需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体

8.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58160

⸱

2018年7月10日

 ,  , 
1Chemical Biology and Therapeutics, Novartis Institutes for BioMedical Research

本文内容

摘要

本实验方案的目标是促进对NMDA受体（NMDAR）的大规模研究，并允许检测小分子的调节作用及其治疗应用。

摘要

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体（NMDAR）属于离子型谷氨酸受体，在学习和记忆过程中发挥关键作用。NMDAR功能异常，无论是由于突变、表达改变、转运或定位异常所导致的过度或不足活性，均可能引发多种疾病，尤其是在中枢神经系统中。因此，深入了解该受体的生物学特性，并推动化合物和小分子的发现，对于当前防治神经系统疾病的努力至关重要。目前研究该受体的方法存在诸多局限性，包括通量低、成本高，以及由于必须使用通道阻滞剂以防止NMDAR介导的兴奋性毒性，而无法研究其功能特性。此外，现有的检测系统仅对谷氨酸刺激敏感，缺乏对甘氨酸（NMDAR的另一共配体）刺激的敏感性。本文中，我们首次报道了一种基于微孔板的高通量检测方法，可用于研究对两种共配体（谷氨酸和D-丝氨酸/甘氨酸）均敏感的NMDA受体。该方法能够研究不同NMDAR亚基组成，并可在甘氨酸和/或谷氨酸敏感模式下进行受体的功能研究。此外，该方法在检测过程中无需使用抑制剂。本检测体系可检测正向和负向变构调节剂的作用，且我们系统中已成功重现了NMDAR已知的药理学特性。该技术克服了现有方法的局限性，且具有成本效益。我们相信，这一新技术将加速针对NMDAR介导病理的治疗手段的发现。

引言

随着医学的不断进步，人类预期寿命显著延长；然而，与年龄相关疾病的患病率也随之上升。中枢神经系统（CNS）疾病，如精神分裂症、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病和帕金森病等，也不例外，预计在未来十年内将呈现增长趋势1,2,3。离子型谷氨酸受体（即N-甲基-D-天冬氨酸受体，NMDAR）功能障碍已被证实与阿尔茨海默病、精神分裂症、创伤性脑损伤、中风、糖尿病和青光眼等多种疾病相关，这凸显了深入研究其生物学特性以开发有效的、可改变疾病进程的治疗方法的必要性4,5,6,7。

NMDAR 由四个单体或亚基组成4,8,9。NMDAR 的结构组成在大脑中具有发育阶段和区域分布的差异性7,10。NMDAR 参与突触可塑性、认知功能以及呼吸和运动节律的产生11,12,13。作为一种电压门控通道，它在静息膜电位（-70 mV）下基本不导通，并被镁离子阻断以防止其他离子进一步通透。该通道通过两种配体——谷氨酸和甘氨酸/D-丝氨酸——的结合，并在突触膜上由 AMPA 受体（另一类离子型谷氨酸受体）介导的同步去极化作用下被激活。去极化可解除镁离子对 NMDAR 的阻断，从而允许阳离子（尤其是钙离子）内流14,15,16。尽管 NMDAR 的激活对细胞存活至关重要，但其过度激活可通过兴奋性毒性导致细胞死亡17,18,19。此外，由于该受体结构复杂，这使得开展有效治疗策略所需的研究变得极具挑战性。

已开发出多种方法用于研究NMDAR。然而，每种方法均存在相应的局限性。例如，一种广泛使用的技术是基于荧光的检测方法，该方法通过四环素诱导型启动子（Tet-On）调控的稳定细胞系，检测NMDAR介导的细胞内钙离子变化20。然而，在该系统中，需要使用超最大浓度的配体，且在检测过程中必须存在NMDAR抑制剂，这使得几乎无法检测到竞争性拮抗剂的活性。在其他类似系统中，功能性受体的表达会引起细胞毒性，因此需要使用氯胺酮等通道阻滞剂21,22以维持细胞培养。这些通道阻滞剂结合于受体核心部位，难以彻底洗脱，尤其是在基于孔板的实验体系中，因而会干扰受体的功能性研究。最后，在膜片钳等电生理学检测中，通量有限，大规模研究成本极高23。此外，上述系统对甘氨酸刺激均不敏感，因此研究NMDAR的甘氨酸依赖性活性成为一项挑战。

在此，我们介绍一种研究NMDAR的新方法，可克服上述局限性。该技术利用杆状病毒表达系统，在短短16小时内即可实现受体的功能性表达，并确保亚基间的理想比例。此外，杆状病毒的使用提供了一种简便且可组合的方法，能够对不同类型的重组NMDAR亚型进行广泛表征。与其他检测方法不同，本方案无需使用通道阻滞剂，因其采用了弱拮抗剂。该方法的最大优势在于，在洗脱弱拮抗剂后，受体不仅可对单个甘氨酸和谷氨酸结合位点进行调控，还可同时对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸配体结合位点进行双重调控。该检测方法重现了NMDAR受体已知的药理学特性及其已知的正向与负向调节剂的作用效果。最后，该方法的建立为 体外 细胞实验克服了过量钙离子内流引起的细胞毒性，能够以高通量方式对受体进行功能研究，从而加速发现疾病状态下NMDAR调节剂。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 细胞的制备

