方法文章

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

12.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58149

⸱

2018年8月18日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

本文内容

摘要

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。

摘要

研究胞葬作用的调控机制需要能够准确定量凋亡细胞摄取情况，并探究控制胞葬作用的信号传导和细胞过程的方法。由于凋亡细胞通常被片段化地吞噬，因此准确定量具有挑战性，这就要求方法能够清晰区分已被吞噬的凋亡细胞部分与残余未被吞噬的细胞碎片。本文所述方法采用双标记策略，以准确量化胞葬作用的动力学过程以及吞噬细胞（如巨噬细胞）的胞葬能力。通过使用细胞示踪染料标记凋亡细胞的胞质，可追踪所有来源于凋亡细胞的物质；同时对凋亡细胞进行表面生物素化标记，以区分已内化与未内化的凋亡细胞组分。通过采集活细胞或固定细胞的荧光图像，并利用链霉亲和素染色区分结合态与内化态的靶标，从而确定吞噬细胞的胞葬能力。与流式细胞术等方法相比，该方法具有多项优势：能够准确区分未被吞噬与已被吞噬的凋亡细胞组分，可通过活细胞显微镜观察测量胞葬动力学，并可对表达荧光标记转基因的细胞进行细胞内信号通路研究。综上所述，本实验方案中描述的方法构成了一种灵活的实验体系，可用于准确定量胞葬活性，并深入探究胞葬过程中活跃的细胞信号通路。

引言

细胞凋亡，即程序性细胞死亡，是一种高度调控的生理过程，存在于大多数多细胞生物中，对其发育和稳态维持至关重要1。除了参与正常的细胞更替和胚胎发育外，细胞凋亡还能清除组织中受感染或受损的细胞，并可由感染、炎症、癌症以及放射治疗或类固醇等医疗干预手段所触发1。凋亡细胞在其细胞表面暴露被称为"吃我"的信号，这些信号可被多种专业性和非专业性吞噬细胞表面的受体识别，这些吞噬细胞统称为"清除细胞（efferocytes）"。这些受体的激活会诱导清除细胞通过一种称为胞葬作用（efferocytosis）的过程，将凋亡细胞摄入并降解2,3。磷脂酰丝氨酸是目前研究最清楚的驱动胞葬作用的“吃我”信号。在正常情况下，它局限于质膜的内小叶；当细胞发生凋亡时，脂质翻转酶（lipid scramblase）被激活，破坏膜的不对称性，从而使磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面4。某些非凋亡细胞（如成熟巨噬细胞和活化的血小板）的胞外表面也存在磷脂酰丝氨酸。然而，由于这些细胞表面表达诸如CD47等"别吃我"信号，因此不会被清除细胞吞噬5,6,7。暴露的磷脂酰丝氨酸可被清除细胞表达的一系列胞葬受体识别。这些受体直接或借助调理素间接结合磷脂酰丝氨酸后，会激活促进凋亡细胞被包裹进入一种膜结合空泡（称为胞葬体，efferosome）的信号通路8,9,10,11,12。胞葬体依次与内体和溶酶体融合，后者提供必要的分子机制以酸化胞葬体并降解其中的凋亡细胞内容物13,14。降解完成后，来源于凋亡细胞的物质被转运至回收内体——这一过程可限制机体对凋亡细胞来源抗原的免疫反应，也可能实现从凋亡细胞中回收营养物质13,15。若胞葬作用发生障碍，则会导致凋亡细胞清除受损；这些未被清除的细胞最终会发生继发性坏死。坏死细胞会将促炎性的胞质成分、病原体和自身抗原释放到细胞外环境中，从而引发多种感染性、炎症性和自身免疫性疾病16,17。综上所述，细胞凋亡与胞葬作用共同促进了死亡和濒死细胞的清除，维持了组织稳态。

