本文详细描述了一种基于银纳米颗粒的方法，用于改善实验性胆道闭锁小鼠模型中的胆道闭锁综合征。充分掌握试剂制备过程及新生小鼠注射技术，将有助于研究人员熟悉在新生小鼠模型研究中所采用的这一方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
胆道闭锁（BA）是一种严重的儿童胆管炎类型，具有较高的死亡率，其病因至今尚未完全明确。病毒感染可能是潜在病因之一。目前用于研究BA的典型动物模型是通过向新生小鼠接种恒河猴轮状病毒建立的。已有研究表明，银纳米颗粒具有抗菌和抗病毒作用，本研究旨在评估其在BA小鼠模型中的功能。当前在BA动物实验中，改善BA小鼠症状的方法通常为对症治疗 通过 食物或其他药物。本研究旨在通过腹腔注射银纳米颗粒，展示一种改善小鼠胆道闭锁（BA）综合征的新方法，并提供制备银纳米颗粒凝胶制剂的详细步骤。该方法操作简便、适用广泛，可用于BA发病机制的研究以及临床治疗探索。基于BA小鼠模型，当小鼠出现黄疸症状时，将制备好的银纳米颗粒凝胶注射至肝脏下表面的腹腔内，观察小鼠存活情况，并检测生化指标和肝脏组织病理学变化。该方法有助于更直观地理解BA模型的建立及新型BA治疗方法的效果。
引言
胆道闭锁是一种以持续性黄疸为特征的胆汁淤积性疾病，在未进行肝移植的情况下具有较高的死亡率。病毒感染与胆道闭锁的发病机制密切相关。巨细胞病毒、呼肠孤病毒和轮状病毒均已被认为是胆道闭锁的可能病原体1,2,3。在新生儿期，未成熟免疫系统对病毒感染的反应可导致针对肝内和肝外胆管的免疫失调，进而引起胆管上皮细胞凋亡、门脉区炎性细胞浸润、肝内和肝外胆管阻塞，最终发展为肝纤维化4,5,6。
胆道闭锁（BA）研究中常用的动物模型是将恒河猴轮状病毒（RRV）接种于新生小鼠。小鼠通常在5至6天后出现黄疸，表现为体重偏低和陶土样粪便。免疫反应在疾病发生过程中的作用至关重要，尤其是自然杀伤（NK）细胞；使用抗NKG2D抗体耗竭这些细胞可显著减轻BA引起的损伤7。此外，其他细胞类型，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、树突状细胞和调节性T细胞，均已被证实参与该疾病过程8,9,10,11。所有数据均表明，免疫系统在BA病程中具有不可或缺的作用。
银纳米颗粒（AgNPs）已被证明对某些传染病（包括细菌感染）具有有益作用12 以及病毒感染13,14,15然而，除皮肤病学应用外，很少有研究将AgNPs用于临床治疗，主要原因是其潜在的毒性。在动物实验中，研究人员通常研究经给药的AgNPs的疗效 通过 口服16 或静脉注射方法17然而，尚无其他研究人员研究过经给药的AgNPs的疗效 通过 在新生小鼠实验中，腹腔（i.p.）注射是一种简单快速的方法，可更直接地作用于肝脏和胆管，同时降低对其他系统（如免疫系统）的毒性。已有研究表明，AgNPs 可影响 NK 细胞活性18；因此，我们检测了经给药的AgNPs的治疗效果 通过 在BA小鼠模型中进行i.p.注射。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验方案均已获得中山大学实验动物中心机构动物护理和使用委员会批准（#IACUC-DB-16-0602）。
1. 建立胆道闭锁小鼠模型
- 将怀孕的 BALB/c 小鼠饲养在 25 °C、12 小时暗/光循环的无特定病原体环境中，并提供高压灭菌饲料 随意摄取.
- 为制备RRV毒株MMU 18006，需在MA104细胞中扩增病毒，并通过空斑实验测定病毒滴度19.
注意：MA104 细胞在含有 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，培养箱内环境为含 5% CO₂ 的湿润空气2扩增步骤简要概述如下。- 感染MA104细胞（1.5 × 10⁵）7) 在一个150 cm2 含胰蛋白酶激活的RRV的培养瓶 [1.5 x 106 空斑形成单位（PFU）溶于30 mL无血清培养基中。将感染后的细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育3天。2.
