胞葬作用(efferocytosis)是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程,对于维持机体稳态至关重要,该过程依赖于一系列受体和信号通路,以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。
胞葬作用(efferocytosis)是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程,对于维持机体稳态至关重要,该过程依赖于一系列受体和信号通路,以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。
研究胞葬作用的调控机制需要能够准确定量凋亡细胞摄取情况,并探究控制胞葬作用的信号传导和细胞过程的方法。由于凋亡细胞通常被片段化地吞噬,因此准确定量具有挑战性,这就要求方法能够清晰区分已被吞噬的凋亡细胞部分与残余未被吞噬的细胞碎片。本文所述方法采用双标记策略,以准确量化胞葬作用的动力学过程以及吞噬细胞(如巨噬细胞)的胞葬能力。通过使用细胞示踪染料标记凋亡细胞的胞质,可追踪所有来源于凋亡细胞的物质;同时对凋亡细胞进行表面生物素化标记,以区分已内化与未内化的凋亡细胞组分。通过采集活细胞或固定细胞的荧光图像,并利用链霉亲和素染色区分结合态与内化态的靶标,从而确定吞噬细胞的胞葬能力。与流式细胞术等方法相比,该方法具有多项优势:能够准确区分未被吞噬与已被吞噬的凋亡细胞组分,可通过活细胞显微镜观察测量胞葬动力学,并可对表达荧光标记转基因的细胞进行细胞内信号通路研究。综上所述,本实验方案中描述的方法构成了一种灵活的实验体系,可用于准确定量胞葬活性,并深入探究胞葬过程中活跃的细胞信号通路。
细胞凋亡,即程序性细胞死亡,是一种高度调控的生理过程,存在于大多数多细胞生物中,对其发育和稳态维持至关重要1。除了参与正常的细胞更替和胚胎发育外,细胞凋亡还能清除组织中受感染或受损的细胞,并可由感染、炎症、癌症以及放射治疗或类固醇等医疗干预手段所触发1。凋亡细胞在其细胞表面暴露被称为"吃我"的信号,这些信号可被多种专业性和非专业性吞噬细胞表面的受体识别,这些吞噬细胞统称为"清除细胞(efferocytes)"。这些受体的激活会诱导清除细胞通过一种称为胞葬作用(efferocytosis)的过程,将凋亡细胞摄入并降解2,3。磷脂酰丝氨酸是目前研究最清楚的驱动胞葬作用的“吃我”信号。在正常情况下,它局限于质膜的内小叶;当细胞发生凋亡时,脂质翻转酶(lipid scramblase)被激活,破坏膜的不对称性,从而使磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面4。某些非凋亡细胞(如成熟巨噬细胞和活化的血小板)的胞外表面也存在磷脂酰丝氨酸。然而,由于这些细胞表面表达诸如CD47等"别吃我"信号,因此不会被清除细胞吞噬5,6,7。暴露的磷脂酰丝氨酸可被清除细胞表达的一系列胞葬受体识别。这些受体直接或借助调理素间接结合磷脂酰丝氨酸后,会激活促进凋亡细胞被包裹进入一种膜结合空泡(称为胞葬体,efferosome)的信号通路8,9,10,11,12。胞葬体依次与内体和溶酶体融合,后者提供必要的分子机制以酸化胞葬体并降解其中的凋亡细胞内容物13,14。降解完成后,来源于凋亡细胞的物质被转运至回收内体——这一过程可限制机体对凋亡细胞来源抗原的免疫反应,也可能实现从凋亡细胞中回收营养物质13,15。若胞葬作用发生障碍,则会导致凋亡细胞清除受损;这些未被清除的细胞最终会发生继发性坏死。坏死细胞会将促炎性的胞质成分、病原体和自身抗原释放到细胞外环境中,从而引发多种感染性、炎症性和自身免疫性疾病16,17。综上所述,细胞凋亡与胞葬作用共同促进了死亡和濒死细胞的清除,维持了组织稳态。
研究凋亡细胞吞噬作用(efferocytosis)的分子机制需要能够清晰量化凋亡细胞摄取的方法。这种量化较为复杂,原因在于与其他摄取机制(如内吞作用和吞噬作用)不同18,19,胞葬作用可能不会导致完整靶细胞的吞噬,从而引起凋亡细胞被胞葬细胞进行碎片化摄取20. 本文所述方案描述了一种 体外 一种可准确区分单个凋亡细胞被吞噬与未被吞噬部分的胞葬作用检测方法,并可与多种固定细胞和活细胞显微成像技术联用。传统的吞噬作用检测通常在实验结束时加入针对吞噬靶标的特异性抗体,以标记未被内化的靶标,而本方法则通过共价连接的生物素对凋亡靶标进行标记,从而实现区分。21,22虽然该实验可使用凋亡细胞特异性抗体,但生物素标记方法能够标记任何含蛋白质的目标物,并避免在进行免疫染色时可能出现的二抗交叉反应问题。本文详细阐述了经细胞示踪染料和生物素双重标记的凋亡Jurkat细胞的制备过程。细胞示踪染料可用于追踪在胞葬作用过程中来源于凋亡细胞的物质,而细胞表面的生物素标记则可用于区分被吞噬的凋亡细胞中已内化与未内化的部分。此外,我们还描述了J774.2和THP-1细胞系的培养与准备,分别用作小鼠和人类的胞葬细胞;以单核细胞来源的M2型巨噬细胞为例,说明原代细胞在胞葬作用中的应用;以及将Jurkat细胞作为胞葬作用靶细胞的使用方法。这些方法可轻松推广至其他细胞系或原代细胞,并适用于任何类型细胞死亡的靶细胞例如 细胞凋亡、坏死和坏死性凋亡,以及通过脂质包被或配体包被模拟凋亡细胞的微米级模拟物,其中配体特异性针对目标胞葬受体。
本方案所述方法相较于该领域常用的基于流式细胞术的方法具有多项优势23,24。通过直接成像吞噬细胞与凋亡细胞之间的相互作用,并结合对总凋亡细胞物质和非内化凋亡细胞物质的明确标记,可对胞葬作用进行定量分析。此外,使用pH不敏感型荧光染料可减少某些替代方法中存在的干扰因素,例如在溶酶体pH条件下FITC和GFP荧光信号的淬灭问题25。最后,尽管未详细描述,这些方法也可与表达荧光标记转基因的胞葬细胞,或与固定后的免疫荧光染色相结合,从而实现对信号分子活性的定量以及对胞葬过程中细胞事件的动态监测。
