本文介绍了研究金阳离子（Au(III)）与牛血清白蛋白（BSA）不同构象结合的实验方案，以及表征依赖于构象的特异性BSA-Au荧光的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案旨在研究 Au(III) 与 BSA 结合并诱导 BSA-Au(III) 复合物产生红色荧光（λem = 640 nm）的构象变化过程。该方法通过调节 pH 值，证明红色荧光的出现与 pH 诱导的 BSA 构象平衡转变相关。仅当 pH 值调节至 9.7 或更高时，才能形成具有红色荧光的 BSA-Au(III) 复合物，此条件对应于 BSA 的 "A 型" 构象。文中描述了调节 BSA 与 Au 摩尔比以及监测 Au(III) 结合过程时间进程的实验步骤。产生红色荧光所需的每分子 BSA 结合的最少 Au(III) 数量少于七个。我们通过分步实验方案说明 BSA 中存在多个 Au(III) 结合位点：首先，通过先加入铜离子（Cu(II)）或镍离子（Ni(II)）阳离子，再加入 Au(III)，揭示了一个不形成红色荧光团的 Au(III) 结合位点；其次，利用巯基封闭试剂对 BSA 进行修饰，揭示了另一个不形成荧光团的 Au(III) 结合位点；第三，通过断裂并封闭二硫键来改变 BSA 的构象，进一步阐明了可能的 Au(III) 结合位点。本研究所描述的控制 BSA 构象与 Au(III) 结合的实验方案，可广泛应用于其他蛋白质与金属阳离子相互作用的研究。
引言
Xie et al．最初合成了表现出紫外光（UV）激发的红色荧光且具有显著斯托克斯位移的BSA-Au化合物1。这种独特且稳定的红色荧光可在传感2,3,4、成像5,6,7以及纳米医学8,9,10,11,12,13等领域中具有多种应用。近年来，许多纳米科学领域的研究人员已对该化合物进行了广泛研究14,15,16。该BSA-Au化合物被解释为Au25纳米团簇。本方法的目标是详细研究该化合物，并阐明红色荧光的来源。通过采用所述方法，可揭示多个金结合位点的存在以及荧光的起源，从而提出不同于Au25纳米团簇单一位点成核机制的解释。该方法同样可用于研究其他蛋白质17,18,19与Au(III)形成复合物后，其本征荧光特性的变化情况。
BSA-Au红色荧光化合物的合成需要严格控制BSA与Au的摩尔比（BSA:Au），以最大化荧光强度以及激发-发射矩阵（EEM）中峰的位置。20可以证明，Au(III) 存在多个结合位点，包括天冬酰胺片段（或 Asp 片段，即 BSA 氨基末端的前四个氨基酸残基）21,22. 34th 牛血清白蛋白（BSA）的氨基酸残基Cys-34也被证实能够配位Au(III)，并参与红荧光产生机制（[Cys34-封端-BSA]-Au(III)）20. 在断裂所有Cys-Cys二硫键并封闭所有巯基后，不产生红色荧光（[全巯基封闭-BSA]-Au(III)）。这表明Cys-Cys二硫键作为Au(III)的结合位点，对产生红色荧光具有必要性。
蛋白质化学技术在纳米科学领域尚未被广泛用于研究牛血清白蛋白-三价金（BSA-Au(III)）复合物。然而，采用这些技术来理解此类复合物的某些特性，以及深入阐明BSA中Au(III)的结合位点，将具有重要价值。本文旨在介绍其中一些技术。
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方案
1. BSA-Au(III) 复合物的合成
- 在5 mL反应小瓶中，将25 mg BSA溶解于1 mL高效液相色谱（HPLC）级水中。
注意：溶液应呈澄清状态。 - 将三水合氯金酸（氯金酸）溶解于HPLC级水中，配制成5 mM浓度的溶液。
注意：溶液应呈黄色。此浓度下配制的氯金酸溶液将产生BSA与Au的摩尔比为1:13的体系。- 或者，可在HPLC级水中配制浓度介于0.38 mM（BSA:Au = 1:1）至20 mM（BSA:Au = 1:50）之间的氯金酸溶液。
注意：不同的BSA与金的摩尔比将导致激发-发射图谱中红色荧光模式显著不同。
- 或者，可在HPLC级水中配制浓度介于0.38 mM（BSA:Au = 1:1）至20 mM（BSA:Au = 1:50）之间的氯金酸溶液。
- 将含有BSA的反应小瓶置于37 °C水浴中，并使用磁力搅拌器以750 rpm剧烈搅拌。
- 搅拌开始后立即向溶液中加入1 mL氯金酸溶液。溶液颜色应由澄清变为黄色。
- 在37 °C、750 rpm条件下，继续用磁力搅拌器搅拌混合物2分钟。
- 向反应小瓶中加入100 μL 1 M NaOH溶液，调节pH至12。
注意：加入NaOH后，溶液应迅速略微变暗呈黄褐色，随后恢复为黄色。 - 继续在37 °C、750 rpm条件下搅拌2小时。溶液应逐渐由黄色转变为深黄/棕色。该颜色变化表明红色荧光BSA-Au(III)复合物的形成。
- 将样品在室温下静置2天，溶液颜色将继续加深至琥珀棕色，且荧光强度将增强。
- 或者，可让样品在37 °C继续搅拌12小时，直至溶液颜色演变为琥珀棕色。
2. BSA-Cu(II)-Au(III) 的合成
- 将25 mg BSA溶解于1 mL HPLC级水中。溶液应呈澄清状态。
- 将氯化铜（II）二水合物溶解于HPLC级水中，配制成5 mM浓度的溶液。溶液应呈淡蓝色。
- 取1 mL BSA水溶液加入5 mL反应小瓶中，并置于37 °C水浴中。以750 rpm速度搅拌混合物。