注意：本实验方案（包括数据生成）使用经编码 NR1 和 NR2A 的杆状病毒感染的 HEK293 细胞。

  1. 接种适当数量的HEK293细胞，并加入适当终浓度的NR1和/或NR2A病毒（每种各1.00 µL）。对于384孔板，每孔接种10,000个细胞，终体积为30 µL。
  2. 或者，直接接种适当数量和体积的HEK293-NR1-NR2A细胞（对于384孔板，每孔接种10,000个细胞，终体积为30 µL）。加入终浓度为2 µg/mL的四环素以诱导NR2A表达，并加入保护性化合物（100 µM MDL105,519 或 5 µM CGP07066724）。
  3. 注意：编码NR1和NR2的杆状病毒滴度应约为每毫升5 × 109 至 10 × 109 个感染单位24。

2. NMDA受体活性的测定

  1. 在存在保护性化合物的情况下，准备一个384孔板，其中含有转导了NR1/NR2或HEK293-NR1-NR2A细胞的HEK293细胞。使用透明底、黑色边框、聚-D-赖氨酸包被的培养板。
    注意：使用100 µM MDL105,519可赋予细胞对甘氨酸的敏感性，而使用5 µM CGP070667可赋予细胞对谷氨酸的敏感性。
  2. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育16小时（过夜）。
  3. 从孵育箱中取出培养板，将板缓慢翻转至合适的生物废弃物容器上方，轻柔地弃去细胞培养基。将板轻轻在纸巾上轻拍，以清除板边缘残留的培养基并排干剩余液体。
  4. 通过将一管钙6染料（适用于1块板）溶于10 mL孵育缓冲液（HBSS，pH 7.5，20 mM HEPES，1 mM MgCl2，1 mM丙磺舒）来配制钙6染料。将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
  5. 从孵育箱中取出培养板，让细胞在室温下适应10分钟。
  6. 按照步骤2.3所述方法轻柔倒出钙6染料，并向每孔加入30 µL检测缓冲液（HBSS，pH 7.5，20 mM HEPES，1.8 mM CaCl2，1 mM丙磺舒）。
  7. 重复步骤2.6两次，共洗涤3次。最后一次洗涤后，每孔保留30 µL检测缓冲液。
  8. 让细胞在室温下静置5分钟。
  9. 通过配制400 µM甘氨酸和400 µM谷氨酸的4倍浓缩液（终浓度为100 µM；配体的最佳浓度应根据下文所述方法确定），制备配体板。将至少25 µL配体储备液转移至V型底384孔板中。
  10. 将配体板和细胞板装入FDSS（功能性药物筛选系统）中。
  11. 记录细胞板30秒的基础荧光值（Fo）。使用FDSS的加样功能，将10 µL配体储备液加入细胞板中，并通过连续记录钙6染料荧光信号5分钟来检测钙离子流变化。
  12. 通过将检测到的最大荧光值除以基础荧光值，计算最大荧光比值（Fmax/Fo）。

3. NMDAR 表达水平的优化

  1. 为确定使用杆状病毒的最佳用量，对NR1和NR2A病毒分别进行滴定。准备一块384孔板，每孔接种HEK293细胞（建议每孔10,000个细胞，培养基30 µL），并按步骤2.1所述加入保护性化合物。
  2. 在板的不同行中加入不同量的NR1病毒（例如：在A至E行分别加入0 µL、2 µL、1 µL、0.5 µL、0.25 µL）。设置重复孔以提高数据准确性。
  3. 在板的不同列中加入不同量的NR2A病毒（例如：在A至E列分别加入0 µL、2 µL、1 µL、0.5 µL、0.25 µL）。设置重复孔以提高数据准确性。
  4. 将板置于37 °C、5% CO2条件下孵育16小时（过夜）。
  5. 通过FDSS进行钙流检测（见上文），确定NR1与NR2A病毒的最佳比例和用量。

4. 配体滴定

  1. 按照步骤 2.3 所述方法准备细胞。
  2. 在另一种配体达到饱和浓度（100 µM）的条件下，将每种配体配制成 4 倍浓度的储备液进行稀释。例如：若甘氨酸的终浓度为 10 µM，则需制备含有 400 µM 谷氨酸的 40 µM 甘氨酸储备液。
  3. 按照步骤 2.11 所述方法进行 FDSS 检测。

