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量化植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量——以玉米（Zea mays）为例

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DOI：

10.3791/58164

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2018年8月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

本文内容

摘要

本文所述的实验方案为测定植物组织中可溶性蛋白质和可消化（非结构性）碳水化合物含量提供了清晰且易于操作的方法。准确量化这两种植物宏量营养素，对于推动植物生理学、营养生态学、植物与植食性动物相互作用以及食物网生态学等领域的研究具有重要意义。

摘要

元素数据常被用于推断植物作为植食性动物资源的质量。然而，由于生物分子中普遍存在碳元素、植物防御性化合物中含有氮，以及不同物种间氮含量与植物蛋白含量之间的相关性存在差异，这些因素均限制了此类推断的准确性。此外，针对植物和（或）植食性动物生理学的研究需要更高的精确度，而通用的相关性关系难以满足这一要求。本文所介绍的方法为研究人员提供了一种清晰且快速的实验流程，用于直接测定植物可溶性蛋白质和可消化碳水化合物——这两种与动物生理表现关系最为密切的植物宏量营养素。该流程结合了已被充分验证的比色测定法与针对植物优化的特异性消化步骤，从而获得精确且可重复的结果。我们对不同甜玉米组织的分析表明，这些检测方法具有足够的灵敏度，能够检测到多种空间尺度下植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量的变化，包括不同种植区域、不同植物种类或品种之间的差异，以及同一植株内不同组织类型之间，甚至同一组织内部不同位置间的差异。将可溶性蛋白质和可消化碳水化合物含量数据与元素数据相结合，还有望为植物生物学研究开辟新途径，以连接植物矿质营养与植物生理过程。这些分析还有助于生成开展营养生态学、植物-植食性动物相互作用及食物网动态研究所必需的可溶性蛋白和可消化碳水化合物数据，从而进一步推动生理学和生态学研究的发展。

引言

植物生物量构成了几乎所有陆地食物网的基础。植物通过根系从土壤中吸收营养元素，并利用叶片组织中的阳光合成生物分子。特别是碳和氮被用于合成构建植物生物量所需的碳水化合物、蛋白质（由氨基酸组成）和脂质（需注意，在植物生理学中，“"大量营养素"一词通常指氮、磷、钾、硫等土壤元素，但本文中该术语将指蛋白质、碳水化合物和脂质等生物分子）。当植食性动物摄食植物材料时，植物组织中所含的大量营养素会被分解为其基本组分，进而用于驱动消费者的各种生理过程。因此，植物中的大量营养素对消费者的生理具有显著影响，并进一步对高阶生态相互作用及食物网动态产生重要影响。

在整个动物界中，可溶性蛋白质和可消化碳水化合物是与生存、繁殖和生理机能关系最为密切的宏量营养素1。此外，大多数动物会主动调节这两种宏量营养素的摄入量，以满足其生理需求1,2。这一点在昆虫植食性动物中尤为明显，它们能够感知植物组织中糖类和氨基酸的浓度，从而引导其取食行为。因此，植物中可溶性蛋白质和可消化碳水化合物的含量在植物与昆虫相互作用的进化过程中发挥了重要作用。

尽管有关植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量的数据相对较少（但参见6,7,8,9,10,11），关于植物元素含量（碳、氮和磷）的数据较为丰富。这主要是因为元素在植物矿质营养中起着关键作用3,4,5在测定元素含量时，常利用相关性来推算可溶性蛋白质和可消化碳水化合物的含量，但通常难以获得准确的计算结果。例如，由于碳普遍存在于所有有机化合物中，因此无法将其作为植物可消化碳水化合物含量的指示指标。元素氮与植物可溶性蛋白质含量之间存在较强的相关性，因此常使用通用的氮-蛋白质换算系数。然而，有充分证据表明，氮-蛋白质换算系数具有高度的物种特异性12,13,14,15，使得通用转换系数的应用可能不准确。因此，氮-蛋白质转换系数往往缺乏精确性，尤其是在草食动物营养研究所需的精度范围内。此外，含氮植物异株化学物质的存在， 例如生物碱和硫代葡萄糖苷等对草食性动物通常具有毒性的物质，可能会干扰这些转化过程。