研究凋亡细胞吞噬作用（efferocytosis）的分子机制需要能够清晰量化凋亡细胞摄取的方法。这种量化较为复杂，原因在于与其他摄取机制（如内吞作用和吞噬作用）不同18,19，胞葬作用可能不会导致完整靶细胞的吞噬，从而引起凋亡细胞被胞葬细胞进行碎片化摄取20. 本文所述方案描述了一种 体外 一种可准确区分单个凋亡细胞被吞噬与未被吞噬部分的胞葬作用检测方法，并可与多种固定细胞和活细胞显微成像技术联用。传统的吞噬作用检测通常在实验结束时加入针对吞噬靶标的特异性抗体，以标记未被内化的靶标，而本方法则通过共价连接的生物素对凋亡靶标进行标记，从而实现区分。21,22虽然该实验可使用凋亡细胞特异性抗体，但生物素标记方法能够标记任何含蛋白质的目标物，并避免在进行免疫染色时可能出现的二抗交叉反应问题。本文详细阐述了经细胞示踪染料和生物素双重标记的凋亡Jurkat细胞的制备过程。细胞示踪染料可用于追踪在胞葬作用过程中来源于凋亡细胞的物质，而细胞表面的生物素标记则可用于区分被吞噬的凋亡细胞中已内化与未内化的部分。此外，我们还描述了J774.2和THP-1细胞系的培养与准备，分别用作小鼠和人类的胞葬细胞；以单核细胞来源的M2型巨噬细胞为例，说明原代细胞在胞葬作用中的应用；以及将Jurkat细胞作为胞葬作用靶细胞的使用方法。这些方法可轻松推广至其他细胞系或原代细胞，并适用于任何类型细胞死亡的靶细胞例如 细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡，以及通过脂质包被或配体包被模拟凋亡细胞的微米级模拟物，其中配体特异性针对目标胞葬受体。

本方案所述方法相较于该领域常用的基于流式细胞术的方法具有多项优势23,24。通过直接成像吞噬细胞与凋亡细胞之间的相互作用，并结合对总凋亡细胞物质和非内化凋亡细胞物质的明确标记，可对胞葬作用进行定量分析。此外，使用pH不敏感型荧光染料可减少某些替代方法中存在的干扰因素，例如在溶酶体pH条件下FITC和GFP荧光信号的淬灭问题25。最后，尽管未详细描述，这些方法也可与表达荧光标记转基因的胞葬细胞，或与固定后的免疫荧光染色相结合，从而实现对信号分子活性的定量以及对胞葬过程中细胞事件的动态监测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

采集健康志愿者的血液样本已获得西安大略大学健康科学研究伦理委员会的批准。静脉穿刺操作均遵循加拿大三机构政策声明（Tri-Council Policy Statement）关于人体研究的指南进行。

1. THP-1 单核细胞系的培养与制备

  1. 在 T25 培养瓶中以悬浮培养方式培养 THP-1 单核细胞，置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中。细胞应培养于 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) 培养基中，添加 10% 胎牛血清 (FBS)。
  2. 每天轻轻摇动培养瓶，使细胞在培养基中均匀悬浮，随后立即使用血细胞计数板进行细胞计数。当细胞密度达到 1 × 106 个细胞/mL 时，应进行传代：
    1. 将 RPMI 1640 + 10% FBS 培养基置于 37 °C 水浴中预热。
    2. 取 2 × 105 个细胞转移至 1.5 mL 微离心管或 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
    3. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并将沉淀重悬于 1 mL（1.5 mL 微离心管）或 5 mL（15 mL 圆锥形离心管）磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。
    4. 在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，随后小心吸除 PBS，避免扰动细胞沉淀。
    5. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜 RPMI 1640 + 10% FBS 培养基中。
    6. 向新的 T25 培养瓶中加入 4 mL 预热的培养基，再加入步骤 1.2.5 中重悬的细胞。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中继续培养，直至需要再次传代（通常为 3 天），或用于实验。
  3. 若需进行 THP-1 来源巨噬细胞的实验，应在传代前从培养瓶中取出所需数量的细胞并进行接种：
    1. 将所需数量的 18 mm 圆形玻璃盖玻片（#1.5 厚度）放入 12 孔板的各孔中——通常每种条件和/或时间点使用 1 片盖玻片。每孔接种 5 × 104 个 THP-1 单核细胞。根据需要可调整每孔接种的细胞数量。
    2. 使用预热至 37 °C 的 RPMI + 10% FBS 培养基将每孔总体积补至 1 mL。
    3. 向每孔加入 100 nM 佛波酯 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 (PMA)，培养 3 天以诱导 THP-1 单核细胞向类巨噬细胞分化。

