Method Article

12-Dithiolane 改性自组装肽的合成与表征

DOI:

10.3791/58135

⸱

August 20th, 2018

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种合成 12-dithiolane 修饰肽的协议, 以及肽自组装产生的超分子结构的表征。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本报告的重点是合成一个 n-终点 12-dithiolane 修饰自组装肽, 并描述了由此产生的自组装超分子结构。合成路线利用固相肽合成与 dithiolane 前体分子的树脂耦合, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl) 丙酸, 和微波辅助硫代乙酸脱的肽从树脂最终裂解前的 N 终点, 产生 12-dithiolane 修饰肽。用高效液相色谱 (HPLC) 纯化 12-dithiolane 肽, 从 Aβ肽与阿尔茨海默病相关的核核中提取, 该肽显示为自组装成交叉β淀粉样纤维。介绍了用傅里叶变换红外光谱 (IR)、环形二色谱光谱 (CD) 和透射电镜 (TEM) 表征淀粉样纤维的协议。采用 12-dithiolane 基团对特征自组装肽进行 n-末端修饰的方法, 现在可以作为模型系统来开发装配后的修改策略, 并探讨动态共价键化学在超分子肽碳纤维表面。

Introduction

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固相肽合成中的健壮肽键形成化学和控制序列长度和成分的能力使自组装成超分子结构的多肽成为一个研究领域。控制和稳定肽自组装结构的因素, 包括侧链空间和静电相互作用, 氢键和疏水效应1, 作为一套设计规则。随着对这些基本设计规则的研究继续进展, 肽自组装的逻辑下一步包括扩大肽基结构和功能的多样性。自组装多肽是一种多功能生物材料, 通过调整肽序列或装配条件2、3、4, 为许多医学应用而使用, 发展战略为对多肽纳米纤维5、6、7、8、9的组装后的修改仍然是一个相对未开发的领域。

超分子结构表面的动态二硫化物交换和硫醇化学是一个有潜力产生新的和功能性生物材料的领域。12-dithiolane 基团 (通常是硫辛酸 (la) 或 asparagusic 酸 (aa) 的衍生物) 在脂质体系统10

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Protocol

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1. 12-Dithiolane 改性肽的合成与纯化

  1. dithiolane 前体的合成, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl) 丙酸19。
    1. 添加1克 3-溴-2-(溴甲基) 丙酸 (1 equiv) 溶解在极小量的1米氢氧化钠 (约4毫升) 到一个25毫升的圆形底部反应瓶搅拌在55摄氏度。在氮气气氛下, 将反应瓶密封在一个隔膜和地方。
    2. 在4毫升的去离子水和3毫升的2米硫酸 (H2,4) 中, 制备含有1.49 克硫代乙酸钾 (3.2 equiv) 的溶液,在原位制造硫代乙酸酸。
    3. 将硫代乙酸酸溶液拉入塑料一次性10毫升注射器, 并将针头放在注射器上。将混合物滴状到反应瓶中, 用针穿透隔膜。继续反应过夜在55摄氏度。
    4. 用甲醇和二氯甲烷混合物 (1:9) 对硅胶 60 F254板上的薄层层析 (TLC) 进行反应。通过甲酚绿色染色可视化反应过程。该产品有 Rf = 0.57。
    5. 在反应完成并且冷却了到室温之后, 酸化混合物到 pH 值1与 2 M H2那么4。黄色的油从溶液中分离出来。
    6. 用冷氯仿提取产品 (40 毫升 x 3)。将....