本文提供了两种化学检测方法，用于测定植物组织中可溶性蛋白质和可消化碳水化合物的浓度。这两种检测方法分别介绍，但建议同时使用，以对同一批植物样品进行分析，从而实现对植物宏量营养素更全面的评估。两种方法均采用相似的实验流程，包括提取步骤，随后通过吸光度进行定量。两种方案的植物样品前处理过程也完全相同，因此可方便地同时开展两项分析。这些检测方法的价值并不在于其新颖性，因为它们基于一些已建立多年的比色法（Bradford、Jones、Dubois）16,17,18；但本文将其与一些较少见的植物特异性提取技术相结合17,19，整理成一套清晰且易于遵循的操作流程，以提高这些方法在植物相关研究领域中的可及性。

在这两种测定中，首先通过冷冻、冻干和研磨植物材料，从物理上提取植物大量营养元素。对于可溶性蛋白测定，还需进一步进行化学提取17,19，即在NaOH溶液中对样品进行多轮涡旋振荡和加热。随后采用经典的Bradford法，利用考马斯亮蓝G-250对分子量介于3,000–5,000道尔顿之间的可溶性蛋白和多肽进行定量16,17。该方法每微孔板孔的检测范围为1–20 µg总蛋白，或<25 µg/mL，但无法检测游离氨基酸。可消化碳水化合物测定的提取步骤基于Smith et al.20提出的稀酸法，可用于分离可溶性糖、淀粉和果聚糖，但不包括结构性碳水化合物。碳水化合物的定量采用Dubois et al.18提出的苯酚-硫酸法，可测定所有单糖、寡糖和多糖（以及甲基化衍生物）。该方法能够定量特定糖类，但本文中仅将其作为总可消化碳水化合物含量的指标（详见Smith et al.20的详细分析）。这些测定共同评估了与植物生态生理学和植食性动物表现密切相关的两种大量营养元素，为陆地食物网基础的资源质量提供了重要数据。介绍这些实验方案有助于生成植物大量营养元素的数据集，从而更全面地理解植物生理学、植食性动物营养生态学以及植物-植食性动物相互作用。

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方案

1. 植物采集与处理

  1. 采集并处理植物样品
    1. 采集植物样品后，使用镊子将植物材料浸入液氮中进行速冻，并在 -80 °C 下保存。如果采集的植物样品过大而无法进行速冻，应使用干冰快速冷却，并尽快转移至 -80 °C 冰箱中。植物组织在脱离植株后，其宏量营养素含量可能发生改变，因此在采集后应尽快冷冻样品。
      注意：液氮接触皮肤可导致严重冻伤。请务必使用经批准的容器运输液氮，并在操作时穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括低温手套、护目镜、面罩、围裙和实验服。
    2. 使用冷冻干燥机对植物材料进行冻干，以确保在去除水分的过程中组织处于代谢失活状态。持续干燥直至样品质量稳定，以确保完全去除水分。
    3. 样品干燥后，使用研磨机或研磨仪将其研磨成细粉。将样品储存于干燥柜中，直至进行分析。