5. 化合物测试

  1. 按照步骤1所述准备细胞。
  2. 用测定缓冲液配制配体板，其中配体的储备浓度为最终浓度的5倍。
  3. 用测定缓冲液配制化合物板，其中化合物的储备浓度为所需最终浓度的4倍。若在测定缓冲液中化合物的最终浓度为10 µM，则应配制40 µM的储备溶液。
    1. 在将化合物进一步稀释至测定缓冲液前，先用二甲基亚砜（DMSO）对化合物进行预稀释，以确保所有样品中DMSO的浓度保持一致。
    2. 若最终测定中化合物的剂量反应范围为3至30 µM，则应先用DMSO将化合物预稀释至1至10 mM的范围，再将这些预稀释液用测定缓冲液稀释至4倍储备浓度。DMSO的最终浓度不得超过0.5%。
      注意：建议每个样品设置三个重复孔进行检测。
  4. 将配体板、化合物板和细胞板装入FDSS仪器中。
  5. 测量30秒的基础荧光信号。
  6. 加入10 µL化合物储备液，随后连续测量5分钟的荧光信号。
  7. 加入10 µL配体储备液，随后连续测量5分钟的荧光信号。
  8. 通过计算测量最后5分钟内荧光比值曲线下的面积，确定荧光比值的积分值。
    注意：也可采用加入配体后达到的最大荧光比值进行分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在测试小分子的作用之前，必须确定NMDARs的最佳表达水平以及最佳配体浓度。如所述，将HEK293细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于384孔板中，并加入5 µM CGP060667，随后用不同量的NR1和NR2A病毒进行转导。过夜孵育后，检测配体诱导的钙流变化（图1）。这些实验结果揭示了每个亚基所应使用的病毒最佳数量和比例（图1，黄色框）。

在确定了NR1和NR2A转导的最佳数量和比例后，进行配体滴定实验以确定激活NMDAR的最佳配体浓度。为此，在固定且饱和的另一种共配体浓度下，将其中一种共配体以不同浓度添加（图2A-2B）。对于其他NMDAR亚基组合（如NR1/NR2B和NR1/NR2D）也获得了类似结果（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该实验的成功在很大程度上取决于所用HEK细胞的健康状态。应使用处于指数生长期且传代次数较低的细胞。本实验涉及多次溶液转移和添加操作，因此谨慎操作可确保结果的更高准确性。化合物及其他所有试剂的浓度也应仔细核对，以尽量减少误差。在钙流实验中用检测缓冲液替换细胞培养基时，应轻轻倾斜培养板，以防止细胞脱落。最后，本方案中使用聚-D-赖氨酸包被的培养板可增强细胞在板上的贴附性。

在转导时，根据HEK293细胞的传代次数和细胞状态，NMDAR的表达水平以及亚基表达所需的病毒量可能存在差异。此外，杆状病毒的保质期较短，通常为六个月至一年。因此，病毒的质量是本实验的重要参数。在进行后续实验之前，可采用标准免疫荧光实验来检测并确认NMDAR亚基的表达水平和定位情况24。本方案也可用于其他细胞系研究NMDA受体。然而，在使用杆状病毒表达NMDAR之前，必须先验证细胞系对该系统的耐受性及表达能力；否则，可能会出现意外结果。此外，已有报道指出，某些化合物（如拓扑异构酶II抑制剂）可提高杆状病毒表达系统的效率29...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无利益冲突，无可披露内容。

致谢

作者感谢Post Baccalaureate Scholars计划办公室以及诺华生物医学研究中心整体对本研究的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEK-293ATCCCRL-1573
人NMDA（NR1/NR2A）受体细胞系ChanTest CorporationCT6120
pFastBac Dual表达载体ThermoFisher Scientific10712-024
Corning 384孔透明平底微孔板Corning Life Sciences3844
FLIPR Calcium 6-QF检测试剂盒Molecular DevicesR8192
甘氨酸Sigma-AldrichG7126
谷氨酸Sigma-Aldrich49621
D-丝氨酸Sigma-AldrichS4250
L701,324Tocris907
HEPES缓冲液Boston Bio ProductBB-103
氯化镁溶液Sigma-Aldrich63069
氯化钙VWRE506
HBSSThermoFisher Scientific14025-092
丙磺舒ThermoFisher ScientificP36400
DMEM/F-12, GlutaMAX培养基ThermoFisher Scientific10565018
MDL105,519NIBRSynthesized in house
NVP-AAM077NIBRSynthesized in house
CGP070667NIBRSynthesized in house

参考文献

  1. Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
  2. Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
  3. Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
  4. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  5. Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
  6. Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
  7. Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
  8. Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383(2013).
  9. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
  10. Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
  11. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
  12. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
  13. Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
  14. Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
  15. Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
  16. Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
  17. Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
  18. Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
  19. Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
  20. Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
  21. Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
  22. Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
  23. Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
  24. Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608(2017).
  25. Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
  26. Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
  27. Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
  28. Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
  29. Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

NMDA受体高通量筛选甘氨酸敏感性谷氨酸敏感性D-丝氨酸反应HEK 293细胞FDSS仪器配体结合变构调节剂
一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。