- 通过三次冻融循环裂解培养瓶中的感染细胞，每次在 -80 °C 冰箱中冷冻 20 分钟，随后将细胞恢复至室温；细胞相关的病毒颗粒将释放到上清液中。然后，收集细胞裂解物和培养上清液，并转移至 15 mL 锥形管中。
- 通过低速离心（300 x g）从裂解液中去除大颗粒细胞碎片 g 在4 °C下离心3分钟。然后，将含有病毒的上清液（约6 mL）转移至新的15 mL离心管中，用于动物实验。
注意：RRV 现已可用于滴定、分装和保存，或进行额外的扩增循环。长时间暴露于室温会降低病毒的感染能力；病毒应置于冰上，并储存于 -80 °C 或液氮中。
- 使用29 G针头的1 mL胰岛素注射器吸取RRV，用于新生小鼠注射。
注意：定量注射器的粗针头容易导致药物泄漏。 - 出生后24小时内，给每只新生幼崽注射20 µL浓度为1.2 × 105 PFU/mL RRV 通过 腹腔注射途径；使用与对照组相同体积的生理盐水。
注意：本实验所用注射器为1 mL胰岛素注射器。因其他原因在出生后前2天内死亡且未被母鼠喂养的感染小鼠未纳入分析。 - 密切观察所有新生小鼠，并每日称重。通常在RRV接种后的第6天，小鼠耳部和无毛皮肤出现黄疸，粪便呈陶土色，毛发变得油腻，提示胆道闭锁（BA）模型已成功建立；需检查上述症状。
注意：可通过肝组织切片检查确认BA & E 和免疫组织化学染色。随后，BA 小鼠即可进行 AgNP 处理。
警告：本方案适用于当前的动物和人类轮状病毒（RV）毒株，必须在生物安全二级（BSL-2）条件下操作。
2. 银纳米颗粒的合成
- 按照先前所述方法制备并表征银纳米颗粒（AgNPs）12,20。
注意：银纳米颗粒（AgNPs）的制备与表征细节已在香港大学化学系C. M. Che团队发表的文献中详细描述12,20。最终溶液浓度为1 mM。银纳米颗粒的平均直径为10 nm（范围为5至15 nm），并通过电子显微镜确认。
3. 银纳米颗粒胶原混合物的制备
注意：AgNP 胶原混合物的制备与表征方法如前所述21，并在 4 °C 下保存。所有操作必须在冰上进行。
- 首先，进行胶原蛋白的制备：将 490 µL I 型胶原蛋白（4 mg/mL）加入 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。
- 向胶原蛋白中加入 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS，10x），并用移液器混匀。
- 配制 1 L 10x PBS 缓冲液的方法：将 80 g NaCl、2 g KCl 和 35.8 g Na2HPO4.12H2O 与 2.4 g KH2PO4 混合，加水定容至 1 L，缓冲液于室温保存。
- 然后，向上述溶液中加入 10 µL NaOH（0.2 M），并混匀。
- 配制 0.2 M NaOH 溶液：将 8 g NaOH 粉末溶于 1 L 去离子水中。
- 最后，向胶原蛋白溶液中加入 400 µL AgNPs（1 mM），并用移液器充分混匀。
注意：为确保混合均匀，AgNPs 应最后加入。AgNP-胶原蛋白混合物需在 4 °C 保存；否则在室温下容易发生凝固。
4. 小鼠注射方法
- 在治疗组感染新生小鼠出现黄疸后，通过腹腔注射给予50 µL AgNP胶原混合物；3天后进行第二次注射。
注意：感染对照组（RRV对照组）小鼠给予相同体积的生理盐水，正常对照组小鼠不给予任何处理。 - 注射开始时，用无名指斜压小鼠右大腿，以15°角缓慢插入针头（图1）。当针头深入约0.5 cm到达肝脏下缘表面时（图2），注入AgNP胶原混合物，然后缓慢拔出针头。
注意：注意避免将空气注入注射器，否则可能导致新生小鼠死亡。在新生小鼠中，胃和脾脏位于左腹部，胃内充满乳汁。若从此侧注射，针头可能容易刺入胃部，导致乳汁流入腹腔，或刺入脾脏引起出血。
警告：注意针头操作，防止刺伤手指；注射后务必套上针帽，取下针头并放入锐器盒中。 - 完成所有注射后，将小鼠置于笼外10分钟，使AgNP胶原混合物充分凝胶化，并防止母鼠舔舐注射部位，之后将小鼠放回笼中。
- 每日观察并记录所有小鼠的体征变化，包括黄疸情况、体重变化以及存活率。
5. 血液样本采集
注意：通过将针头插入心脏采集约 120 µL 的血液样本。离心后收集血清（约 70 µL），用于肝功能检测。血液采集方法如下。
- 在RRV接种后的第9天和第12天（即AgNP处理后3天），使用0.5-2.5%七氟烷对小鼠进行麻醉。
