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方法文章

小鼠静脉-静脉体外膜氧合

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DOI：

10.3791/58146

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2018年10月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiothoracic, Transplantation, and Vascular Surgery, Hannover Medical School, 2Department of Pneumology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在未进行气管插管、可自主呼吸的小鼠中实施静脉-静脉体外膜肺氧合（ECMO）的技术方案。该小鼠ECMO模型可有效应用于急性及终末期肺部疾病的实验研究。

摘要

近年来，体外膜肺氧合（ECMO）的使用显著增加。ECMO 已成为治疗急性及终末期肺部疾病的可靠且有效的疗法。随着临床需求的增加和 ECMO 使用时间的延长，操作流程的优化以及多器官损伤的预防变得至关重要。本方案旨在介绍一种在未进行气管插管、可自主呼吸的小鼠中实施静脉-静脉 ECMO 的详细技术。该方案展示了 ECMO 的技术设计及手术步骤。这一小鼠 ECMO 模型将有助于研究与 ECMO 相关的病理生理机制（例如，炎症、出血以及血栓栓塞事件）。由于存在大量基因修饰小鼠，也可借此深入解析 ECMO 相关并发症所涉及的分子机制。

引言

体外膜肺氧合（ECMO）是一种临时生命支持系统，可替代肺和心脏功能，以实现充分的气体交换和灌注。Hill 等人1于1972年首次描述了ECMO在患者中的应用；然而，直到2009年H1N1流感大流行期间成功应用后，ECMO才得到广泛使用2。如今，ECMO已成为终末期心肺疾病抢救治疗的常规手段3。静脉-静脉ECMO正 increasingly 被用于治疗难治性呼吸衰竭且清醒、未插管、自主呼吸的患者，作为有创机械通气的一种替代方案4。

尽管体外膜肺氧合（ECMO）已得到广泛应用，但已有多种并发症的报道5,6,7。接受ECMO治疗的患者可能出现的并发症包括出血、血栓形成、脓毒症、血小板减少、设备相关功能障碍以及空气栓塞。此外，临床上和实验研究中均已有充分描述，ECMO可引发全身性炎症反应综合征（SIRS），进而导致多器官损伤8,9。在接受长期ECMO治疗的患者中，脑梗死等神经系统并发症也常有报道。更为复杂的是，通常难以区分这些并发症究竟是由ECMO本身引起，还是源于急性或终末期疾病所伴随的基础疾病状态。

为了专门研究体外膜肺氧合（ECMO）对健康机体的影响，必须建立一个可靠的实验动物模型。目前关于在小型动物上实施ECMO的报道极少，且仅限于大鼠。迄今为止，文献中尚未描述过小鼠的ECMO模型。由于存在大量可获得的基因修饰小鼠品系，建立小鼠ECMO模型将有助于进一步探究与ECMO相关并发症的分子机制10,11。

基于我们先前描述的小鼠体外循环（CPB）模型12，我们建立了一种在未进行气管插管、自主呼吸小鼠中实施静脉-静脉体外膜肺氧合（ECMO）的稳定方法。ECMO管路（图1）包含流出道和回流导管、蠕动泵、氧合器以及除气储血器，其结构与我们此前报道的小鼠CPB模型12相似，但预充体积更小（0.5 mL）。本方案详细展示了成功实施ECMO操作所涉及的技术步骤、生理监测及血气分析方法。

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方案

实验使用12周龄的雄性C57BL/6小鼠进行。本研究遵循德国动物保护法指南，实验方案编号为TSA 16/2250。

1. 材料准备

注意：所有步骤均在洁净但非无菌条件下进行。 若动物在术后需继续存活，则必须采用无菌条件。

  1. 在16倍显微镜下，使用手术刀在2-Fr聚氨酯管上开三个窗孔。
    注意：所有窗孔必须位于插管的远端三分之一处，以确保最佳的血液引流。
  2. 制备预充液（材料表）。加入30 IU/mL肝素和2.5% v/v的8.4% NaHCO3溶液。将此溶液在4 °C下冷藏，直至使用。用500 µL预充液对管路进行预充。
  3. 将流出管插入预充液中，并启动蠕动泵以填充ECMO设备。以1 mL/min的流速持续循环预充液30分钟。
  4. 向氧合器提供0.5 L/min的100%氧气。