- 立即向反应小瓶中加入0.5 mL氯化铜（II）二水合物溶液，混合2分钟。溶液将保持淡蓝色。
- 加入75 μL 1 M NaOH，使pH升至12，并继续搅拌2小时。溶液将变为紫色。
- 将氯金酸溶解于HPLC级水中，配制成5 mM浓度的溶液。
- 向反应小瓶中加入0.5 mL氯金酸水溶液，并用1 M NaOH调节pH至12。
- 继续搅拌反应混合物2小时。
注意：溶液应逐渐变为棕色。
3. BSA-Ni(II)-Au(III) 的合成
- 将 25 mg BSA 溶解于 1 mL HPLC 级水中。溶液应呈澄清状态。
- 将六水合氯化镍溶解于 HPLC 级水中，配制成 5 mM 的溶液。溶液应呈浅绿色。
- 取 1 mL BSA 水溶液加入 5 mL 反应小瓶中，并置于 37 oC 水浴中。以 750 rpm 的速度搅拌混合物。
- 立即向反应小瓶中加入 0.5 mL 六水合氯化镍溶液，混匀 2 分钟。
注意：溶液将保持浅绿色。 - 加入 75 μL 1 M NaOH 溶液，调节 pH 至 12，并继续搅拌 2 小时。
注意：溶液将变为深黄色。 - 将氯金酸溶解于 HPLC 级水中，配制成 5 mM 的溶液。
- 向反应小瓶中加入 0.5 mL 氯金酸水溶液，并将 pH 重新调节至 12。
- 继续搅拌反应混合物 2 小时。
注意：溶液应逐渐变为棕色。
4. [Cys34-封端-BSA]-Au(III) 的合成
- 将 2 mg 的 N-乙基马来酰亚胺（NEM）溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中。
- 将 2 mg 的牛血清白蛋白（BSA）溶解于 1 mL PBS-NEM 溶液中。
- 将该溶液转移至 5 mL 反应瓶中，在 20 °C、500 rpm 条件下搅拌 1 小时。
- 使用 12 kDa 透析袋在 500 mL PBS 中对溶液进行透析，磁力搅拌（50 rpm）过夜，以去除未反应的 NEM。
- 将氯金酸溶解于 PBS 中，使其浓度达到 0.4 mM。
注意：溶液将呈现淡黄色。 - 将反应瓶转移至 37 °C 水浴中，以 750 rpm 搅拌。
- 立即向反应瓶中加入 1 mL 氯金酸溶液，混合 2 分钟。
- 向反应瓶中加入 75 μL 的 1 M NaOH 溶液，使 pH 升至 12，并继续混合 2 小时。
5. [全巯基封端-BSA]-Au(III)的合成
- 在高效液相色谱级水中配制含有2 M尿素和50 mM碳酸氢铵（NH4HCO3，pH 8.0）的溶液。
- 将3.3 mg牛血清白蛋白（BSA）溶解于1 mL上述溶液中，并转移至5 mL反应小瓶中。
- 通过将62.5 mg三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶解于1 mL高效液相色谱级水中，配制0.25 M的TCEP储备液。
- 向反应小瓶中加入TCEP储备液，使TCEP的终浓度为8 mM。
- 将溶液置于水浴中，在50 °C下孵育1小时，同时使用磁力搅拌器以500 rpm的速度搅拌。
- 让溶液完全冷却至室温。
- 通过将12.5 mg N-乙基马来酰亚胺（NEM）溶解于1 mL高效液相色谱级水中，配制100 mM的NEM储备液。
- 向反应小瓶中加入NEM储备液，使NEM的终浓度为16 mM。
- 在20 °C下反应2小时，同时以500 rpm的速度持续搅拌。
- 使用12 kDa透析袋对溶液进行透析，在500 mL的50 mM NH4HCO3缓冲液中以50 rpm的速度磁力搅拌过夜，以去除多余的TCEP、NEM和尿素。
- 将反应小瓶转移至37 °C水浴中，并以750 rpm的速度搅拌。
- 将氯金酸溶解于高效液相色谱级水中，配制成0.66 mM的溶液。
- 立即向反应小瓶中加入1 mL氯金酸溶液，并混合2分钟。
- 加入1 M NaOH，调节溶液pH至12，并继续搅拌2小时。
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结果
通过BSA-Au(III)复合物的荧光观察发现，在pH约为9.7时，BSA的本征蓝色荧光（λem = 400 nm）可转变为红色荧光（λem = 640 nm），该过程通过平衡转变实现（图1）。不同BSA与Au摩尔比下BSA-Au(III)的激发-发射矩阵（EEM）如图2所示，该数据表明，改变摩尔比可在不同激发波长下获得相同的发射波长。Cu(II)、Ni(II)和Au(III)可竞争性地结合于BSA中已知的结合位点（Asp片段）（图3）。Cys34封端的BSA在结合Au(III)后表现出EEM峰形的变化，这些结果揭示了特定结合位点的改变如何影响荧光模式。全巯基封端的BSA不产生红色荧光，表明Cys-Cys二硫键可能是形成红色荧光团的潜在结合位点（图4）。
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讨论
