本方案描述了一种从C. arabica L. 细胞悬浮液中高效提取和定量咖啡因的方法，以及通过检测编码咖啡因合成酶的基因表达水平来评估该酶酶活性的实验流程。
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摘要
摘要
咖啡因（1,3,7-三甲基黄嘌呤）是一种存在于咖啡和茶等流行饮品中的嘌呤类生物碱。这种次生代谢物被认为是一种化学防御物质，因其具有抗菌活性，并被视为一种天然杀虫剂。咖啡因还可产生负面的化感效应，抑制周围植物的生长。此外，全球许多人摄入咖啡因以获得其镇痛和兴奋作用。由于对咖啡因技术应用的兴趣日益增加，有关该化合物生物合成途径的研究也不断增多。这些研究主要集中在阐明调控咖啡因生物合成的生化与分子机制。体外组织培养已成为研究该生物合成途径的有效系统。本文将详细介绍一种逐步操作方案，用于定量分析C. arabica L.细胞悬浮体系中咖啡因的含量，检测编码咖啡因合成酶（CS）的基因（CCS1）的转录水平，并测定其酶活性。
引言
咖啡因是一种由芸香科植物生物合成的次生代谢产物 Coffea1该生物碱属于甲基黄嘌呤类，因其能够抵御病原体和草食动物的不利影响，被视为一种植物化学防御物质。2,3此外，这种代谢产物还具有咖啡饮品的刺激特性，而咖啡饮品在全球范围内被广泛饮用。4,5由于其特性，多个研究团队对咖啡因的生物合成途径及其分解代谢过程感兴趣6,7. 目前，植物 体外 细胞/组织培养可作为评估不同生物和非生物策略下咖啡因积累的替代方法8,9.
咖啡因的生物合成涉及从相应的核糖核苷水解释放7-甲基黄嘌呤，随后按顺序进行 N3位和1位的甲基化。一种特异性的 SS-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的N-甲基转移酶（NMT）催化7位甲基化，而可可碱合酶（TS）和CS分别参与3位和1位甲基化，生成可可碱和咖啡因。对编码不同NMT的基因研究有助于理解调控咖啡因合成的机制10,11。CS，其具有 N-甲基转移酶活性，催化咖啡因生物合成途径的最后两个步骤11在咖啡树幼苗中，已有研究表明光辐射可提高咖啡因合成酶（CS）的活性，从而促进咖啡因的生物合成。最近，我们发现细胞悬浮培养物的持续培养 C. arabica 在光照条件下，L. 是评估非生物胁迫因素对咖啡因生物合成途径影响的最佳条件。8这些研究中获得的信息可能在代谢工程和系统生物学中具有应用价值，可用于最大化研究上述物种中的咖啡因生物合成途径 体外 系统。
鉴于获得适合研究咖啡因生物合成的模型具有诸多优势，我们优化了从C. arabica L. 细胞悬浮液中提取咖啡因的条件。同时，我们还建立了可用于研究酶活性的实用方案，以及检测编码该酶的Coffea咖啡因合成酶1（CCS1）基因转录水平的方法学步骤。本文中，我们报道了一种通过薄层色谱结合光密度法（TLC-光密度法）从C. arabica细胞悬浮液中提取并定量咖啡因的实验方案。
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方案
1. C. arabica L. 细胞悬浮液中的咖啡因提取
- 使用 C. arabica 悬浮细胞9。将悬浮细胞在pH为4.3的Murashige和Skoog培养基中进行继代培养，每两周传代一次，于25 °C、100 rpm持续振荡、连续光照（8.3 W/m2）条件下维持培养。
- 使用孔径为11 µm的滤纸和布氏漏斗，通过真空抽滤收集细胞。
- 使用天平称量所收集细胞的鲜重，用铝箔包裹后，在液氮中速冻，并于-80 °C保存直至分析。
- 将冷冻的细胞材料冻干72小时。
- 称量冻干细胞的重量，以估算干重得率。
- 将粉末状材料储存于可重复使用的聚乙烯袋（9 cm × 7.5 cm）中。将材料研磨成细粉后，置于干燥器中保存备用。
- 在分析天平上称取0.5 g干细胞物质，加入玻璃烧瓶（25 mL）中。
- 向冻干细胞中加入10 mL丙酮，使用涡旋振荡器混合30秒以实现均质化，随后用铝箔密封烧瓶。
- 在室温（25 °C）下，使用旋转器以100 rpm振荡混合5小时。
- 将全部混合物转移至15 mL锥形离心管中，在13,000 × g 条件下离心10分钟。将上清液转移至新离心管中，并在通风橱内室温下挥干至干燥。
- 用25 µL丙酮重新悬浮样品。
2. 采用薄层色谱（TLC）-光密度法测定咖啡因的条件
- 将1 µL先前重悬的咖啡因提取物加到固定相上。
注意：使用硅胶板（F254）作为固定相。在点样前，将硅胶板置于层析缸（14 cm × 12 cm × 9.5 cm）中，用10 mL氯仿-甲醇[9:1 v/v]展开，随后在室温下干燥。样品点样所用层析板的特征如图1所示。展开前，层析缸需用溶剂饱和30分钟。操作TLC板时应佩戴手套，以避免污染。 - 在层析缸中使用10 mL流动相环己烷-丙酮[40:50 v/v]展开TLC。
注意：该混合溶剂可使咖啡因的保留因子（Rf）达到0.34。- 从层析缸中取出TLC板，并在室温下完全干燥。
- 在短波紫外光（UV，254 nm）下观察咖啡因条带。使用便携式紫外灯。此外，此步骤应佩戴具有紫外防护功能的护目镜。
- 在273 nm波长下通过光密度法测定咖啡因含量。仪器由色谱软件控制。
3. 核糖核酸（RNA）提取
- 取步骤1.1中的细胞悬液，用孔径为11 µm的滤纸进行真空过滤。
- 从滤纸上收集细胞材料，在分析天平上称取0.5 g细胞材料，用铝箔包裹。用液氮冷冻样品2.