2. 麻醉

  1. 将动物放入充满2.5%（v/v）异氟烷/氧气混合气体的诱导室中。向蒸发器提供0.5 L/min的100%氧气。手术前，通过检测足底回缩和疼痛反射确认已达到完全麻醉状态。涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥损伤。
  2. 使用加热垫将动物体温维持在37 °C。
  3. 使用异氟烷蒸发器进行面罩吸入麻醉，并皮下注射5 mg/kg的卡洛芬。
  4. 定期观察自主呼吸情况，并调整异氟烷浓度，使其保持在1.3%至2.5%之间。

3. 手术

  1. 使用精细剪刀在颈部左侧做一条长约4 mm的侧向皮肤切口，暴露左侧颈静脉。结合使用显微镊子和棉签进行锐性与钝性分离，并采用双极电凝处理小血管。
  2. 暴露左侧颈静脉后，借助显微镊子，用8-0丝线结扎其远端部分。
  3. 在静脉近端放置一个滑结。使用显微剪刀切开静脉的前壁。
  4. 为实现充分肝素化，通过26 G Braunula针头向颈静脉内注射2.5 IU/g肝素。
  5. 将动物垫头部抬高30°，以避免插管期间静脉出血过多。
  6. 将一根2-Fr聚氨酯（PU）导管插入颈静脉近端，在推进过程中轻微旋转，插入深度约为4 cm；此时导管尖端将达到下腔静脉（IVC）的髂部分叉处。
  7. 使用显微镊子以8-0丝线将导管固定。
  8. 按照步骤3.1、3.2和3.3所述方法暴露右侧颈静脉。
  9. 用一根1-Fr聚氨酯（PU）导管插管右侧颈静脉，并轻柔地向右心房方向推进约5 mm。
  10. 重复步骤3.7。
  11. 用另一根1-Fr聚氨酯（PU）导管插管左侧股动脉，用于侵入性血压监测以及血气分析（BGA）的采血。
  12. 将连接至数据采集装置的心电图（ECG）针头皮下插入双侧前肢及左侧胸壁。
  13. 插入连接至数据采集装置的直肠温度计。

4. 静脉-静脉体外膜肺氧合与血气分析

注意：完整的体外膜肺氧合（ECMO）管路示意图参见图1。

  1. 通过以初始流速 0.1 mL/min 启动泵来在动物身上启动 ECMO。在接下来的 2 分钟内将泵的流速调整至 3–5 mL/min。
  2. 如果经插管部位从流出道插管吸入空气，则降低流速，并通过空气捕集储液器向管路中加入 0.1 mL 预充液。
  3. 在稳定流速下，通过数据采集装置持续以实时模式监测所有生命体征参数。
  4. 持续观察静脉引流的回流情况，并监测空气捕集储液器中的血液液面水平。
  5. 使用 24 G 套管针尖端将伤口渗出的任何血液收集至 1 cc 注射器中，并通过空气捕集储液器将其回输至 ECMO 管路中。
  6. 进行 BGA 时，使用血液采样 cartridge 在以下时间点和以下位置采集约 75 µL 动脉血：
    1. ECMO 启动后 10 分钟，通过氧合器前预置的额外管路从下腔静脉（IVC）采血，通过氧合器后类似额外管路 （对照）以及直接从股动脉采血。
    2. ECMO 启动后 30 分钟，从股动脉采血。
  7. 每 45 分钟额外给予 0.1 mL 预充液，以补偿血管内液体丢失，可通过空气捕集器或股动脉导管给入，或通过血液引流插管吸除气泡实现。
  8. 进行 BGA 时，使用血液采样 cartridge 采集约 75 µL 动脉血：
    1. ECMO 启动后 1 小时，从股动脉采血。
    2. ECMO 启动后 2 小时，通过氧合器前预置的额外管路从下腔静脉（IVC）采血，通过氧合器后类似额外管路（对照）， 以及直接从股动脉采血。
  9. 2 小时后，在 5 分钟内逐渐降低泵上的流速，从而停止 ECMO。
  10. 继续记录生命体征参数额外 10 分钟。
  11. 通过放血处死动物，并采集血液和器官以结束实验。