- 固定小鼠四肢，并用75%酒精消毒上腹部和下腹部。
- 用剪刀沿中线剪开小鼠皮肤、肌肉和腹膜至剑突，暴露膈肌；用无菌棉签移开胃肠道，充分暴露膈肌。
- 将针头（连接1 mL未装药的胰岛素注射器）插入心脏左心室，缓慢回拉注射器活塞以获取最大血量。随后将血液转移至1.5 mL离心管中。
- 将离心管在室温下静置30分钟，然后在400 × g 条件下离心5分钟。接着用移液器收集血清并保存，以备后续使用。
注意：避免损伤膈肌，因为膈肌破损容易导致气胸、死亡和血液凝固，从而妨碍血液样本的采集。
6. 生化参数检测
- 使用步骤5.5中收集的血清进行生化参数检测。
- 使用全自动生化分析仪检测以下生化参数：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）和总胆汁酸（TBA）。
7. 肝外胆道造影以观察肝外胆管的通畅性
注意：整个操作过程均需在解剖显微镜下进行。
- 用棉签完全暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。
- 在解剖显微镜下观察并拍摄肝脏和胆管的形态。
- 使用眼科镊子轻轻夹住胆囊底部。
- 用1 mL注射器吸取亚甲蓝溶液（0.05 wt.% 溶于H2O）。将注射器针头缓慢插入胆囊腔内，然后用眼科镊子夹住针头，缓慢注入10–20 µL亚甲蓝溶液。
- 在显微镜下观察蓝色是否通过肝外胆管进入空肠，并拍照记录。
8. 用于苏木精-伊红染色的新鲜肝脏样本采集
- 将新鲜的小鼠肝脏组织在10%福尔马林中固定过夜。
- 然后将固定的肝脏组织进行石蜡包埋并切片。
- 脱蜡切片，用梯度乙醇（如100%、95%、80%和70%乙醇，每种浓度各5分钟）水化，用苏木精染色，经1%盐酸乙醇分化，最后用伊红染色。
- 最后在40倍显微镜下观察肝脏的组织病理学形态。
9. 苏木精和伊红染色组织切片的免疫组织化学染色
- 脱蜡并水化组织切片后，将切片浸入 Tris-EDTA 缓冲液（10 mM Tris 碱，1 mM EDTA 溶液；pH 9.0）中，于微波炉中 95 °C 加热 10 分钟，进行抗原修复。
- 用 3% 过氧化氢溶液处理组织切片 10 分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
- 用 5% 山羊血清处理切片，以阻断非特异性结合。
- 向切片中加入兔抗小鼠 NKG2D 一抗（1:100），于 4 °C 过夜孵育。
- 在室温下用相应的二抗（HRP 标记的聚合物抗兔系统）孵育切片 30 分钟。
- 使用 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂，显示免疫组织化学染色结果。
- 在 40 倍显微镜下观察切片，采集图像，并按需进行后续分析。
10. 流式细胞术分析
- 轻轻切碎肝组织，经70 µm细胞筛过滤，然后在4 °C下以270 × g离心2次，每次4分钟。
- 将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中，使用单克隆抗体通过双色免疫荧光进行分析。
- 利用特异性细胞表面标志物进行细胞表型分析，包括异硫氰酸荧光素和藻红蛋白标记的抗NKp46抗体（NK淋巴细胞；1:1,000）和抗CD4抗体（T细胞亚群；1:1,000），使用流式细胞仪检测，并用流式细胞术数据分析软件处理结果。
- 根据前向散射/侧向散射选择细胞群，依据同型对照设门以排除背景荧光干扰，并基于各单个抗体的荧光信号对数据进行二次分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
基于已建立的胆道闭锁（BA）小鼠模型，在感染的新生小鼠出现黄疸后，给予制备好的AgNP胶原混合物腹腔注射，共2次。每日监测小鼠存活情况，并进行肝功能检测、肝脏病理学检查和流式细胞术分析。与未经治疗的对照组BA小鼠相比，接受AgNP治疗的小鼠黄疸减轻，并维持了正常的体重（图3）。胆红素代谢水平和肝转氨酶水平降至正常对照组水平，表明AgNPs显著改善了肝功能（表1）。经亚甲蓝染色的肝外胆管造影（图4）证实，AgNP治疗后胆管保持通畅。H&E染色（图5）显示，与对照组小鼠相比，AgNP治疗小鼠肝脏门脉区的炎性细胞浸润明显减少。流式细胞术结果显示，在AgNP治疗后（第9天和第12天），小鼠肝脏中自然杀伤（NK）细胞数量显著低于RRV感染小鼠（图6）。免疫组织化学染色显示，与RRV小鼠相比，AgNP治疗小...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
