性裂解，以确保偶联反应具有高产率。根据本报告...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢康涅狄格州立学院与大学（CSCU）纳米技术中心的 B. Ellen Scanley 博士在透射电子显微镜（TEM）使用方面的技术培训与帮助，以及卫斯理大学的 Ishita Mukerji 博士提供使用其圆二色光谱仪的权限。本研究所报告的工作部分得到了费尔菲尔德大学科学研究所、美国国家航空航天局康涅狄格太空资助联盟以及美国国家科学基金会（资助号 CHE-1624774）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高载量 Rink 酰胺 MBHA 树脂Gyros Protein TechnologiesRAM-5-HL避免接触皮肤和眼睛；切勿吸入
N,N-二甲基甲酰胺Fisher ScientificD119-4易燃液体和蒸气；对眼睛和皮肤有刺激性；使用个人防护装备；远离明火
Fmoc-L-缬氨酸-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-V佩戴个人防护装备；切勿吸入
Fmoc-L-亮氨酸-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-L佩戴个人防护装备；切勿吸入
Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-KBC佩戴个人防护装备；切勿吸入
Fmoc-L-苯丙氨酸-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-F佩戴个人防护装备；切勿吸入
Fmoc-L-丙氨酸-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-A佩戴个人防护装备；切勿吸入
Fmoc-L-谷氨酰胺(Trt)-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-QT佩戴个人防护装备；切勿吸入
N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐Gyros Protein Technologies26432引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激；切勿吸入；在通风橱或通风良好区域使用
DMF 中 0.4 M N-甲基吗啉溶液Gyros Protein TechnologiesPS3-MM-L高度易燃；佩戴个人防护装备；远离热源并保持容器密闭；切勿吸入或吞咽；操作后彻底清洗皮肤
DMF 中 20% 哌啶溶液Gyros Protein TechnologiesPS3-PPR-L引起严重眼和皮肤灼伤；易燃液体和蒸气；切勿吸入
二氯甲烷Fisher ScientificD37-4可能致癌；切勿吸入；佩戴个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，用水冲洗至少15分钟并立即就医
乙腈Fisher ScientificA998-4易燃；对眼睛有刺激性；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；远离明火或高温表面；若接触，用水冲洗至少15分钟并立即就医
三氟乙酸Fisher ScientificA116-50引起严重灼伤；切勿吸入；对水生生物有害；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，立即用水冲洗至少15分钟并立即就医
4% 醋酸铀酰Electron Microscopy Sciences22400-4切勿吸入；对水生生物有害
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸Acros OrganicsAC172571000切勿吸入；在室外或通风良好区域使用
氮气TechAir内压容器，受热可能爆炸
3-溴-2-(溴甲基)丙酸Alfa AesarAAA1963014切勿吸入；引起皮肤和眼睛刺激；具腐蚀性
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医
硫代乙酸钾Acros OrganicsAC221300250引起皮肤和眼睛刺激；切勿吸入；使用个人防护装备
硫酸Fisher ScientificSA213引起灼伤；远离水；远离可燃物；切勿吸入；使用个人防护装备；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医
氘代氯仿Acros OrganicsAC320690075可能致癌；对皮肤和眼睛有刺激性；切勿吸入；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医
氯仿Fisher ScientificC298-4可能致癌；对皮肤和眼睛有刺激性；切勿吸入；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医
N,N-二异丙基乙胺Acros OrganicsAC367841000高度易燃；对水生生物有害；佩戴个人防护装备；切勿吞咽
氢氧化铵Fisher ScientificA669S-500具腐蚀性；切勿吸入
甲醇Fisher ScientificA452-4易燃液体和蒸气；使用个人防护装备；切勿吸入；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医
三异丙基硅烷Sigma Aldrich233781易燃；使用个人防护装备；保持容器密闭
乙醚Fisher ScientificE138-1极易燃；对皮肤和眼睛有刺激性；使用个人防护装备
2,5-二羟基苯甲酸Sigma Aldrich39319-10x10MG-F切勿吸入；对皮肤和眼睛有刺激性
α-氰基-4-羟基肉桂酸Alfa AesarAAJ67635EXK
C18 Zip-TipMilliporeZTC18S096
三(2-羧乙基)膦盐酸盐Thermo ScientificPI20490
硅胶60 F254 涂层铝背板薄层色谱板EMD Millipore1.05549.0001
薄壁精密核磁管Bel-Art663000585外径5 mm
全塑料 Norm-Ject 注射器Air TiteAL10
一次性针头BD PrecisionGlideBD 305185使用后的针头应放入锐器废物容器中处理
一次性带砂芯注射器TorviqSF1000LL报告中使用了10 mL带砂芯注射器，但若需更大规模合成，也可使用更大规格的注射器
碳支持膜铜网Ted Pella, Inc.CF200-CU务必在碳膜面制备样品和染色，而非铜网的光亮面
自闭合镊子Electron Microscopy Sciences78318-3X尖端非常锋利，长度：120 mm
0.1 mm 短光程比色皿Starna Cells, Inc.20/C-Q-0.1易碎
10 mL 容器盖CEM909210
10 mL 压力容器CEM908035
Aeris 半制备型 HPLC 色谱柱Phenomenex00F-4632-N0150 × 10 mm
比色皿支架Starna Cells, Inc.CH-2049使用短光程比色皿时需要
PS3 多肽合成仪Gyros Protein Technologies
DiscoverSP 微波反应器CEM
离心机HERMLEZ 206 A使用固定式6×50 mL转子
高效液相色谱仪Shimadzu紫外检测器
核磁共振波谱仪Avance, Bruker300 MHz
MALDI-TOF 质谱仪Axima Confidence, Shimadzu
冷冻干燥机Millrock TechnologyBT85A
傅里叶变换红外光谱仪Alpha Tensor, Bruker
透射电子显微镜Tecnai Spirit, FEI配备 Gatan Orius 光纤CCD数码相机。在中国台湾 CSCU 纳米技术中心使用
圆二色光谱仪J-810, JASCO配备六槽帕尔帖温控装置。在中国台湾卫斯理大学使用

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1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征
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