通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

摘要

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。

摘要

研究胞葬作用的调控机制需要能够准确定量凋亡细胞摄取情况，并探究控制胞葬作用的信号传导和细胞过程的方法。由于凋亡细胞通常被片段化地吞噬，因此准确定量具有挑战性，这就要求方法能够清晰区分已被吞噬的凋亡细胞部分与残余未被吞噬的细胞碎片。本文所述方法采用双标记策略，以准确量化胞葬作用的动力学过程以及吞噬细胞（如巨噬细胞）的胞葬能力。通过使用细胞示踪染料标记凋亡细胞的胞质，可追踪所有来源于凋亡细胞的物质；同时对凋亡细胞进行表面生物素化标记，以区分已内化与未内化的凋亡细胞组分。通过采集活细胞或固定细胞的荧光图像，并利用链霉亲和素染色区分结合态与内化态的靶标，从而确定吞噬细胞的胞葬能力。与流式细胞术等方法相比，该方法具有多项优势：能够准确区分未被吞噬与已被吞噬的凋亡细胞组分，可通过活细胞显微镜观察测量胞葬动力学，并可对表达荧光标记转基因的细胞进行细胞内信号通路研究。综上所述，本实验方案中描述的方法构成了一种灵活的实验体系，可用于准确定量胞葬活性，并深入探究胞葬过程中活跃的细胞信号通路。

引言

细胞凋亡，即程序性细胞死亡，是一种高度调控的生理过程，存在于大多数多细胞生物中，对其发育和稳态维持至关重要¹。除了参与正常的细胞更替和胚胎发育外，细胞凋亡还能清除组织中受感染或受损的细胞，并可由感染、炎症、癌症以及放射治疗或类固醇等医疗干预手段所触发¹。凋亡细胞在其细胞表面暴露被称为"吃我"的信号，这些信号可被多种专业性和非专业性吞噬细胞表面的受体识别，这些吞噬细胞统称为"清除细胞（efferocytes）"。这些受体的激活会诱导清除细胞通过一种称为胞葬作用（efferocytosis）的过程，将凋亡细胞摄入并降解^2,3。磷脂酰丝氨酸是目前研究最清楚的驱动胞葬作用的“吃我”信号。在正常情况下，它局限于质膜的内小叶；当细胞发生凋亡时，脂质翻转酶（lipid scramblase）被激活，破坏膜的不对称性，从而使磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面⁴。某些非凋亡细胞（如成熟巨噬细胞和活化的血小板）的胞外表面也存在磷脂酰丝氨酸。然而，由于这些细胞表面表达诸如CD47等"别吃我"信号，因此不会被清除细胞吞噬^5,6,

方案

采集健康志愿者的血液样本已获得西安大略大学健康科学研究伦理委员会的批准。静脉穿刺操作均遵循加拿大三机构政策声明（Tri-Council Policy Statement）关于人体研究的指南进行。

1. THP-1 单核细胞系的培养与制备

1. 在 T25 培养瓶中以悬浮培养方式培养 THP-1 单核细胞，置于 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中。细胞应培养于 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) 培养基中，添加 10% 胎牛血清 (FBS)。
2. 每天轻轻摇动培养瓶，使细胞在培养基中均匀悬浮，随后立即使用血细胞计数板进行细胞计数。当细胞密度达到 1 × 10⁶ 个细胞/mL 时，应进行传代：
   1. 将 RPMI 1640 + 10% FBS 培养基置于 37 °C 水浴中预热。
   2. 取 2 × 10⁵ 个细胞转移至 1.5 mL 微离心管或 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
   3. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并将沉淀重悬于 1 mL（1.5 mL 微离心管）或 5 mL（15 mL 圆锥形离心管）磷酸盐缓冲液 (PBS) 中。
   4. 在室温下以 ....

结果

Jurkat 细胞的过夜培养 1 µM staurosporine 导致细胞凋亡 >95% 的细胞，可通过 Annexin V 染色确认（图1）。其他细胞类型也可用于这些实验，但需针对每种细胞系优化星形孢素的浓度及其处理时间。为可靠地检测和定量胞葬作用， >在将细胞加入胞葬细胞之前，应有80%的细胞处于凋亡状态。其他凋亡诱导剂（例如 热激、依托泊苷和紫外光也可用于诱导，但根据我们的经验，这些方法会导致细胞凋亡的诱导更加不均一，从而产生包含凋亡细胞、继发性坏死细胞以及非凋亡靶细胞的混合细胞群体。

对于采用细胞内染色的固定细胞成像，应在所有时间点观察到紧密贴附的吞噬细胞-凋亡细胞相互作用，清晰区分未被吞噬的（链霉亲和素⁺/细胞示踪染料⁺）和已被吞噬的（链霉亲和素^-/细胞示踪染料⁺）.......

讨论

本方案中概述的方法能够利用固定细胞和活细胞成像技术，对动态的胞葬过程进行成像和定量分析。这些方法相较于常用的基于流式细胞术的检测方法具有多项优势^23,24。采用固定样本的由内而外染色法可更可靠、更准确地量化胞葬的速率和程度——事实上，许多基于流式细胞术的方法仅使用不同的荧光染料分别标记凋亡细胞和巨噬细胞，并将共染有凋亡细胞标记物的巨噬细胞比例作为胞葬活性的读数，因而无法区分结合于细胞表面与已被内吞的凋亡细胞物质。另一种基于流式细胞术的方法是使用pHrodo标记的凋亡细胞²⁴。pHrodo是一种pH敏感性荧光染料，在酸性pH条件下荧光强度增强。尽管该染料可在非内吞与内吞物质之间提供更好的分辨能力，因为其荧光在凋亡细胞被内化并形成酸化的胞葬体（efferosome）后才特异性增强，但该方法的结果可能受到某些疾病过程的干扰，这些疾病会损害胞葬体的酸化过程^34,35.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 培养基	Wisent	3500-000-EL
DMEM 培养基	Wisent	319-005-CL
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm 圆形玻璃盖玻片，#1.5 厚度	Electron Microscopy Sciences	72290-08	盖玻片的尺寸和形状并非关键，但 18 mm 可适配标准 12 孔板的孔，便于细胞培养
星形孢菌素（Staurosporine）	Cayman Chemical	81590	用 DMSO 溶解至 1 mM（1,000 倍储存液）
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	储存于干燥器中。请勿配制储存液。
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly 细胞分离介质	Cedarlane Labs	CL5071
重组人 M-CSF	Peprotech	200-04
重组人 IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 巨噬细胞系	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 人单核细胞系	ATCC	TIB-202
Jurkat T 细胞系	ATCC	TIB-152