2. J774.2 巨噬细胞系的培养与制备

  1. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下，将 J774.2 细胞培养于 T25 培养瓶中。细胞应使用 5 mL 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）加 10% 胎牛血清（FBS）进行培养，并在细胞融合度达到 80–90% 时传代。传代操作步骤如下：
    1. 从培养瓶中移除所有培养基，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次。
    2. 移除 PBS，加入 5 mL 新鲜的 DMEM 培养基（含 10% FBS）。
    3. 使用细胞刮刀刮取培养瓶底部，使细胞悬浮于培养基中。反复吹打数次，以充分分散细胞团块。
    4. 将细胞按 1:5 比例稀释：从培养瓶中移除 4 mL 细胞悬液，并补充 4 mL 新鲜培养基。剩余的细胞悬液可弃去，或用于在新的 T25 培养瓶中接种新培养物，或直接用于实验。
  2. 准备 J774.2 细胞的胞葬作用（efferocytosis）实验：
    1. 实验开始前一天，按照步骤 2.1.1–2.1.3 的方法，将 J774.2 细胞重悬于 5 mL 新鲜培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并配制所需体积的细胞悬液，使其浓度为 5 × 104 个细胞/mL。
    2. 将所需数量的 18 mm 圆形玻璃盖玻片（#1.5 厚度）放入 12 孔板的各孔中。每孔加入 1 mL 浓度为 5 × 104 个细胞/mL 的细胞悬液。
    3. 过夜培养，使细胞贴附于盖玻片并从传代过程中恢复。

3. 原代人M2巨噬细胞的培养

  1. 每需要一块12孔板的M2型巨噬细胞，采集10 mL肝素抗凝的人全血。
  2. 在15 mL离心管中，将5 mL人血叠加于5 mL预热的Lympholyte-poly细胞分离介质上方。若需处理更多样本，可制备多个离心管 >5 mL 血液，而不是使用更大体积的试管。
  3. 以中等加速度离心，300 × g 离心 35 分钟，不使用刹车。
  4. 小心吸取上层富含单个核细胞的条带，使用塑料移液器转移至一个50 mL离心管中。如果在步骤3.2中制备了多个离心管，可将各管中的条带合并至同一个50 mL离心管中。用PBS将管内液体体积补至50 mL。
  5. 300 × g 离心 8 分钟，弃上清。此步骤期间，将已灭菌的直径 18 mm 圆形盖玻片（#1.5 厚度）放入 12 孔板的每个孔中。
  6. 将细胞沉淀重悬于 300 µL 每所需孔数加入无血清RPMI 1640培养基； 例如， 如果处理10 mL血液以制备完整的12孔板，则将细胞沉淀重悬于3.6 mL培养基中。
  7. 添加 300 µL 将细胞悬液加入含盖玻片的12孔板各孔中。在37°C下孵育1小时 37 °C + 5% CO₂2.
  8. 用1 mL预热的PBS轻柔洗涤盖玻片3次，以去除未贴壁的细胞。
  9. 加入1 mL RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL 重组人M-CSF + 细胞培养用抗生素/抗真菌剂。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育。 37 °C + 5% CO₂2 5天。
  10. 更换培养基为 RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL 重组人 M-CSF + 10 ng/mL 重组人 IL-4 + 细胞培养用抗生素/抗真菌剂。置于 37 °C + 5% CO₂2 培养2天以完成M2极化。
  11. 极化巨噬细胞应在接下来的3天内使用。