- 在研钵中用液氮研磨细胞样品，加入1 mL RNA提取试剂，直至匀浆完全。
注意：将瓷研钵在马弗炉中于 300 °C 灭菌 6 小时。RNA 提取试剂含有苯酚、异硫氰酸胍及其他成分。- 将500 µL样品转移至无菌的微量离心管（1.5 mL）中。加入300 µL氯仿-异戊醇（24:1）和300 μL平衡酚（pH 8.0）。
- 将样品用涡旋混合器混匀，然后在20,000 x g 4 °C 下离心 15 分钟。
- 转移300 μL上层相至微量离心管中，加入200 μL异丙醇，在-20 °C孵育1小时。
- 将离心管在12,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟，然后弃去上清液。
- 加入1 mL 70%乙醇，使管中形成沉淀。在12,000 x g 10 分钟后倾析，重复此步骤两次。
- 在室温（25 °C）下干燥样品1.5小时。用25 μL经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水重悬RNA提取物。
注意：RNA 提取时，使用经 0.1% DEPC（v/v）处理的水。
4. RNA转录本与脱氧核糖核酸酶（DNase）的孵育
- 取2 µg总RNA提取物加入无菌微量离心管中，加入1 μL 10x反应缓冲液（100 mM Tris-HCl，25 mM MgCl2，1 mM CaCl2），再加入1 μL 1 U/µL DNase。
- 用DEPC处理水将反应体系补至终体积10 μL，混匀样品后，在2,000 x g 条件下短暂离心1分钟。
- 将样品在37 °C孵育30分钟。
- 加入1 μL 50 mM乙二胺四乙酸二钠二水合物（Na2EDTA）终止反应，并将样品在65 °C孵育10分钟。
- 通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。
- 制备标准的1%琼脂糖凝胶，并加入1 µL 3x嵌入式核酸染色液进行染色。
- 将500 ng RNA上样至琼脂糖凝胶，进行电泳。
- 使用凝胶成像系统观察RNA的完整性。
- 以RNA为模板，利用逆转录酶进行cDNA合成。
5. 互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成
- 取2.5 μg总RNA加入微量离心管中，加入1 μL寡聚脱氧胸苷（dT）引物，并用无核酸酶水补至终体积13 μL。混匀样品后，在2,000 × g 条件下离心1 min。
- 将样品在65 °C下孵育5 min，然后在4 °C下孵育2 min。
- 加入4 μL用于逆转录酶的5×反应缓冲液、2 μL脱氧核苷三磷酸（dNTPs）混合液（每种dNTP浓度为10 mM）以及1 μL逆转录酶（200 U/µL）。轻轻混匀，并在2,000 × g 条件下离心1 min。
- 将样品在45 °C下孵育50 min，然后在70 °C下孵育10 min。
- 使用紫外分光光度计测定cDNA浓度。
- 以cDNA作为模板进行聚合酶链式反应（PCR）。
注意：反应缓冲液分别以10×（步骤4.1.1）和5×浓度（步骤5.3）使用。
6. 实时定量 PCR（qPCR）扩增 CCS1 基因
- 在PCR微量离心管中加入7.5 μL Taq DNA聚合酶2x（0.1 U/mL）和0.1 μM的5-羧基-X-罗丹明（ROX）。
注意：热启动Taq DNA聚合酶2x使用的是2倍浓度的溶液。- 加入5 μL无核酸酶水。
- 分别加入0.75 μL的10 μM正向引物和反向引物，用于扩增基因CCS1（AB086414）（正向引物：5’-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3’，反向引物：5’-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3’）。在单独反应中使用微管蛋白引物作为内参基因（正向引物：5’-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3’，反向引物：5’-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3’）9。
- 加入600 ng cDNA模板。
- 在50 °C孵育2分钟，95 °C孵育5分钟，进行扩增反应。在实时PCR系统中进行40个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、60 °C退火30秒和72 °C延伸30秒。
- 将样品在50 °C孵育30秒，20 °C孵育10秒。
- 使用PCR软件分析数据。
