一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体

摘要

本实验方案的目标是促进对NMDA受体（NMDAR）的大规模研究，并允许检测小分子的调节作用及其治疗应用。

摘要

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体（NMDAR）属于离子型谷氨酸受体，在学习和记忆过程中发挥关键作用。NMDAR功能异常，无论是由于突变、表达改变、转运或定位异常所导致的过度或不足活性，均可能引发多种疾病，尤其是在中枢神经系统中。因此，深入了解该受体的生物学特性，并推动化合物和小分子的发现，对于当前防治神经系统疾病的努力至关重要。目前研究该受体的方法存在诸多局限性，包括通量低、成本高，以及由于必须使用通道阻滞剂以防止NMDAR介导的兴奋性毒性，而无法研究其功能特性。此外，现有的检测系统仅对谷氨酸刺激敏感，缺乏对甘氨酸（NMDAR的另一共配体）刺激的敏感性。本文中，我们首次报道了一种基于微孔板的高通量检测方法，可用于研究对两种共配体（谷氨酸和D-丝氨酸/甘氨酸）均敏感的NMDA受体。该方法能够研究不同NMDAR亚基组成，并可在甘氨酸和/或谷氨酸敏感模式下进行受体的功能研究。此外，该方法在检测过程中无需使用抑制剂。本检测体系可检测正向和负向变构调节剂的作用，且我们系统中已成功重现了NMDAR已知的药理学特性。该技术克服了现有方法的局限性，且具有成本效益。我们相信，这一新技术将加速针对NMDAR介导病理的治疗手段的发现。

引言

随着医学的不断进步，人类预期寿命显著延长；然而，与年龄相关疾病的患病率也随之上升。中枢神经系统（CNS）疾病，如精神分裂症、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病和帕金森病等，也不例外，预计在未来十年内将呈现增长趋势^1,2,3。离子型谷氨酸受体（即N-甲基-D-天冬氨酸受体，NMDAR）功能障碍已被证实与阿尔茨海默病、精神分裂症、创伤性脑损伤、中风、糖尿病和青光眼等多种疾病相关，这凸显了深入研究其生物学特性以开发有效的、可改变疾病进程的治疗方法的必要性^4,5,6,7。

NMDAR 由四个单体或亚基组成^4,8,9。NMDAR 的结构组成在大脑中具有发育阶段和区域分布的差异性^7,

方案

1. 细胞的制备

注意：本实验方案（包括数据生成）使用经编码 NR1 和 NR2A 的杆状病毒感染的 HEK293 细胞。

1. 接种适当数量的HEK293细胞，并加入适当终浓度的NR1和/或NR2A病毒（每种各1.00 µL）。对于384孔板，每孔接种10,000个细胞，终体积为30 µL。
2. 或者，直接接种适当数量和体积的HEK293-NR1-NR2A细胞（对于384孔板，每孔接种10,000个细胞，终体积为30 µL）。加入终浓度为2 µg/mL的四环素以诱导NR2A表达，并加入保护性化合物（100 µM MDL105,519 或 5 µM CGP070667²⁴）。
3. 注意：编码NR1和NR2的杆状病毒滴度应约为每毫升5 × 10⁹ 至 10 × 10⁹ 个感染单位²⁴。

2. NMDA受体活性的测定

1. 在存在保护性化合物的情况下，准备一个384孔板，其中含有转导了NR1/NR2或HEK293-NR1-NR2A细胞的HEK293细胞。使用透明底、黑色边框、聚-D-赖氨酸包被的培养板。
   注意：使用100 µM MDL105,519可赋予细胞对甘氨酸的敏感性，而使用5 µM C....

结果

在测试小分子的作用之前，必须确定NMDARs的最佳表达水平以及最佳配体浓度。如所述，将HEK293细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于384孔板中，并加入5 µM CGP060667，随后用不同量的NR1和NR2A病毒进行转导。过夜孵育后，检测配体诱导的钙流变化（图1）。这些实验结果揭示了每个亚基所应使用的病毒最佳数量和比例（图1，黄色框）。

在确定了NR1和NR2A转导的最佳数量和比例后，进行配体滴定实验以确定激活NMDAR的最佳配体浓度。为此，在固定且饱和的另一种共配体浓度下，将其中一种共配体以不同浓度添加（图2A-2B）。对于其他NMDAR亚基组合（如NR1/NR2B和NR1/NR2D）也获得了类似结果（

讨论

该实验的成功在很大程度上取决于所用HEK细胞的健康状态。应使用处于指数生长期且传代次数较低的细胞。本实验涉及多次溶液转移和添加操作，因此谨慎操作可确保结果的更高准确性。化合物及其他所有试剂的浓度也应仔细核对，以尽量减少误差。在钙流实验中用检测缓冲液替换细胞培养基时，应轻轻倾斜培养板，以防止细胞脱落。最后，本方案中使用聚-D-赖氨酸包被的培养板可增强细胞在板上的贴附性。

在转导时，根据HEK293细胞的传代次数和细胞状态，NMDAR的表达水平以及亚基表达所需的病毒量可能存在差异。此外，杆状病毒的保质期较短，通常为六个月至一年。因此，病毒的质量是本实验的重要参数。在进行后续实验之前，可采用标准免疫荧光实验来检测并确认NMDAR亚基的表达水平和定位情况²⁴。本方案也可用于其他细胞系研究NMDA受体。然而，在使用杆状病毒表达NMDAR之前，必须先验证细胞系对该系统的耐受性及表达能力；否则，可能会出现意外结果。此外，已有报道指出，某些化合物（如拓扑异构酶II抑制剂）可提高杆状病毒表达系统的效率²⁹.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK-293	ATCC	CRL-1573
人NMDA（NR1/NR2A）受体细胞系	ChanTest Corporation	CT6120
pFastBac Dual表达载体	ThermoFisher Scientific	10712-024
Corning 384孔透明平底微孔板	Corning Life Sciences	3844
FLIPR Calcium 6-QF检测试剂盒	Molecular Devices	R8192
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126
谷氨酸	Sigma-Aldrich	49621
D-丝氨酸	Sigma-Aldrich	S4250
L701,324	Tocris	907
HEPES缓冲液	Boston Bio Product	BB-103
氯化镁溶液	Sigma-Aldrich	63069
氯化钙	VWR	E506
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025-092
丙磺舒	ThermoFisher Scientific	P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX培养基	ThermoFisher Scientific	10565018
MDL105,519	NIBR	Synthesized in house
NVP-AAM077	NIBR	Synthesized in house
CGP070667	NIBR	Synthesized in house