4. 凋亡Jurkat细胞的制备

  1. 在 37 °C、5% CO2 条件下，将 Jurkat 细胞培养于 5 mL RPMI 1640 培养基（含 10% FBS）中。Jurkat 细胞为悬浮细胞系，可通过每 3–5 天以 1:5 比例传代至新鲜预温培养基中进行维持。
  2. 为制备凋亡细胞，使 Jurkat 细胞培养物生长至高密度（传代后 4–5 天）。取 1.5 mL 培养物转移至 1.5 mL 微量离心管中，于 500 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
  3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 1 µM 星形孢菌素（staurosporine）的无血清 RPMI 1640 培养基中。
  4. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 16 小时，以诱导细胞发生凋亡。
  5. 如需验证凋亡诱导效果，可使用 Annexin V 染色进行确认：
    1. 取 100 µL 经星形孢菌素处理的 Jurkat 细胞培养物至 1.5 mL 微量离心管中，于 500 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 无血清 RPMI 1640 培养基中。
    2. 加入 1 µL 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Annexin V，室温避光孵育 10 分钟。
    3. 加入 900 µL PBS，将全部液体转移至 12 孔板中一个含有 18 mm 圆形玻璃盖玻片（#1.5 厚度）的孔内。使用配备板架的离心机以 200 × g 离心 1 分钟，使细胞贴附于盖玻片表面。或者，也可将细胞置于带孔载玻片中用于成像。
    4. 使用荧光显微镜进行成像。

