方法文章

植物细胞悬浮液中咖啡因的提取、酶活性及咖啡因合成酶基因的表达

DOI：

10.3791/58166

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2018年10月2日

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1Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2CONACYT, Facultad de Ingeniería Química, Campus de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad Autónoma de Yucatán

本文内容

摘要

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本协议描述了一种高效的方法, 用于提取和定量的咖啡因在细胞悬浮液中的表达水平和评价咖啡因合酶酶活性的实验过程。编码这种酶的基因。

摘要

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咖啡因 (13, 7-trimethylxanthine) 是一种嘌呤生物碱, 目前流行饮料, 如咖啡和茶。这种次生代谢产物被认为是一种化学防御, 因为它具有抗菌活性, 被认为是一种天然杀虫剂。咖啡因也可以产生负面的化感作用, 防止周围植物的生长。此外, 世界各地的人们使用咖啡因的镇痛和刺激作用。由于对咖啡因技术应用的兴趣, 这种化合物的生物合成途径的研究已经发展。这些研究主要集中于了解调节咖啡因生物合成的生物化学和分子机制。体外组织培养已成为研究这种生物合成途径的有用系统。本文将介绍一步一步的协议, 以量化咖啡因和测量的转录水平的基因 (CCS1) 编码咖啡因合成酶 (CS) 的细胞悬浮液, 以及它的活动。

引言

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咖啡因是咖啡1属植物 biosynthesized 的次生代谢产物。这生物碱属于甲基黄嘌呤家庭并且被认为作为一个化工厂防御, 因为它可能采取行动反对病原体和草食动物的有害作用2,3。此外, 这种代谢物负责的刺激性能的咖啡饮料, 这是普遍消费全球4,5。由于其特性, 一些研究小组对咖啡因6,7的生物合成途径和分解代谢有兴趣。目前, 植物体外细胞/组织培养作为评价咖啡因积累的替代品, 在不同的生物和非生物学的战略8,9。

咖啡因的生物合成涉及 7-甲基黄嘌呤的水解释放从相应的核糖核苷, 其次是有序的n-methylations 在位置3和1。特定的s-甘基蛋氨酸 (SAM) 依赖 n-甲基 (NMT) 催化甲基化在位置 7, 而可可碱合酶 (TS) 和 CS 分别参与3和 1-methylation....

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方案

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1. 咖啡因在咖啡细胞悬浮液中的提取。

  1. 使用C. 咖啡细胞悬浮液9。保持悬浮由双周亚文化在 Murashige 和 Skoog 培养基在 pH 值4.3 与恒定的 100 rpm 震动25°c 在连续的光之下 (8.3 瓦特/m2)。
  2. 用11µm 孔滤纸和傅书礼漏斗在真空过滤下收获细胞。
  3. 用鳞片将收集到的细胞的新鲜重量进行登记, 用铝箔包裹, 将它们冷冻在液氮中, 并保持在-80 摄氏度直到分析。
  4. Lyophilize 冷冻细胞材料为72小时。
  5. 登记冻干细胞的重量, 以估计干重产量。
  6. 将粉状物料存放在可重复使用的聚乙烯袋中 (9 厘米 x 7.5 厘米)。浸渍的材料, 以细粉和储存在干燥, 直到使用。
  7. 测量0.5 克的干细胞物质的分析尺度, 并添加到一个玻璃瓶 (25 毫升)。
    1. 在冻干细胞中加入10毫升丙酮, 混合在三十年代的涡旋搅拌机中均匀化。然后, 用铝箔封住瓶子。
    2. 混合在 100 rpm 使用一个转子在室温 (25 °c) 为5小时。
  8. 将所有材料转移到15毫升圆锥管和离心机在 1.3万 x g 10 分钟. 将液相转移到一个新的管, 并减少在室温下的通风罩干燥。
  9. ....

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结果

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根据图 1所示的方案, 通过对样品进行色谱分析, 对通过本工艺获得的咖啡因提取物进行了薄层定量分析。为了量化细胞提取物中咖啡因的含量, 使用了这种化合物的各种商业标准的曲线 (图 2A)。用 273 nm 的最大吸收峰值 (图 2B) 分析了咖啡因的吸光度模式, 在薄层色谱板上, 咖啡因的峰值分离显示出0.34 和0.39 之间的射频 (图 2C)。