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采集健康志愿者的血液样本已获得西安大略大学健康科学研究伦理委员会的批准。静脉穿刺操作均遵循加拿大三机构政策声明(Tri-Council Policy Statement)关于人体研究的指南进行。
1. THP-1 单核细胞系的培养与制备
2. J774.2 巨噬细胞系的培养与制备
3. 原代人M2巨噬细胞的培养
4. 凋亡Jurkat细胞的制备
5. 使用固定细胞胞葬作用检测和由内向外染色法量化胞葬作用的摄取与动态过程

6. 使用凋亡细胞的活细胞吞噬清除实验
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Jurkat 细胞的过夜培养 1 µM staurosporine 导致细胞凋亡 >95% 的细胞,可通过 Annexin V 染色确认(图1)。其他细胞类型也可用于这些实验,但需针对每种细胞系优化星形孢素的浓度及其处理时间。为可靠地检测和定量胞葬作用, >在将细胞加入胞葬细胞之前,应有80%的细胞处于凋亡状态。其他凋亡诱导剂(例如 热激、依托泊苷和紫外光也可用于诱导,但根据我们的经验,这些方法会导致细胞凋亡的诱导更加不均一,从而产生包含凋亡细胞、继发性坏死细胞以及非凋亡靶细胞的混合细胞群体。
对于采用细胞内染色的固定细胞成像,应在所有时间点观察到紧密贴附的吞噬细胞-凋亡细胞相互作用,清晰区分未被吞噬的(链霉亲和素+/细胞示踪染料+)和已被吞噬的(链霉亲和素-/细胞示踪染料+)...
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本方案中概述的方法能够利用固定细胞和活细胞成像技术,对动态的胞葬过程进行成像和定量分析。这些方法相较于常用的基于流式细胞术的检测方法具有多项优势23,24。采用固定样本的由内而外染色法可更可靠、更准确地量化胞葬的速率和程度——事实上,许多基于流式细胞术的方法仅使用不同的荧光染料分别标记凋亡细胞和巨噬细胞,并将共染有凋亡细胞标记物的巨噬细胞比例作为胞葬活性的读数,因而无法区分结合于细胞表面与已被内吞的凋亡细胞物质。另一种基于流式细胞术的方法是使用pHrodo标记的凋亡细胞24。pHrodo是一种pH敏感性荧光染料,在酸性pH条件下荧光强度增强。尽管该染料可在非内吞与内吞物质之间提供更好的分辨能力,因为其荧光在凋亡细胞被内化并形成酸化的胞葬体(efferosome)后才特异性增强,但该方法的结果可能受到某些疾病过程的干扰,这些疾病会损害胞葬体的酸化过程34,35...
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作者声明无利益冲突。
本研究由加拿大卫生研究院(CIHR)运营资助项目 MOP-123419、加拿大自然科学与工程研究理事会发现资助项目 418194,以及安大略省研究与创新部早期研究奖(授予 BH)资助。DGW 参与了部分展示图像的提供、实验方案的优化以及手稿的撰写;其研究得到了利物浦大学启动资金的资助。CY 由瓦尼尔研究生奖学金及 CIHR 医学/博士生奖学金资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿撰写过程中均未发挥任何作用。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 培养基 | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM 培养基 | Wisent | 319-005-CL | |
| 胎牛血清(FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 mm 圆形玻璃盖玻片,#1.5 厚度 | Electron Microscopy Sciences | 72290-08 | 盖玻片的尺寸和形状并非关键,但 18 mm 可适配标准 12 孔板的孔,便于细胞培养 |
| 星形孢菌素(Staurosporine) | Cayman Chemical | 81590 | 用 DMSO 溶解至 1 mM(1,000 倍储存液) |
| Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | 储存于干燥器中。请勿配制储存液。 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Lympholyte-poly 细胞分离介质 | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| 重组人 M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| 重组人 IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 巨噬细胞系 | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 人单核细胞系 | ATCC | TIB-202 | |
| Jurkat T 细胞系 | ATCC | TIB-152 |
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