5. 使用固定细胞胞葬作用检测和由内向外染色法量化胞葬作用的摄取与动态过程

  1. 按照所述方法准备 THP-1、J774.2 或 M2 人巨噬细胞 第1-3节分别。
  2. 实验开始前一晚，按如下所述制备凋亡的Jurkat细胞 第4节.
  3. 实验开始前，立即使用血细胞计数板对凋亡细胞进行计数。将足够数量的凋亡细胞转移至1.5 mL微量离心管中——我们通常加入5 x 105 细胞/孔，使靶细胞：效应细胞比例为10:1。
  4. 以500 × g离心5分钟沉淀Jurkat细胞，然后重悬于 500 μL PBS。
  5. 离心期间，分装 10 µL 将DMSO加入一个新的1.5 mL微量离心管中。向DMSO中溶解极少量N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHS-Biotin），5–10个晶体（约0.005 mg）即可。
  6. 转移 500 μL 将凋亡细胞/PBS悬浮液加入含有DMSO/NHS-生物素的离心管中。然后将细胞示踪染料稀释至制造商推荐的浓度，并加入凋亡细胞悬浮液中。务必选择一种在光谱上不与FITC-链霉亲和素重叠的细胞示踪染料例如 红色或远红细胞示踪染料
  7. 室温避光孵育悬液20分钟。加入等体积的RPMI 1640 + 10% FBS，室温避光孵育5分钟，以淬灭未反应的染料。
  8. 500 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃上清，将染色的凋亡细胞重悬于 100 µL 每孔加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基
  9. 添加 100 µL 将染色的凋亡细胞悬液逐滴加入巨噬细胞的各孔中。使用配备板架的离心机，以200 × g离心1分钟，使巨噬细胞与凋亡细胞充分接触。
  10. 在所需时间内孵育平板 37 °C + 5% CO₂2 在组织培养孵箱中进行。对于巨噬细胞，胞葬作用所摄取的物质通常在20–30分钟后首次可检测到，120–180分钟后完成。
  11. 在预定时间点从培养箱中取出细胞。用1 mL室温PBS洗涤细胞两次，以终止胞葬作用并去除未被胞葬的凋亡细胞。
  12. 每孔加入1:1,000稀释的FITC标记链霉亲和素，避光孵育20分钟。此步骤将标记所有未被胞葬作用清除的凋亡细胞物质上暴露的生物素。
    注意：如有需要，可在该步骤中加入终浓度为1:20,000的Hoechst 33342或4',6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）对细胞核进行染色。
  13. 用1 mL PBS洗涤细胞3次，每次轻轻振荡或摇动样本5分钟。在室温下用PBS中的4%多聚甲醛（PFA）固定细胞20分钟。用PBS冲洗细胞一次，以去除多余的PFA。
  14. 将盖玻片固定在载玻片上用于成像，并转移至荧光显微镜。采集足够数量细胞的z轴层扫图像，以实现准确的定量分析——通常每种条件需采集10–30个细胞。在所得图像中，未被内化的凋亡细胞物质表现为被细胞示踪染料标记且被FITC-链霉亲和素染色包裹的物质，而被胞葬作用吞噬的物质则呈现为独立的、仅含细胞示踪染料的点状结构，无任何链霉亲和素染色。
  15. 通过多种指标对所得图像中的胞葬作用进行定量分析：
    1. 通过测定每个细胞中离散的胞葬小体（细胞示踪染料）的平均数量来计算胞葬指数+链霉亲和素- 每个巨噬细胞的吞噬小体数量。仅对结合了凋亡细胞或含有≥1个可见效应小体（efferosomes）的巨噬细胞进行定量。记录那些结合了凋亡细胞但缺乏明显效应小体的巨噬细胞，其胞葬活性指数（efferocytic index）记为0。
    2. 通过测量含有至少一个胞葬小体的巨噬细胞比例来计算胞葬效率。
    3. 通过在多个时间点对固定并染色的细胞进行成像，计算吞噬凋亡细胞的速率。仅对结合了凋亡细胞或含有可见efferosome的巨噬细胞进行成像，并采集每个细胞的z轴层扫图像。成像完成后，确定吞噬凋亡细胞的速率：
      1. 以链霉亲和素染色作为引导，使用 FIJI/ImageJ 中的徒手或套索选择工具26 （或其他图像分析软件），圈出所有细胞示踪染料+/streptavidin- (例如 在z轴堆栈的单一层面上测量被内化的物质。测定该区域内细胞示踪染料的总荧光强度。每个效应小体的单独测量值（例如 直径，相对于细胞边界或细胞核的位置 等等。)15,27 可轻松与这些测量同时获取，从而显著增加分析过程中收集的数据量。
      2. 在同一Z轴层面，以链霉亲和素染色为参考，使用自由手绘或套索选择工具，圈出所有细胞示踪染料。+/streptavidin+ (例如 单层z轴堆栈图像中未内化的物质。仅包含与吞噬细胞接触的凋亡细胞的染色信号。测量该区域的总荧光强度。
      3. 重复步骤 4.2.3.1 至 4.2.3.2，处理图像中其余的 z 层切片。对已吞噬凋亡细胞的（Σeff）以及未被胞葬的（Σne）材料。可计算被胞葬的凋亡细胞占细胞的比例，公式如下：
        吞噬清除率公式 Σeff/(Σeff+Σne)，数学方程
      4. 量化所有时间点下所有细胞的吞噬清除比例。需要注意的是，由于不同凋亡细胞对细胞示踪染料的摄取存在差异，以及图像采集参数（如曝光时间）的变化，凋亡细胞/吞噬体的荧光强度在不同图像之间可能有所不同。因此，在不同图像、不同实验条件以及重复实验之间进行比较时，仅可比较归一化后的数值（如吞噬清除比例），或与荧光强度无关的数值（如吞噬指数和吞噬效率）。
    4. 为确保所得数据集准确反映细胞间胞葬作用的差异，应在每次实验中尽可能对最多数量的细胞进行这些分析。
      注意：凋亡细胞清除效率和凋亡细胞清除指数可快速计算（每细胞数秒），我们通常每项实验至少分析100个细胞，并至少重复实验3次。计算被清除凋亡物质的比例以及凋亡小体特异性参数较为耗时，经验丰富的分析人员通常需要每细胞2–3分钟。对于此类计算，我们每项实验每种条件下至少定量15个细胞。
    5. 记录每个细胞的胞葬指数、被胞葬的细胞比例及单个胞葬体数据。
      注意：这允许使用单细胞方法进行数据分析，从而能够量化细胞间的变异。仍可通过平均单个实验中获得的单细胞数据，在这些数据集上进行群体水平的分析。效应体特异性测量可在群体水平、单细胞水平以及集合水平进行分析例如 作为独立于其所含细胞的效应小体群体）15.

