本文所述的实验方案为测定植物组织中可溶性蛋白质和可消化（非结构性）碳水化合物含量提供了清晰且易于操作的方法。准确量化这两种植物宏量营养素，对于推动植物生理学、营养生态学、植物与植食性动物相互作用以及食物网生态学等领域的研究具有重要意义。
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本文内容
摘要
摘要
元素数据常被用于推断植物作为植食性动物资源的质量。然而，由于生物分子中普遍存在碳元素、植物防御性化合物中含有氮，以及不同物种间氮含量与植物蛋白含量之间的相关性存在差异，这些因素均限制了此类推断的准确性。此外，针对植物和（或）植食性动物生理学的研究需要更高的精确度，而通用的相关性关系难以满足这一要求。本文所介绍的方法为研究人员提供了一种清晰且快速的实验流程，用于直接测定植物可溶性蛋白质和可消化碳水化合物——这两种与动物生理表现关系最为密切的植物宏量营养素。该流程结合了已被充分验证的比色测定法与针对植物优化的特异性消化步骤，从而获得精确且可重复的结果。我们对不同甜玉米组织的分析表明，这些检测方法具有足够的灵敏度，能够检测到多种空间尺度下植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量的变化，包括不同种植区域、不同植物种类或品种之间的差异，以及同一植株内不同组织类型之间，甚至同一组织内部不同位置间的差异。将可溶性蛋白质和可消化碳水化合物含量数据与元素数据相结合，还有望为植物生物学研究开辟新途径，以连接植物矿质营养与植物生理过程。这些分析还有助于生成开展营养生态学、植物-植食性动物相互作用及食物网动态研究所必需的可溶性蛋白和可消化碳水化合物数据，从而进一步推动生理学和生态学研究的发展。
引言
植物生物量构成了几乎所有陆地食物网的基础。植物通过根系从土壤中吸收营养元素，并利用叶片组织中的阳光合成生物分子。特别是碳和氮被用于合成构建植物生物量所需的碳水化合物、蛋白质（由氨基酸组成）和脂质（需注意，在植物生理学中，“"大量营养素"一词通常指氮、磷、钾、硫等土壤元素，但本文中该术语将指蛋白质、碳水化合物和脂质等生物分子）。当植食性动物摄食植物材料时，植物组织中所含的大量营养素会被分解为其基本组分，进而用于驱动消费者的各种生理过程。因此，植物中的大量营养素对消费者的生理具有显著影响，并进一步对高阶生态相互作用及食物网动态产生重要影响。
在整个动物界中，可溶性蛋白质和可消化碳水化合物是与生存、繁殖和生理机能关系最为密切的宏量营养素1。此外，大多数动物会主动调节这两种宏量营养素的摄入量，以满足其生理需求1,2。这一点在昆虫植食性动物中尤为明显，它们能够感知植物组织中糖类和氨基酸的浓度，从而引导其取食行为。因此，植物中可溶性蛋白质和可消化碳水化合物的含量在植物与昆虫相互作用的进化过程中发挥了重要作用。
尽管有关植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量的数据相对较少（但参见6,
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方案
1. 植物采集与处理
- 采集并处理植物样品
- 采集植物样品后，使用镊子将植物材料浸入液氮中进行速冻，并在 -80 °C 下保存。如果采集的植物样品过大而无法进行速冻，应使用干冰快速冷却，并尽快转移至 -80 °C 冰箱中。植物组织在脱离植株后，其宏量营养素含量可能发生改变，因此在采集后应尽快冷冻样品。
注意：液氮接触皮肤可导致严重冻伤。请务必使用经批准的容器运输液氮，并在操作时穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括低温手套、护目镜、面罩、围裙和实验服。 - 使用冷冻干燥机对植物材料进行冻干，以确保在去除水分的过程中组织处于代谢失活状态。持续干燥直至样品质量稳定，以确保完全去除水分。
- 样品干燥后，使用研磨机或研磨仪将其研磨成细粉。将样品储存于干燥柜中，直至进行分析。
- 采集植物样品后，使用镊子将植物材料浸入液氮中进行速冻，并在 -80 °C 下保存。如果采集的植物样品过大而无法进行速冻，应使用干冰快速冷却，并尽快转移至 -80 °C 冰箱中。植物组织在脱离植株后，其宏量营养素含量可能发生改变，因此在采集后应尽快冷冻样品。
2. 可溶性蛋白质测定
- 样品制备
- 称取每种组织的重复样品各约20 mg，分别放入1.5 mL聚苯乙烯微量离心管中，并标记管子。这些样品后续将被称为未知样品。记录每个样品的精确质量，因为该信息将用于计算每个未知样品中的可溶性蛋白百分比。应使用带锁扣盖的微量离心管，因为非锁扣盖可能在后续加热步骤中开启，导致样品溶液损失。
- 溶解并分离未知样品中的蛋白质 ....
