一种1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成方案及其自组装形成的超分子结构的表征。
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摘要
摘要
本报告重点介绍一种N端1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成方法，以及对其形成的自组装超分子结构的表征。该合成路线采用固相肽合成法，在树脂上将二硫杂环戊烷前体分子3-(乙酰硫基)-2-(乙酰硫甲基)丙酸与肽链偶联，并在肽链从树脂上最终裂解之前，利用微波辅助去除N端硫乙酸保护基，从而获得1,2-二硫杂环戊烷修饰的肽。通过高效液相色谱（HPLC）纯化得到源自阿尔茨海默病相关Aβ肽成核核心的1,2-二硫杂环戊烷修饰肽后，该肽可自组装形成交叉-β结构的淀粉样纤维。本文提供了利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、圆二色光谱（CD）和透射电子显微镜（TEM）对淀粉样纤维进行表征的实验方案。目前，可将N端引入1,2-二硫杂环戊烷基团的方法应用于已有明确特征的自组装肽体系，作为模型系统，用于开发组装后修饰策略，并探索超分子肽纳米纤维表面的动态共价化学。
引言
固相肽合成中涉及的稳定肽键形成化学，以及对肽序列长度和组成的可控性，使得能够自组装形成超分子结构的肽成为被广泛研究的领域。控制和稳定肽自组装结构的因素，包括侧链空间位阻和静电相互作用、氢键以及疏水效应1，构成了一套设计原则。随着对这些基本设计原则的研究不断深入，肽自组装的逻辑下一步是拓展基于肽的结构和功能的多样性。尽管通过调节肽序列或组装条件，自组装肽已被用作多种生物医学应用中的多功能生物材料2,3,4，但针对肽纳米纤维在组装后进行修饰的策略开发5,6,7,8,9仍是一个相对未被充分探索的领域。
在超分子结构表面发生的动态二硫键交换与巯基化学反应，是有望开发新型功能性生物材料的研究领域之一。已有研究报道将1,2-二硫戊环基团（通常为硫辛酸（la）或天冬蒜氨酸（aa）的衍生物）引入脂质体系统
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方案
1. 1,2-二硫杂环戊烷修饰肽的合成与纯化
- 二硫环前体 3-(乙酰硫基)-2-(乙酰硫甲基)丙酸的合成19
- 将 1 g 3-溴-2-(溴甲基)丙酸（1 当量）溶于少量 1 M NaOH（约 4 mL）中，加入 25 mL 圆底反应瓶，于 55 °C 搅拌。用隔垫密封反应瓶，并置于氮气氛围下。
- 配制含 1.49 g 硫代乙酸钾（3.2 当量）的溶液，溶于 4 mL 去离子水和 3 mL 2 M 硫酸（H2SO4）中，原位生成硫代乙酸 in situ。
- 用一次性塑料 10 mL 注射器吸取硫代乙酸溶液，并在注射器上安装针头。通过针头穿刺隔垫，将溶液逐滴加入反应瓶中。在 55 °C 下继续反应过夜。
- 使用甲醇与二氯甲烷（1:9）混合液作为展开剂，在硅胶 60 F254 薄层色谱板上监测反应进程。用溴甲酚绿染色显色。产物的 Rf = 0.57。
- 反应完成后冷却至室温，用 2 M H2SO4 将混合物酸化至 pH 1。有黄色油状物析出。
- 用冷氯仿（40 mL × 3）萃取产物。合并有机相，用硫酸镁干燥。减压除去氯仿。
- 通过核磁共振（N....