2. 可溶性蛋白质测定

  1. 样品制备
    1. 称取每种组织的重复样品各约20 mg，分别放入1.5 mL聚苯乙烯微量离心管中，并标记管子。这些样品后续将被称为未知样品。记录每个样品的精确质量，因为该信息将用于计算每个未知样品中的可溶性蛋白百分比。应使用带锁扣盖的微量离心管，因为非锁扣盖可能在后续加热步骤中开启，导致样品溶液损失。
  2. 溶解并分离未知样品中的蛋白质
    1. 使用微量移液器，加入 500 µL 的 0.1 M NaOH 至各管中。盖紧管盖，超声处理 30 分钟。预热 90 ℃ 水浴 °C.
      警告： 氢氧化钠是一种强碱，接触皮肤可能引起灼伤。尽管0.1 M NaOH浓度较低，但仍需佩戴防护手套以避免皮肤刺激。
    2. 将试管放入热水浴中的试管架中，孵育15分钟。
    3. 以 15,000 × g 离心 10 分钟。使用新的移液枪头，将上清液转移至新标记的微量离心管中，每个样品使用新的枪头。加入 300 µ加入 0.1 M NaOH 溶液 1 L 至含有沉淀的离心管中，再次于 15,000 × g 离心 10 分钟。再次收集上清液，并与同一样本的其他上清液合并。此步骤可作为暂停点，样品可在 4 ℃ 保存 °如有需要，4°C 过夜。
  3. 沉淀植物蛋白质
    1. 通过加入11，调节上清液的pH至中性 µL 的 5.8 M HCl。将石蕊试纸浸入各样品溶液中，确认 pH 约为 7。
      警告： 盐酸是一种强腐蚀性酸，接触皮肤（皮肤接触或吸入）可引起灼伤。操作盐酸时请佩戴手套，以防止皮肤刺激。
    2. 加入90 µ加入100%三氯乙酸（TCA）至各管中，冰上孵育30分钟。蛋白质沉淀将使溶液由澄清变为浑浊。若30分钟后未见沉淀，可将各管置于4°C冰箱中冷藏1小时。此步骤可作为潜在的暂停点，样品可在4°C保存。 °如有需要，4°C 过夜。
      警告： 三氯乙酸具有腐蚀性。操作时请佩戴手套，避免接触皮肤，并防止吸入。
    3. 在 4 ℃ 条件下以 13,000 × g 离心 10 分钟 °C. 使用连接真空泵的细玻璃微量移液器吸头，小心吸除TCA上清液（可在不同样品间重复使用同一吸头）。 避免剧烈抽吸，并保持移液枪头与蛋白沉淀之间适当的距离，以免扰动蛋白沉淀。
    4. 用100 μL预冷丙酮快速洗涤沉淀 µ-20 L °C 丙酮。此步骤可去除沉淀中残留的TCA，避免干扰后续的Bradford测定；然而，丙酮若与沉淀接触时间过长会开始溶解蛋白质沉淀，因此加入丙酮后应在5秒内迅速将其从沉淀中移除。
    5. 将试管置于通风橱或冰箱中，使丙酮挥发。然后，向每支试管中加入1 mL 0.1 M NaOH以溶解蛋白沉淀。完全溶解沉淀可能需要在热水浴中多次加热，并伴随涡旋振荡和超声处理。
      注意：离心管在通风橱或冰箱中放置的时间越长，沉淀越干燥，重新溶解将越困难。建议将沉淀干燥30分钟，之后每隔10至15分钟检查丙酮残留情况，直至确认丙酮完全挥发（无丙酮气味可被察觉）。
  4. 混合标准溶液，稀释未知样品溶液，并使用 Bradford 法测定未知样品的总蛋白含量。
    1. 根据所列浓度配制牛免疫球蛋白G（IgG）标准溶液 表1 （可将冻干粉或IgG储备液与去离子水混合以配制各浓度标准品）。将标准品于4℃保存 °C. 在96孔板中，加入160 µL 每种IgG标准溶液，从孔板的A1位开始，设三个重复（0 µ克/µA1、A2、A3 位点的 L，0.0125 µ克/µL 位于 B1、B2、B3 位置， 等等。).
    2. 通过加入50 mL氢氧化钠溶液制备稀释的NaOH溶液 µ0.1 M NaOH 的 L 至 950 µL 蒸馏水。作为空白阴性对照，加入 60 µ将该溶液各 1 L 分别加入孔板中的 G1、G2、G3 位置，每份设三个重复。
    3. 通过加入50，对未知样品进行稀释 µ每份样品溶液取 L 加至 950 µL 蒸馏水至新的 1.5 mL 微量离心管中。然后，加入 60 µ将每种稀释后的样品各取 L，以 H1 位置为起点，每个样品设三个复孔，加入至 96 孔板中。当每个样品均设三个复孔进行检测时，一块 96 孔板可容纳 6 个标准品、1 个空白对照以及 25 个待测样品。每块用于分析的 96 孔板均应包含其对应的标准 IgG 样品和空白对照样品。
    4. 加入100 µL 蒸馏水加入所有空白和未知样品孔中。此时每个孔的总体积应为 160 µL. 使用多通道移液器（8通道），加入40 µ在微孔板第一列的每个孔中加入L量的考马斯亮蓝G-250蛋白染料。通过反复吹打数次使染料与样品充分混匀。对所有其他列重复该步骤，每次更换移液器吸头以避免交叉污染。
      警告： 考马斯亮蓝 G-250 具有刺激性，应避免接触皮肤、眼睛或肺部。请佩戴手套以防止皮肤接触。若 若接触皮肤，该产品会造成染色。
    5. 用针头刺破孔中可能存在的气泡，以免干扰酶标仪的读数。清洁针头以避免孔间污染。将微孔板在室温下孵育5分钟。
    6. 使用微孔板分光光度计，在595 nm波长下记录每个孔的吸光度值。
    7. 记录三个空白孔的平均吸光度，并从每个标准品和未知样品的读数中减去该值。然后，记录每个标准品和未知样品的平均吸光度。
      注意：为了利用标准曲线计算每个未知样品中的蛋白质含量，最简便的方法是将每个标准品的平均吸光度对其所含蛋白质的微克数进行回归分析，但也可 绘制蛋白质浓度（µ克/µL）时，可根据需要进行。然而，以下计算基于微克（μg）而非浓度的标凈曲线µ克/µL)
    8. 将每个标准品孔的平均吸光度对其所含蛋白质总量作图（表1）。对这些数据拟合线性回归直线，并利用方程计算蛋白质含量（µg) 根据平均吸光度，在每个未知样品孔中图1a).
      注：相关系数（r 该直线的值应大于0.98，通常接近0.99。标准回归曲线针对每块酶标板具有特异性，因此每块板中的未知样品孔必须单独分析。
    9. 在计算出每个未知样品孔的平均蛋白质量后，使用以下公式计算总蛋白质量（µg) 在每个原始样品中：
           Mp = (((Wp/60) × 1000)/50) × 1000
           Mp = µ原始样品中的蛋白质含量（g）
           Wp = µ未知样品孔中的蛋白质含量（g）
      1. 然后，使用以下公式计算每个样品中蛋白质的百分比：
             Pp = ((Mp/1000)/Mi)*100
             Pp 样品中可溶性蛋白质百分比
             Mi = 样品初始质量（mg）
        注意：在某些情况下，样品可能超出吸光度上限阈值。若如此，需在步骤 2.4.3 对样品溶液进行进一步稀释。
        后续计算中必须考虑额外的稀释倍数。一些酶标仪品牌还提供计算机软件，可根据标准曲线数据自动计算每个未知样品的平均蛋白浓度。