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结果
为了展示这些方法的实用性，我们分析了四种不同田间玉米和甜玉米组织中的可溶性蛋白质和可消化碳水化合物含量，这些组织可作为植食性昆虫不同的潜在营养资源。我们从美国三个农业地区（明尼苏达州、北卡罗来纳州和得克萨斯州）采集了玉米穗，涵盖了五种不同的甜玉米品种（即， 基因型）以及一种作为外群的田间玉米品种。 表3 显示了这些玉米样品的汇总信息及其采集地点。所有品种均在成熟期采集，但由于品种间发育差异，它们并非都在播种后同一时间采集。我们通过快速分离果穗上的苞叶（包裹穗轴的特化叶片）和花丝（苞叶与籽粒之间的亮色纤维），将果穗加工为不同的组织，随后将所有组织于 -80 °C 保存80 °C 如方法部分所述，将每种组织进行冷冻干燥。干燥后，通过削去玉米穗顶部三分之一（穗尖）和底部三分之一（穗基）的籽粒，将籽粒与穗轴的顶端和基部分开。随后，将所有组织研磨成细粉。接着，根据上述方法部分所述的步骤，对苞叶、花丝、穗尖籽粒和穗基籽粒组织样品分别测定可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量。由于组织样品量有限，共对217个植物样品进行了可溶性蛋白和可消化.......
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讨论
通过将成熟的比色测定法与高效的植物特异性提取方案相结合，本文展示的检测方法为测定植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量提供了一种合理且准确的手段。我们以玉米为例的结果表明，这些方案可用于在不同生物学相关的空间尺度上获得精确的测量数据。例如，我们能够检测到不同地理区域、品种（或基因型）、组织类型乃至空间上分隔的组织之间在植物可溶性蛋白和可消化碳水化合物含量上的差异。这两种测定均可使用常见的实验室设备和试剂完成，仅需基本的实验操作技能，且可在较短时间内分析相对大量的样本（50–75个）。
尽管该操作相对简单，但某些步骤比其他步骤更为关键，若操作不当可能会影响结果的准确性。例如，在取样阶段必须正确处理植物材料。即使已分离的植物组织在暴露于致死温度之前仍具有代谢活性，在此期间植物的大量营养元素含量可能发生改变。因此，植物取样与冷冻（无论是液氮冷冻还是 freezer 保存）之间的时间间隔越长，样品中植物大量营养元素含量越可能无法反映取样时刻的实际含量。
蛋白质实验方案中的步骤 2.3.3-2.3.5 对于获得成功结果尤为关键，因为这些步.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢所有协助进行甜玉米田间采集的合作者，包括北卡罗来纳州立大学的 Dominic Reisig 和 Dan Mott，以及德克萨斯州的 Pat Porter& M大学（德克萨斯州卢博克）。感谢Fiona Clissold在优化实验方案以及对本手稿提供修改建议方面的帮助。本工作部分由德克萨斯A& M C. Everette Salyer 奖学金（昆虫学系）以及美国农业部生物技术风险评估资助项目竞争性资助编号 2015-33522-24099（授予 GAS 和 STB）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酶标仪（分光光度计） | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液 | Bio-Rad | #5000006 | 450 mL |
参考文献
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology
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重印与许可