使用本协议评估的咖啡因合成酶的活性表明, 这种酶的特定活动为 1.2 pkat (表 1)。这种酶的活性类似于其他使用纯化蛋白的作者所报告的。

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讨论

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我们在这里提出了评价咖啡因含量, CS 活动和转录水平的最佳条件在体外植物组织培养, 如细胞悬浮的C. 阿拉伯咖啡。以前的报告已经证实, 在光照射下维持细胞和在培养基中存在可可碱, 是提高咖啡因含量的合适参数, 从而可以评价咖啡因分离方法。采用反相高效液相色谱法 (RP)。目前, 很少有报道使用一种简单而快速的方法和经济优势来研究细胞悬浮液中的咖啡因生物合成。在这里, 一个替代性评估显示了咖啡因的分离方法, 用薄层密度测量, 这是有效的定量分析咖啡因的细胞提取物。为了评估细胞中的咖啡因, 没有必要将可可碱与以前报告的14、15的培养细胞一起喂养。

咖啡因合酶活性已被评估的几个植物组织, 包括胚乳, 叶和种子。在这些研究中, 测定咖啡因合酶活性的方法包括部分蛋白质纯化步骤, 这表明必须使用纯化酶16,17。在这里, .......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们实验室的工作由委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) 的赠款提供给 SMTHS。这项研究还得到了 CONACyT 和 Sistema 全国 Investigadores (4422) 授予 RJPK (37938 号) 的奖学金的支持。作者感谢 CIATEJ 在撰写本手稿时使用了它的安装。特别感谢 Víctor 博士的所有建议在分子生物学科和 Valentín 门多萨, 国际金融公司, UNAM 的设施在拍摄这篇文章。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Murashige &Skoog 基础盐混合物PhytoTechnology LaboratoriesM524包装尺寸：50 L
试剂 （mg/L）
硝酸铵 （1650）
硼酸 （6.2）
氯化钙，无水 （322.2）
氯化钴•H2O （0.025）
硫酸铜&公牛;5H2O （0.025）
Na2EDTA•2H2O （37.26）
硫酸亚铁&公牛;7H2O （27.8）
无水硫酸镁 （180.7）
硫酸锰•H2O （16.9）
钼酸（钠盐）&公牛;2H2O （0.25）
碘化钾 （0.83）
硝酸钾 （1900）
磷酸钾，二元 （170）
硫酸锌&公牛;7H2O （8.6）
补充
肌醇 （100）
硫胺素 （10）
半胱氨酸 （25）
蔗糖 （30000）
2,4-二氯苯氧乙酸 （3）
6-苄胺嘌呤 （1）
咖啡因SIGMAC0750-5G标准-5g
可可碱SIGMAT450020 g
CAMAG TLC 扫描仪-4CAMAG27.62
WinCATS 平面色谱管理器软件CAMAG1.4.10软件
异戊醇 （24：1）SIGMAC-0549500 mL
环己烷JALMEXC4375-131 L
丙酮J.T. BAKER4 L
甲醇J.T. BAKER9093-034 L
氯仿JALMEXC-4425-153.5 L
TLC 硅胶 60 F254Merck1.05554.0001TLC 板
&β;-巯基乙醇M6250SIGMA100 mL
（+）-L-抗坏血酸钠A4034SIGMA100 g
Trizma 碱SIGMAT60661 Kg
盐酸 36.5-38%JT Baker9535-052.5 L
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific232227试剂盒
甲基 [3H]-S-腺苷甲硫氨酸Perkin ElmerNET15515 Ci/mmol
液体闪烁样品瓶SIGMAZ253081
恒温浴/循环器Cole Parmer60714
微量离心管Eppendorf1.5 mL
冻存管Heathrow ScientificHS23202A2 mL
离心机 5804Eppendorf5804 000925
涡旋热炔LR 5947
瓷砂浆FisherbrandFB961B
滤纸WhatmanZ274844孔隙度培养基
PicofugeStratagene4005502000 x g
分析天平和HR-120型 HR-120
闪烁计数器贝克曼库尔特6500
凝胶照相系统Bio-Rad化学 XRS模型 化学 XRS
紧凑型紫外灯UVP95002112UVGL-25
科学器 HDPE 布赫纳漏斗SIGMA2419907型 37600 混合器
TRIzol 试剂Thermo Scientific15596-018200 mL
ReverdAid 逆转录酶Thermo Scientific#EP044110000 U
寡核苷酸 （dT）<亚>18引物Thermo Scientific#S0131100 &微量;M
DNase I，不含 RNaseThermo Scientific#EN05251000 U
氯化镁Thermo ScientificEN05251.25 mL
乙二胺四乙酸Thermo ScientificEN05251 mL
dNTP 混合物Thermo ScientificR0191R0191 SYBR
Green qPCR 预混液 （2X）Thermo ScientificK0251对于 200 个 25 µL
PikoRealThermo Scientific2.2软件
苯酚，pH 8.0，平衡，分子生物学级，超纯USBJ75829100 mL
异丙醇Karal20401 L
乙醇SIGMA641751 L
焦碳酸二乙酯SIGMAD5758100 mL
实验室旋转器LW ScientificMod.LW210
900643 的比活性 系列

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
  2. Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
  3. Sled....

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RNA PCR

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