6. 使用凋亡细胞的活细胞吞噬清除实验

  1. 分别按照步骤1-3所述方法准备THP-1、J774.2或M2型巨噬细胞。如实验需要，应在进行任何实验前至少18 h对细胞进行外源基因或其他遗传载体的转染。
  2. 实验开始前一晚，按照第4和第5节所述方法制备凋亡的Jurkat细胞，但需进行如下修改：
    1. 按照4.1–4.3步骤稀释细胞并诱导凋亡，并按照5.3–5.4步骤收集所需数量的凋亡细胞。
    2. 按照制造商推荐的浓度，向凋亡细胞悬液中加入细胞示踪染料。室温避光孵育20分钟。加入等体积的RPMI 1640 + 10% FBS，室温避光孵育5分钟，以淬灭未反应的染料。本实验中不要加入NHS-生物素。
    3. 500 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃上清，将染色的凋亡细胞重悬于 100 µL 每孔加入含10% FBS的RPMI 1640培养基。
  3. 如需标记巨噬细胞，可移除每孔中的培养基，并加入 500 µL 加入含有制造商推荐稀释度的细胞示踪染料的 PBS，该染料的光谱不与添加至凋亡细胞的细胞示踪染料或巨噬细胞表达的任何荧光转基因发生重叠。室温避光孵育 20 分钟，然后加入等体积的 DMEM + 10% FBS，室温避光再孵育 5 分钟，以淬灭未反应的染料。
  4. 将含有巨噬细胞的盖玻片转移至勒伊登室，加入 400 µL DMEM + 10% FBS，随后 100 µL 标记的凋亡细胞悬液。用移液器轻轻吹打培养基2–3次以混匀。
  5. 将Leiden室转移至加热且含CO₂的环境中2活细胞荧光显微镜的灌流腔室
    注意：对于缺少 CO₂ 控制的显微镜系统2 灌注能力，当培养物暴露于空气中时，使用含1 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲的组织培养基，而非碳酸氢钠缓冲体系，以维持生理pH。
  6. 拍摄一系列延时图像，包括白光（相差或微分干涉差）图像以及所有荧光标记的图像：
    1. 在需要分辨细微结构的实验中，使用100倍物镜（例如 吞噬细胞-凋亡细胞相互作用的膜动力学）。同时，更一般的测量指标（凋亡细胞摄取率、巨噬细胞与凋亡细胞之间的相互作用时间， 等等。最好使用 60X 或 63X 物镜进行成像。
    2. 如有条件，可使用点位访问（point-visiting）技术在单次采集中对多个视野进行成像，从而增加单个实验中捕获的胞葬事件数量
    3. 由于效应细胞通常吞噬的是凋亡细胞的碎片而非完整的细胞，因此最好采集z轴层扫图像。为尽量减少光毒性，z轴切片的间隔应等于显微镜物镜的焦深（通常为0.5–1.0 µm），贯穿细胞的厚度（通常为8-10 µm 用于巨噬细胞， 例如 8–20 切片/细胞）。这可确保所有吞噬和转运事件至少在一个 z 平面上可见。或者，使用大视野（1–5 µm 直径）凋亡细胞模拟物或在胞葬过程中发生极少碎裂的凋亡细胞（例如 热休克中性粒细胞）而不进行Z轴层扫。我们此前已描述过这两种模拟物和凋亡中性粒细胞的制备方法28.
    4. 为尽量减少光漂白，应使用高亮度的荧光染料，并采用可最大限度减少光漂白的成像采集参数进行图像采集。 例如 低强度激发结合高相机增益与短曝光时间29我们强烈建议使用配备高灵敏度电磁电荷耦合器件（EM-CCD）相机或转盘共聚焦系统以及高速压电机械载物台的显微镜进行此类成像。
  7. 可应用于这些延时视频的分析方法数量众多，难以在此全面综述。举例而言，可使用手动或自动追踪软件来追踪细胞内吞噬体的融合、分裂及运动过程15通过表达区室特异性荧光转基因的巨噬细胞进行共定位分析，定量测定凋亡小体与内溶酶体的融合动态13，监测探查和杯状结构形成等摄取过程30，确定信号转导和运输蛋白向效应体的募集动态13，和/或利用带有pH敏感、氧化敏感或蛋白酶激活荧光探针标记的凋亡细胞来定量检测效应小体的降解活性31.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