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结果
除了二硫戊环前体分子的初始一步合成外，其余1,2-二硫戊环修饰肽的合成均在固相载体上进行（图1A）。在将该二硫戊环前体偶联至仍连接在树脂上的肽链游离N端氨基之前，需通过1H和13C核磁共振（NMR）确认3-溴-2-(溴甲基)丙酸转化为3-(乙酰巯基)-2-(乙酰巯甲基)丙酸（图1B和C）。使用氢氧化铵在微波反应器中将硫代乙酰基脱保护生成巯基，随后在甲醇中过夜氧化形成1,2-二硫戊环，之后将1,2-二硫戊环修饰的肽从树脂上裂解下来。粗产物肽通过反相高效液相色谱（HPLC）纯化（图2A），并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）确认产物分子量（图2B）。
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讨论
本文详细讨论了一种N端1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与纯化方法，以及所形成的超分子结构的表征。本文报道的1,2-二硫杂环戊烷肽的合成具有多项优势，包括通过一步合成法制备二硫杂环戊烷前体3-(乙酰硫基)-2-(乙酰硫甲基)丙酸，以及在树脂上采用微波辅助去保护反应，使用氢氧化铵作为更安全的试剂去除前体上的硫代乙酰基保护基，从而生成氧化态的1,2-二硫杂环戊烷结构单元，替代了先前报道中使用的有毒肼类去保护方法29。该1,2-二硫杂环戊烷肽的整体固相合成路线（图1A）可通过改变序列长度和组成进行灵活调整，例如引入Fmoc保护的非天然氨基酸，或改变C端树脂化学，以适应多种不同的研究应用需求。
为了防止具有亲核侧链的氨基酸或带有保护基团的氨基酸在反应中产生不需要的肽副产物，应在裂解混合液中加入额外的捕获剂20。在进行树脂上微波去保护步骤之前，可先对少量树脂（少于总树脂量的10%）进行测试性裂解，以确保偶联反应具有高产率。根据本报告.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢康涅狄格州立学院与大学（CSCU）纳米技术中心的 B. Ellen Scanley 博士在透射电子显微镜（TEM）使用方面的技术培训与帮助，以及卫斯理大学的 Ishita Mukerji 博士提供使用其圆二色光谱仪的权限。本研究所报告的工作部分得到了费尔菲尔德大学科学研究所、美国国家航空航天局康涅狄格太空资助联盟以及美国国家科学基金会（资助号 CHE-1624774）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高载量 Rink 酰胺 MBHA 树脂 | Gyros Protein Technologies | RAM-5-HL | 避免接触皮肤和眼睛；切勿吸入 |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Fisher Scientific | D119-4 | 易燃液体和蒸气；对眼睛和皮肤有刺激性；使用个人防护装备；远离明火 |
| Fmoc-L-缬氨酸-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-V | 佩戴个人防护装备；切勿吸入 |
| Fmoc-L-亮氨酸-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-L | 佩戴个人防护装备；切勿吸入 |
| Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-KBC | 佩戴个人防护装备；切勿吸入 |
| Fmoc-L-苯丙氨酸-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-F | 佩戴个人防护装备；切勿吸入 |
| Fmoc-L-丙氨酸-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-A | 佩戴个人防护装备；切勿吸入 |
| Fmoc-L-谷氨酰胺(Trt)-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-QT | 佩戴个人防护装备；切勿吸入 |
| N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐 | Gyros Protein Technologies | 26432 | 引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激；切勿吸入；在通风橱或通风良好区域使用 |
| DMF 中 0.4 M N-甲基吗啉溶液 | Gyros Protein Technologies | PS3-MM-L | 高度易燃；佩戴个人防护装备；远离热源并保持容器密闭；切勿吸入或吞咽；操作后彻底清洗皮肤 |
| DMF 中 20% 哌啶溶液 | Gyros Protein Technologies | PS3-PPR-L | 引起严重眼和皮肤灼伤；易燃液体和蒸气；切勿吸入 |
| 二氯甲烷 | Fisher Scientific | D37-4 | 可能致癌；切勿吸入；佩戴个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，用水冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 乙腈 | Fisher Scientific | A998-4 | 易燃；对眼睛有刺激性；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；远离明火或高温表面；若接触，用水冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 三氟乙酸 | Fisher Scientific | A116-50 | 引起严重灼伤；切勿吸入；对水生生物有害；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，立即用水冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 4% 醋酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 22400-4 | 切勿吸入；对水生生物有害 |