在 pH 12 条件下制备的 BSA-Au(III) 化合物在紫外光（λex = 365 nm）激发下，在发射波长 λem = 640 nm 处表现出红色荧光（图 1A）。红色荧光的出现是一个缓慢的过程，在室温下需要数天时间才能达到最大强度。在 37 °C 下进行反应可获得最佳效果，尽管更高温度可加快红色荧光的产生速度。但温度超过 45 °C 时可能导致蛋白质发生不可逆降解23。调节 pH 值使 BSA 转变为其老化构象（pH > 10）21（"A 型"）对于产生红色荧光至关重要；需将 pH 从中性精确调节至碱性，以确定红色荧光出现的阈值（图 1B、C）。为获得最大红色荧光强度，pH 应调节至 11 以上。虽然 pH 可调节至超过 11 以实现红色荧光，但在极强碱性条件（pH > 13）下，BSA ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.E. 感谢杜克大学捐赠专项基金、富国银行基金、PhRMA 基金会以及北卡罗来纳大学夏洛特分校启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 (BSA)，96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| 三水合氯化金(III)，99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| 二水合氯化铜(II)，99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| 六水合氯化镍(II)，99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-乙基马来酰亚胺 (NEM)，>99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP)，>98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 氢氧化钠，>98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 尿素，99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| 碳酸氢铵，99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
参考文献
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
- Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
- Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
- Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
- Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
- Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
- Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681(2007).
- Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
- Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).
- Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).
- Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
- Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
- Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
- Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).
- Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
- Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
- Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
- Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
- Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
- Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
- Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
- Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
- Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
- Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
- Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).
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