AgNPs 具有强效的广谱抗菌特性以及高渗透性22；此外，它们还被用于制备多种抗菌医用产品23。然而，AgNPs 在器官中蓄积后清除时间较长，这种持久性可能导致毒性效应24,25。既往一项研究探讨了大鼠单次静脉注射 AgNPs 后的急性毒性和遗传毒性，结果显示 AgNPs 可引起急性肝肾损伤。AgNPs 会在主要免疫系统器官（包括胸腺和脾脏）中蓄积17。在本小鼠胆道闭锁（BA）模型中，AgNPs 治疗改善了 BA 综合征，我们的数据表明该作用部分通过抑制自然杀伤（NK）细胞介导。然而，AgNPs 的长期效应仍需进一步研究，以评估其对小鼠发育及免疫调节的潜在毒性。
在方法方面，为确保手术成功，需注意以下几点：（i）制备AgNP胶原混合物的过程必须在冰上进行，因为在室温下，AgNP胶原混合物会迅速形成半固体凝胶，无法用于注射。制...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究所用的AgNPs由香港大学化学系C. M. Che惠赠。本工作受到国家自然科学基金（编号：81600399）和广州市科技计划项目（编号：201707010014）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BALB/c 小鼠 | 广东省医学实验动物中心 | SYXK2017-0174 | 动物实验 |
| 恒河猴轮状病毒（RRV） | ATCC | ATCC VR-1739 | 建立胆道闭锁小鼠模型 |
| MA104 细胞 | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | 仅供实验室使用 |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | 哺乳动物细胞培养 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10099141 | 哺乳动物细胞培养 |
| I 型胶原酶 | CORNING | 354236 | 仅供研究使用 |
| PBS 缓冲液 | OXOID | BR0014G | 用于洗涤 |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | 调节 pH 值 |
| AgNP | 抗菌 注：AgNPs 由香港大学化学系 Prof CM Che. 教授惠赠。 | ||
| 带集成针头的胰岛素注射器 | BD | 9161635S | 供医疗使用 |
| 15 mL 离心管 | Corning | 430791 | 仅供实验室使用 |
| 1.5 mL 微量离心管 | GEB | CT0200-B-N | 仅供实验室使用 |
| 显微镜 | Nikon | ECLIPSE-Ci | 供实验室使用 |
| 解剖/活体显微镜 | Nikon | SMZ 1000 | 供实验室使用 |
| 抗小鼠 NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | 仅供研究使用 |
| 抗小鼠 CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | 仅供研究使用 |
| 单克隆小鼠抗人 CD4 抗体 | DAKO | 20001673 | 仅供研究使用 |
| 抗 NKG2D 抗体 | RD | MAB1547 | 仅供研究使用 |
| BD FACSCanto 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACS Canto Plus | 仅供实验室使用 |
参考文献
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157(2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554(2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16(2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