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Results

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除了最初一步合成的 dithiolane 前体分子, 其余的 12-dithiolane 改良肽合成发生在坚实的支持 (图 1A)。3-溴-2-溴甲基丙酸转化为 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl) 丙酸, dithiolane 前驱体, 由1H 和13C 核磁共振 (图 1B和c) 确认, 然后再耦合到自由肽的 n-末端胺仍然在树脂。用氢氧化铵脱硫代乙酸到硫醇, 在 12-dithiolane 改性肽从树脂中裂解之前, 12-dithiolane 在甲醇中被氧化一夜。采用反相色谱法纯化粗肽 (图 2A), MALDI 质谱法 (图 2B) 证实了产品质量。

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Discussion

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本文讨论了 n-端 12-dithiolane 修饰自组装肽的合成和纯化的细节, 以及由此产生的超分子结构的特性。本报告所报道的 12-dithiolane 肽的合成具有优点, 包括一步法合成制备 dithiolane 前驱体、3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl) 丙酸, 以及在树脂上微波脱反应的前体硫代乙酸保护基团, 利用氢氧化铵作为一种较安全的替代物, 脱29的毒性肼, 产生氧化的 12-dithiolane 基团。12-dithiolane 肽 (图 1A) 的整体固相肽合成可以通过改变序列长度和组成, 包括使用 n-芴甲氧羰基保护的非自然氨基酸和 C 端树脂化学来适应许多不同的研究应用。