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结果

本方案描述了小鼠静脉-静脉体外膜肺氧合（ECMO）的方法。该模型可靠且可重复，与我们先前报道的体外循环（CPB）伴呼吸和循环停止模型12,13相比，建立技术难度较低。

静脉系统中的ECMO血流维持在1.5至5 mL/min之间。通过向ECMO管路中添加额外的预充液，将平均动脉压维持在70至85 mmHg。通常，在ECMO期间向管路中添加0.1 mL预充液即可替代血容量。所有用于扩容或缓冲的溶液均通过股动脉或气泡捕集储液器给予。

每10分钟记录一次生理参数，代表性ECMO实验的数据见图2。成功的ECMO实验的血气分析数据见表1...

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讨论

此前，我们描述了一种在小鼠中成功建立体外循环（CPB）的模型12,13。为了将该模型应用于急性或终末期肺部疾病的实验研究，我们开发了一种易于使用的静脉-静脉体外膜肺氧合（ECMO）回路，适用于小鼠。与CPB模型不同，静脉-静脉ECMO无需开胸及主动脉阻断等复杂的外科操作，从而降低了全身肝素化动物发生伤口出血的风险。为防止血液凝块导致氧合器栓塞，每只动物给予2.5 IU/kg的肝素。该剂量依据既往活化凝血时间（ACT）测定结果确定，可确保血液完全抗凝（ACT > 800 秒）。由于微型氧合器未进行肝素涂层处理，我们的抗凝方案仍保持与CPB操作相似。

与体外循环（CPB）回路相比，我们通过减小空气捕集器和微氧合器的体积，将总体预充量减少至0.5 mL。此外，需要较慢的流速以维持动物充分的氧合。血管内血容量的丢失导致平均动脉压逐渐下降。向动物体内额外加入0.1 mL的预充液后，血压可升高超过20 mmHg，但在随后的30分钟内，动脉压始终呈现轻微的线性下降。如果经...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的KFO 311资助项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
斯特罗芬丁B.Braun Petzold GmbHPZN:8609189与四联液按1:1混合
6% 四联液B. Braun Melsungen AGPZN: 05565416与斯特罗芬丁按1:1混合
肝素钠 25,000Ratiopharm GmbHPZN: 3029843预充液中每毫升含2.5 IU
8.4% 碳酸氢钠溶液B. Braun Melsungen AGPZN: 1579775预充液中占3%
卡洛芬Zoetis Inc., USAPZN:002896155 mg/kg体重
1 Fr 聚氨酯导管Instechlabs INC., USAC10PU-MCA1301颈动脉
2 Fr 聚氨酯导管Instechlabs INC., USAC20PU-MJV1302颈静脉
8-0 编织丝线Ashaway Line & Twine Co., USA75290结扎用
异氟烷Piramal Critical Care GmbHPZN:9714675麻醉
弹簧剪 - 6 mm 刀头Fine Science Tools GmbH15020-15器械
弹簧剪 - 2 mm 刀头Fine Science Tools GmbH15000-03器械
哈尔斯特德-蚊式止血钳Fine Science Tools GmbH13009-12器械
杜蒙特#55镊子Fine Science Tools GmbH11295-51器械
卡斯特罗维耶霍微持针器 - 9 cmFine Science Tools GmbH12060-02器械
微血管夹Fine Science Tools GmbH18555-01器械
bulldog 血管夹Fine Science Tools GmbH18050-28器械
异氟烷麻醉蒸发器 Drager 19.1Drägerwerk AG & Co. KGaA麻醉浓度 1.3–2.5%
多通道数据采集系统，配备 ISOHEART 软件Hugo Sachs Elektronik GmbH, 德国有创血压、心电图、体温 t °C
i-STAT 便携式检测仪Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA血气分析
i-STAT CG4+ 和 CG8+ 检测盒Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA血气分析
C57Bl/6 小鼠，雄性，30 g，14 周龄Charles River Laboratories实验前饲养 1 周

参考文献

  1. Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
  2. Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659(2011).
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  5. Esper, S. A. Extracorporeal Membrane Oxygenation. Advances in Anesthesia. 35 (1), 119-143 (2017).
  6. Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387(2016).
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  12. Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
  13. Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).

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