用于研究肿瘤转移的无细胞与细胞肺模型

摘要

本文介绍了一种模拟肿瘤进展过程的ex vivo肺癌模型方案，该模型有助于分离原发性肿瘤、循环肿瘤细胞以及转移性病灶。

摘要

在肿瘤进展的不同阶段分离肿瘤细胞具有较大难度。我们构建了一种ex vivo肺部模型，能够展示肿瘤细胞与天然基质之间的相互作用以及营养物质的持续流动；同时还构建了另一种模型，用于展示肿瘤细胞与正常细胞组分及天然基质之间的相互作用。无细胞ex vivo肺模型通过分离大鼠心肺组织块，并利用脱细胞化过程去除所有细胞而制备。将右侧主支气管结扎后，通过注射器将肿瘤细胞注入气管，细胞会迁移并定植于左肺。随后将肺组织置于生物反应器中，使肺动脉在闭合回路中持续接收培养基灌注。在左肺上生长的肿瘤为原发性肿瘤；在循环培养基中分离到的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞，而右侧肺中的肿瘤细胞则代表转移病灶。细胞化ex vivo肺模型则通过省略脱细胞化步骤制备。这两种模型可用于回答不同的科研问题。

引言

癌症转移是导致大多数癌症相关死亡的原因，也是抗癌斗争中的最终挑战。本方法的总体目标是设计一种四维（4-D）细胞培养方案，该培养体系在三维（3-D）细胞生长的基础上增加流动维度。该模型可表征转移过程的三个不同阶段[即原发性肿瘤、循环肿瘤细胞（CTCs）和转移病灶

在过去三十年中，全球科学家获得了前所未有的信息，以揭示不同癌症转移进展背后的机制，从而改善了治愈前景或无进展生存率。某些癌症（如乳腺癌）的临床管理已显著改善¹；然而，其他一些癌症（如肺癌）的生存率仍然较低²。体外和体内动物模型在揭示疾病发生机制方面发挥了重要作用。近年来，细胞系来源的异种移植模型（CDX）和患者来源的异种移植模型（PDX）受到更多关注，因为它们保留了原发性人类肿瘤的许多相关特征³，例如生长动力学、组织学特征、行为特性以及对治疗的反应。然而，每种模型在理解循环肿瘤细胞（CTC）形成及向远端器官转移的机制方面均存在局限性^4,5,6。

最近，我们开发了一种4-D 离体....

方案

动物实验方案已获休斯敦卫理公会 研究所机构动物护理与使用委员会批准，并严格依照所有相关法规、适用法律、指南和政策执行。

1. 大鼠肺组织采集

1. 通过在侧腹进行腹腔注射（IP）给予4至6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）以实施麻醉。用镊子夹捏后肢脚趾，确认无运动反应以确保麻醉成功。 
2. 10 分钟后，剃除胸部和腹部的毛发，并用氯己定棉签擦拭皮肤。
3. 用镊子夹起皮肤并进行切开以去除皮肤 用一次性手术刀打开胸腔后。 切开 用手术刀行双侧开胸术，用剪刀切开左侧肋骨前缘和右侧膈肌。
   注意：本手术为非存活性手术。
4. 握住肋骨，使用27 G针头向跳动心脏的右心室注入2 mL肝素（1,000单位/mL）。
   注意：这将防止肺部形成任何血凝块。
5. 用剪刀完全去除肋骨笼，并将一支18 G针头插入左心室作为排气孔，直至血液流出。然后，使用25 G针头向右心室注入15 mL含肝素的磷酸盐缓冲液（12.5 单位/mL；肝素化PBS）。
6. 剪断位于心脏右侧的两条大静脉——下腔静脉和上腔静脉，并用27 G针头在右心室注入额外10 mL含肝素的PBS冲洗肺部。
   注意：下腔静脉位于心脏底部下方，为一条充满红色血液的大血管。同样，上腔静脉位于心脏上部，....

结果

从大鼠收获的肺保持了完整的血管系统和肺泡¹¹ (图3A 和 3B）。脱细胞后，无细胞肺的细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白）得以保留¹¹ (图3C, 三维, 3E，以及 3F）。脱细胞化可完全去除肺组织中固有的大鼠细胞，这一点可通过苏木精-伊红（H&E）染色观察到&E) 染色显示无细胞存在，并通过DNA分析证实¹¹ 显示DNA量减少（图 3D 和 3G）。该 离体 4-D 肺模型可用于培养任何类型的贴壁细胞¹²

讨论

这 离体 4-D 肺为在实验室环境中研究肿瘤生长和转移提供了机会。天然肺基质是一种复杂系统，可为正常组织提供支持，并维持细胞间相互作用、细胞与基质间的相互作用、细胞分化及组织结构。该模型允许添加任意肿瘤微环境组分，以研究这些组分对肿瘤生长的影响及其与其他细胞的相互作用。

肺组织的获取是构建ex vivo 4-D肺模型的关键步骤。在打开胸腔后若延迟注射肝素，可能导致肺部形成血凝块，从而影响脱细胞过程中试剂的自由流动。使用含肝素的PBS充分灌注，直至流出液变为无色，这一步骤尤为重要，特别是在构建细胞模型时。需小心剪开上腔静脉，以避免损伤肺动脉（PA）。在脱细胞过程中，必须避免气泡进入肺支架。气泡的存在可能减缓或阻断试剂的流动，导致脱细胞不充分。可通过使用10–20 mL注射器抽吸的方式去除气泡。必须确保肺动脉插管未发生扭曲。在生物反应器组装过程中，若管路发生扭曲，可能导致连接处弹开，从而在培养箱内造成严重污染。为避免插管扭曲，可将插管或针头切断后使用生物相容性管路重新连接，以提供必要的灵活性，使插管旋转时不会影响连接稳定性。若培养基在培养箱内发生泄.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
斯普拉格-道利大鼠	Harlan	206M	雄性
氯己定消毒棉片	Prevantics，美国纽约	NDC 10819-1080-1
肝素	Sagent Pharmaceuticals，美国伊利诺伊州绍姆堡	NDC 25021-400-10
18号针头	McMaster Carr，美国	75165A249
2-0 丝线结扎线	Ethicon，美国德克萨斯州圣安吉洛	A305H
Masterflex L/S 泵	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	EW-07554-80
Masterflex L/S 泵头	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	EW-07519-05
Masterflex L/S 泵管卡盒	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	EW-07519-70
Tygon 管	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	14171211
MasterFlex 泵管	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	06598-16
雌性鲁尔锁接头	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	45508-34	75165A249
雄性鲁尔锁接头	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	45513-04
黑色尼龙环	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	EW-45509-04
静脉输液装置	CareFusion	41134E
十二烷基硫酸钠（SDS）	Fisher Scientific	CAS151-21-3
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
抗生素	Gibco	15240-062
硅胶氧合器	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	ABW00011	Saint-GoBain-
金属丝网	1164610105	Lowes	New York Wire
雌性鲁尔螺纹式三通接头	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	45508-56
带整体锁环的雄性鲁尔接头转200系列卡套	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	45518-08
雌性鲁尔螺纹式连接器	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	45508-22
Clave 连接器	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™四通旋塞阀，带旋转式雄性鲁尔锁	smith Medical	MX9341L
MasterFlex 泵管	Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山	06598-13	用于插管