| 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸 | Acros Organics | AC172571000 | 切勿吸入；在室外或通风良好区域使用 |
| 氮气 | TechAir | 内压容器，受热可能爆炸 | |
| 3-溴-2-(溴甲基)丙酸 | Alfa Aesar | AAA1963014 | 切勿吸入；引起皮肤和眼睛刺激；具腐蚀性 |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | S318-100 | 使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 硫代乙酸钾 | Acros Organics | AC221300250 | 引起皮肤和眼睛刺激；切勿吸入；使用个人防护装备 |
| 硫酸 | Fisher Scientific | SA213 | 引起灼伤；远离水；远离可燃物；切勿吸入；使用个人防护装备；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 氘代氯仿 | Acros Organics | AC320690075 | 可能致癌；对皮肤和眼睛有刺激性；切勿吸入；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 氯仿 | Fisher Scientific | C298-4 | 可能致癌；对皮肤和眼睛有刺激性；切勿吸入；使用个人防护装备；仅在通风橱中使用；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医 |
| N,N-二异丙基乙胺 | Acros Organics | AC367841000 | 高度易燃；对水生生物有害；佩戴个人防护装备；切勿吞咽 |
| 氢氧化铵 | Fisher Scientific | A669S-500 | 具腐蚀性；切勿吸入 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452-4 | 易燃液体和蒸气；使用个人防护装备；切勿吸入；若接触，冲洗至少15分钟并立即就医 |
| 三异丙基硅烷 | Sigma Aldrich | 233781 | 易燃；使用个人防护装备；保持容器密闭 |
| 乙醚 | Fisher Scientific | E138-1 | 极易燃；对皮肤和眼睛有刺激性；使用个人防护装备 |
| 2,5-二羟基苯甲酸 | Sigma Aldrich | 39319-10x10MG-F | 切勿吸入；对皮肤和眼睛有刺激性 |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Alfa Aesar | AAJ67635EXK | |
| C18 Zip-Tip | Millipore | ZTC18S096 | |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 | Thermo Scientific | PI20490 | |
| 硅胶60 F254 涂层铝背板薄层色谱板 | EMD Millipore | 1.05549.0001 | |
| 薄壁精密核磁管 | Bel-Art | 663000585 | 外径5 mm |
| 全塑料 Norm-Ject 注射器 | Air Tite | AL10 | |
| 一次性针头 | BD PrecisionGlide | BD 305185 | 使用后的针头应放入锐器废物容器中处理 |
| 一次性带砂芯注射器 | Torviq | SF1000LL | 报告中使用了10 mL带砂芯注射器，但若需更大规模合成，也可使用更大规格的注射器 |
| 碳支持膜铜网 | Ted Pella, Inc. | CF200-CU | 务必在碳膜面制备样品和染色，而非铜网的光亮面 |
| 自闭合镊子 | Electron Microscopy Sciences | 78318-3X | 尖端非常锋利，长度：120 mm |
| 0.1 mm 短光程比色皿 | Starna Cells, Inc. | 20/C-Q-0.1 | 易碎 |
| 10 mL 容器盖 | CEM | 909210 | |
| 10 mL 压力容器 | CEM | 908035 | |
| Aeris 半制备型 HPLC 色谱柱 | Phenomenex | 00F-4632-N0 | 150 × 10 mm |
| 比色皿支架 | Starna Cells, Inc. | CH-2049 | 使用短光程比色皿时需要 |
| PS3 多肽合成仪 | Gyros Protein Technologies | ||
| DiscoverSP 微波反应器 | CEM | ||
| 离心机 | HERMLE | Z 206 A | 使用固定式6×50 mL转子 |
| 高效液相色谱仪 | Shimadzu | 紫外检测器 | |
| 核磁共振波谱仪 | Avance, Bruker | 300 MHz | |
| MALDI-TOF 质谱仪 | Axima Confidence, Shimadzu | ||
| 冷冻干燥机 | Millrock Technology | BT85A | |
| 傅里叶变换红外光谱仪 | Alpha Tensor, Bruker | ||
| 透射电子显微镜 | Tecnai Spirit, FEI | 配备 Gatan Orius 光纤CCD数码相机。在中国台湾 CSCU 纳米技术中心使用 | |
| 圆二色光谱仪 | J-810, JASCO | 配备六槽帕尔帖温控装置。在中国台湾卫斯理大学使用 |
参考文献
- Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
- Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-....
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重印与许可