3. 可消化碳水化合物测定

  1. 样品制备
    1. 将每种组织的重复样品各约 20 mg 称量至带有橡胶衬垫螺旋盖的玻璃 15 mL 试管（长度 100 mm）中。这些样品后续将被称为未知样品。使用防水记号笔或在管盖上贴标签纸进行标记，并记录每个样品的精确质量，因为该信息将用于计算每个未知样品中的%碳水化合物含量。
  2. 从每个未知样品中提取可消化碳水化合物。
    1. 向每根试管中加入 1 mL 0.1 M H2SO4，并拧紧管盖。将试管置于沸水浴中加热 1 小时。
      注意：硫酸具有强腐蚀性。操作 H2SO4 时请佩戴手套、护目镜和实验服，并在通风橱中进行此步骤。
    2. 将试管在温水浴中冷却。将管内内容物倒入已标记的 1.5 mL 微离心管中（若部分植物材料残留在玻璃试管中，无需担心）。
    3. 以 15,000 × g 离心 10 分钟。用微量移液器移取上清液，并转移至新的已标记 1.5 mL 微离心管中。此时可将样品在冰箱中冷藏过夜。如需继续进行检测，请参见步骤 3.3.2。
  3. 配制标准溶液并测定未知样品的总可消化碳水化合物含量。
    1. 按照表 2列出的浓度配制 D(+)葡萄糖标准溶液。取六支玻璃试管，每支加入 400 µL 各种标准溶液。
    2. 将每种未知样品各取 15 µL 加入各自的试管中，并向每管加入 385 µL 蒸馏水，使每支试管总体积为 400 µL。在通风橱中，向每支标准品和未知样品试管中加入 400 µL 5% 苯酚，然后迅速向每管加入 2 mL 浓 H2SO4。移液枪头不要接触试管内液体，只需将试剂加至液面表面（使用多通道移液器效果最佳）。
    3. 让试管静置孵育 10 分钟，然后小心涡旋混匀。再继续孵育 30 分钟。
      注意：苯酚和硫酸均为腐蚀性刺激物。为防止皮肤、眼睛接触及吸入，此步骤应在化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括面罩或护目镜、橡胶手套、实验服和靴子。苯酚与硫酸混合会产生放热反应，导致试管变热。
    4. 从每支试管中吸取 800 µL 样品，分别加入 3 个聚苯乙烯 1.5 mL 半微量比色皿中（每个样品设 3 个技术重复）。将分光光度计设置为 490 nm 波长读数。在测定标准品或未知样品前，使用含蒸馏水的空白比色皿校准仪器，并在样品测定过程中间歇性重新校准。将每个比色皿依次放入分光光度计中测定吸光度，并记录数值。对每个未知样品的技术重复结果取平均值。
      注：在某些情况下，样品可能超出吸光度上限。若出现此情况，应在步骤 3.2.3 中对样品进行稀释。后续计算中必须考虑稀释倍数。
    5. 计算每个标准品的平均吸光度。
      注：为利用标准曲线计算每个未知样品中总可消化碳水化合物的含量，最简便的方法是将每个标准品的平均吸光度对其所含 D(+)葡萄糖的微克数（µg）进行回归分析；但如有需要，也可 绘制每个标准品的 D(+)葡萄糖浓度（µg/µL）曲线。然而，以下计算均基于以微克数（µg）而非浓度（µg/µL）构建的标准曲线。
    6. 通过将每个标准溶液的平均吸光度对其所含 D(+)葡萄糖总量（µg）作图，绘制标准曲线。对这些数据拟合线性回归直线，然后使用以下公式计算每个未知样品中碳水化合物的总量（µg）：
           Mc = (((Ax – b)/m)/(15))*1000
           Mc = 样品中碳水化合物的微克数
           Ax = 未知样品的平均吸光度
           b = y 轴截距（标准回归线）
           m = 斜率（标准回归线）
      该直线的相关系数应大于 0.98，通常接近 0.99。然后使用以下公式计算每个样品中碳水化合物的百分比：
           Pc = ((Mc/1000)/(Mi))*100
           Pc = %碳水化合物
           Mi = 样品初始质量（mg）