Jurkat 细胞的过夜培养 1 µM staurosporine 导致细胞凋亡 >95% 的细胞，可通过 Annexin V 染色确认（图1）。其他细胞类型也可用于这些实验，但需针对每种细胞系优化星形孢素的浓度及其处理时间。为可靠地检测和定量胞葬作用， >在将细胞加入胞葬细胞之前，应有80%的细胞处于凋亡状态。其他凋亡诱导剂（例如 热激、依托泊苷和紫外光也可用于诱导，但根据我们的经验，这些方法会导致细胞凋亡的诱导更加不均一，从而产生包含凋亡细胞、继发性坏死细胞以及非凋亡靶细胞的混合细胞群体。

对于采用细胞内染色的固定细胞成像，应在所有时间点观察到紧密贴附的吞噬细胞-凋亡细胞相互作用，清晰区分未被吞噬的（链霉亲和素+/细胞示踪染料+）和已被吞噬的（链霉亲和素-/细胞示踪染料+）...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案中概述的方法能够利用固定细胞和活细胞成像技术，对动态的胞葬过程进行成像和定量分析。这些方法相较于常用的基于流式细胞术的检测方法具有多项优势23,24。采用固定样本的由内而外染色法可更可靠、更准确地量化胞葬的速率和程度——事实上，许多基于流式细胞术的方法仅使用不同的荧光染料分别标记凋亡细胞和巨噬细胞，并将共染有凋亡细胞标记物的巨噬细胞比例作为胞葬活性的读数，因而无法区分结合于细胞表面与已被内吞的凋亡细胞物质。另一种基于流式细胞术的方法是使用pHrodo标记的凋亡细胞24。pHrodo是一种pH敏感性荧光染料，在酸性pH条件下荧光强度增强。尽管该染料可在非内吞与内吞物质之间提供更好的分辨能力，因为其荧光在凋亡细胞被内化并形成酸化的胞葬体（efferosome）后才特异性增强，但该方法的结果可能受到某些疾病过程的干扰，这些疾病会损害胞葬体的酸化过程34,35...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）运营资助项目 MOP-123419、加拿大自然科学与工程研究理事会发现资助项目 418194，以及安大略省研究与创新部早期研究奖（授予 BH）资助。DGW 参与了部分展示图像的提供、实验方案的优化以及手稿的撰写；其研究得到了利物浦大学启动资金的资助。CY 由瓦尼尔研究生奖学金及 CIHR 医学/博士生奖学金资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿撰写过程中均未发挥任何作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640 培养基Wisent3500-000-EL
DMEM 培养基Wisent319-005-CL
胎牛血清（FBS）Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 mm 圆形玻璃盖玻片，#1.5 厚度Electron Microscopy Sciences72290-08盖玻片的尺寸和形状并非关键，但 18 mm 可适配标准 12 孔板的孔，便于细胞培养
星形孢菌素（Staurosporine）Cayman Chemical81590用 DMSO 溶解至 1 mM（1,000 倍储存液）
Annexin V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217储存于干燥器中。请勿配制储存液。
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Lympholyte-poly 细胞分离介质Cedarlane LabsCL5071
重组人 M-CSFPeprotech200-04
重组人 IL-4Peprotech300-25
J774.2 巨噬细胞系Sigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 人单核细胞系ATCCTIB-202
Jurkat T 细胞系ATCCTIB-152

参考文献

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529(2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863(1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884(2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004(2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964(2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Z

相关文章