为了防止不需要的肽副产品, 当氨基酸与亲核侧链或氨基酸与保护组有反应裂解产物, 额外的清道夫应添加到裂解鸡尾酒20。在树脂微波脱步骤前, 可以进行一小部分 (不到10% 的总树脂) 的试裂, 以保证耦合.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Scanley 博士为她的技术培训和帮助使用 TEM 在康涅狄格州立大学 (CSCU) 纳米技术中心和 Ishita 博士 Mukerji 在卫斯理大学访问她的 CD分 光 光度计。所报告的工作部分是在美国宇航局康涅狄格州空间赠款联合会的费尔菲尔德大学科学研究所和国家科学基金会 CHE-1624774 的资助下进行的。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
溜冰酰胺 MBHA树脂，高负载Gyros Protein TechnologiesRAM-5-HL避免接触皮肤和眼睛;不要吸入
N，N-二甲基甲酰胺Fisher ScientificD119-4易燃液体和蒸气;刺激眼睛和皮肤;使用个人防护装备;远离明火
Fmoc-L-Val-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-V佩戴个人防护设备;不要吸入
Fmoc-L-Leu-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-L穿戴个人防护设备;不要吸入
Fmoc-L-Lys（Boc）-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-KBC佩戴个人防护设备;不要吸入
Fmoc-L-Phe-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-F穿戴个人防护装备;不要吸入
Fmoc-L-Ala-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-A穿戴个人防护装备;不要吸入
Fmoc-L-Gln（Trt）-OHGyros Protein TechnologiesFLA-25-QT穿戴个人防护装备;不要吸入
N，N，N′，N′-四甲基-O-（1H-苯并三唑-1-基）脲六氟磷酸Gyros Protein Technologies26432引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激;不要吸入;在引擎下或通风良好的区域使用
DMF 中的0.4 M N-甲基吗啉Gyros Protein TechnologiesPS3-MM-L高度易燃;穿戴个人防护装备;远离热源，保持容器密闭;不要吸入或吞咽;在
DMF 中处理 20% 哌啶Gyros Protein TechnologiesPS3-PPR-L导致严重的眼睛和皮肤灼伤;易燃液体和蒸气;不要吸入
二氯甲烷Fisher ScientificD37-4可能导致癌症;不要吸入;穿戴个人防护装备;仅在引擎盖下使用;如果接触，遇水上升至少 15 分钟并就医
乙腈Fisher ScientificA998-4易燃;刺激眼睛;使用个人防护装备;只能在通风橱下使用;远离明火或热表面;如果接触到，用水冲洗至少15分钟，并就医
三氟乙酸Fisher ScientificA116-50引起严重烧伤;不要吸入;对水生生物有害;使用个人防护设备;只能在通风橱下使用;如果接触到，用水冲洗至少15分钟并立即就医
4%醋酸铀酰显微镜科学22400-4不要吸入;对水生生物有害
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸Acros OrganicsAC172571000不要吸入;在室外或通风良好的地方使用
气 气体TechAir内容物在压力下，如果加热可能会爆炸
3-溴-2-（溴甲基）丙酸Alfa AesarAAA1963014不要吸入;对皮肤和眼睛造成刺激;腐蚀性
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100使用个人防护设备;只能在通风橱下使用;如果接触，冲洗区域至少15分钟并获得医疗护理
代乙酸钾Acros OrganicsAC221300250引起皮肤和眼睛刺激;不要吸入;使用个人防护设备
硫酸Fisher ScientificSA213导致灼伤;远离水;远离可燃物;不要吸入;使用个人防护设备;如果接触冲洗区域至少 15 分钟并获得医疗护理
氯仿-dAcros OrganicsAC320690075可能的癌症危险;刺激皮肤和眼睛;不要吸入;使用个人防护装备;仅在通风橱下使用;如果接触冲洗区域至少 15 分钟并获得医疗护理
氯仿Fisher ScientificC298-4可能有癌症危险;刺激皮肤和眼睛;不要吸入;使用个人防护装备;仅在通风橱下使用;如果接触冲洗区域至少 15 分钟并获得医疗护理
N，N-二异丙基乙胺Acros OrganicsAC367841000高度易燃;对水生生物有害;佩戴个人防护设备;不要吞咽
氢氧化铵Fisher ScientificA669S-500腐蚀性物质;不要吸入
甲醇Fisher ScientificA452-4易燃液体和蒸气;使用个人防护设备;不要吸入;如果接触冲洗区域至少 15 分钟并就医
三异丙基硅烷Sigma Aldrich233781易燃;使用个人防护安全设备;保持容器密闭
二乙醚Fisher ScientificE138-1极易燃;对皮肤和眼睛有刺激性;使用个人防护设备
2,5-二羟基苯甲酸Sigma Aldrich39319-10x10MG-F不要吸入;刺激皮肤和眼睛
α-氰基-4-羟基肉桂酸阿尔法-伊撒AAJ67635EXK
c18 拉链尖端米利波尔ZTC18S096
三（2-羧乙基） 磷酸盐酸盐Thermo ScientificPI20490
硅胶 60 F254 涂层铝背 TLC 板EMD Millipore1.05549.0001
薄壁精密核磁共振管Bel-Art663000585外径 5mm
全塑料 Norm-Ject 注射器Air TiteAL10
一次性针头BD PrecisionGlideBD305185用过的针头被丢弃在锐器废物容器中
一次性烧结注射器TorviqSF1000LL10mL 烧结注射器在报告中被使用，但如果需要进行更大规模的合成，可以使用更大的注射器。
碳网格Ted Pella， Inc.CF200-CU确保在碳网格侧准备样品和染色，而不是网格
自闭合镊电子显微镜科学78318-3X非常锋利的尖端，长度：120 mm
0.1 mm 短程池Starna Cells， Inc.20/C-Q-0.1易碎
10 mL 容器盖CEM909210
10 mL 压力容器CEM908035
Aeris 半制备 HPLC 色谱柱Phenomenex00F-4632-N0150 x 10 mm
比色皿支架Starna Cells， Inc.CH-2049使用短光程细胞时需要
PS3 肽合成仪Gyros Protein Technologies
DiscoverSP 微波反应器CEM
离心机HERMLEZ 206 A使用固定的 6x50 mL 转子
HPLC岛津紫外检测器
核磁共振光谱仪Avance， Bruker300 MHz
MALDI-TOF 质谱仪Axima Confidence、岛津
冻干机Millrock TechnologyBT85A
傅里叶变换红外光谱仪Alpha Tensor、布鲁克
透射电子显微镜Tecnai Spirit、FEI与 Gatan Orius 光纤 CCD 数码相机一起使用。在 CSCU 纳米技术中心访问
圆二色光谱偏振仪J-810，JASCO与六节帕尔贴温度控制器一起使用。在卫斯理大学访问。
盐 后彻底清洗皮肤 电子氮硫子的闪亮铜侧

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, J., Liu, K., Xing, R., Yan, X. Peptide self-assembly: Thermodynamics and kinetics. Chemical Society Reviews. 45, 5589-5604 (2016).
  2. Dong, R., et al. Functional supramolecular polymers for biomedical applications. Advanced Materials. 27, 498-....

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