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结果

为了展示这些方法的实用性，我们分析了四种不同田间玉米和甜玉米组织中的可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量，这些组织可作为植食性昆虫的潜在营养资源。我们从美国三个农业地区（明尼苏达州、北卡罗来纳州和得克萨斯州）采集了玉米穗，涵盖五种不同品种的甜玉米（即 基因型）以及一个作为外群的田间玉米品种。表3汇总了这些玉米样本及其采集地点。所有品种均在成熟期采集，但由于品种间发育差异，它们并非都在播种后同一天采集。我们通过快速分离苞叶（包裹穗轴的变态叶）和花丝（苞叶与籽粒之间的光亮纤维），将玉米穗加工为不同的组织部分，然后按照方法部分所述，将所有组织在 -80 °C 下保存。随后，各组织均进行冷冻干燥。干燥后，我们通过削取穗轴顶部三分之一（穗尖）和底部三分之一（穗基）的籽粒，将籽粒按位置区分为穗尖籽粒和穗基籽粒。接着，所有组织均被研磨成细粉。随后，我们根据上述方法部分所述的实验流程，对苞叶、花丝、穗尖籽粒和穗基籽粒组织样本分别测定其可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量。鉴于组织样本量有限，我们共对217个植物样本进行了可溶性蛋白和可消化碳水化...

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讨论

通过将成熟的比色测定法与高效的植物特异性提取方案相结合，本文展示的检测方法为测定植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量提供了一种合理且准确的手段。我们以玉米为例的结果表明，这些方案可用于在不同生物学相关的空间尺度上获得精确的测量数据。例如，我们能够检测到不同地理区域、品种（或基因型）、组织类型乃至空间上分隔的组织之间在植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量上的差异。这两种测定均可使用常见的实验室设备和试剂完成，仅需基本的实验操作技能，且可在较短时间内分析相对大量的样本（50–75个）。

尽管该操作相对简单，但某些步骤比其他步骤更为关键，若操作不当可能会影响结果的准确性。例如，在取样阶段必须正确处理植物材料。即使已分离的植物组织在暴露于致死温度之前仍具有代谢活性，在此期间植物的大量营养元素含量可能发生改变。因此，植物取样与冷冻（无论是液氮冷冻还是 freezer 保存）之间的时间间隔越长，样品中植物大量营养元素含量越可能无法反映取样时刻的实际含量。

蛋白质实验方案中的步骤 2.3.3-2.3.5 对于获得成功结果尤为关键，因为这些步...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢所有协助进行甜玉米田间采集的合作者，包括北卡罗来纳州立大学的 Dominic Reisig 和 Dan Mott，以及德克萨斯州的 Pat Porter& M大学（德克萨斯州卢博克）。感谢Fiona Clissold在优化实验方案以及对本手稿提供修改建议方面的帮助。本工作部分由德克萨斯A& M C. Everette Salyer 奖学金（昆虫学系）以及美国农业部生物技术风险评估资助项目竞争性资助编号 2015-33522-24099（授予 GAS 和 STB）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酶标仪（分光光度计）Bio-RadModel 680 XR
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液Bio-Rad#5000006450 mL

参考文献

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