- 采用Livak和Schmittgen（2001）12描述的2-ΔΔCT法计算相对表达量。
注意：分析一个不含DNA模板的对照反应（无模板对照，NTC），以排除试剂污染或引物二聚体的扩增。
7. C. arabica L. 细胞悬浮液的总蛋白提取物
- 使用中等孔径的滤纸在真空条件下过滤细胞悬液。
- 称取1 g细胞材料，并用铝箔包裹。
- 用液氮冷冻样品。在已灭菌的瓷研钵中研磨样品，得到细粉。
- 将样品转移至玻璃小瓶中，加入2.5 mL提取缓冲液（400 mM盐酸三(羟甲基)氨基甲烷（Tris-HCl），pH 8.0，含10 mM β-巯基乙醇、5 mM Na2EDTA 和0.5% (w/v) 抗坏血酸钠）。
- 在涡旋振荡器上混合样品2分钟。
注意：必须将样品保持在冰上，以防止蛋白质变性。
- 在涡旋振荡器上混合样品2分钟。
- 在4 °C条件下，以20,000 × g 离心20分钟，然后将500 µL分装至冷冻小瓶（2 mL）中。将样品储存于-72 °C直至使用。
- 使用牛血清白蛋白作为标准品，通过二辛可宁酸法在分光光度计上于562 nm处测定样品的蛋白质浓度。
8. 咖啡因合成酶的酶学测定
- 在微量离心管中配制反应混合液，包含 200 µM SAM、4.07 kBq 的甲基[3H]-SAM、200 µM 可可碱、200 µM MgCl2 和 5 µM 咖啡因。用 pH 8.0 的 100 mM Tris-HCl 缓冲液将总体积调至 200 µL。
- 将微量离心管置于冰上，加入含有 7–9 mg 蛋白质的可溶性组分。涡旋混匀后，在 30 °C 恒温水浴/循环器中孵育 30 分钟。若处理多个样品批次，应每隔 1 分钟依次孵育各样品，并设置双复孔，以确保所有样品均能精确完成 30 分钟的反应时间。
- 加入 1 mL 氯仿以终止反应，随后使用涡旋振荡器振荡样品。继续涡旋振荡 3 分钟，以去除溶剂中的放射性咖啡因。
- 在 11,000 × g 条件下离心 5 分钟，小心回收 900 µL 上清液，然后将样品转移至闪烁计数小瓶中。
- 在室温（25 °C）通风橱中将氯仿完全蒸发至干燥。向小瓶中加入 5 mL 闪烁液，并混匀样品。
- 使用闪烁计数器检测掺入咖啡因中的放射活性。
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结果
通过本方案获得的咖啡因提取物采用薄层色谱-光密度法进行分析，即将样品按图1所示流程进行薄层板色谱分离。为定量测定细胞提取物中咖啡因的含量，使用该化合物的不同浓度商业标准品绘制标准曲线（图2A）。咖啡因的吸收光谱在可见光区（UV-VIS）进行分析，其最大吸收峰位于273 nm（图2B）；薄层板上咖啡因斑点的分离结果显示其比移值（Rf）介于0.34至0.39之间（图2C）。
采用本方案测定的咖啡因合成酶活性显示，该酶的比活性为 1.2 pkat（表 1）。该酶的活性与其他使用纯化蛋白的作者所报道的结果相似。
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讨论
我们在此提供了评估咖啡因含量、CS活性及转录水平的最佳条件 体外 植物组织培养，例如细胞悬浮液 C. arabica已有研究证实，在光照条件下培养细胞，并在培养基中添加可可碱，有助于提高咖啡因含量，从而可通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）评估咖啡因的分离方法。目前，关于利用简单、快速且具有经济优势的方法研究细胞悬浮体系中咖啡因生物合成的报道仍较少。本文提出一种替代性评估方法，采用薄层色谱-光密度法（TLC-densitometry）分离咖啡因，该方法适用于细胞提取物中咖啡因的定量分析。在对细胞中咖啡因进行检测时，无需如先前报道所述向培养细胞外源添加可可碱。14,15.
已对多种植物组织（包括胚乳、叶片和种子）中的咖啡因合成酶活性进行了评估。在这些研究中，测定咖啡因合成酶活性的方法均包含部分蛋白质纯化步骤，表明使用纯化的酶可能是必要的16,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本实验室的工作由墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT 219893）向 SMTHS 提供的资助项目支持。本研究还得到了墨西哥国家科学技术委员会向 RJPK 提供的奖学金（编号 37938）以及国家研究人员体系（4422）的支持。作者感谢 CIATEJ 在本论文撰写期间提供设施支持。特别感谢 Víctor Manuel González Mendoza 博士在分子生物学部分提供的所有建议 ，以及墨西哥国立自治大学（UNAM）的 Valentín Mendoza Rodríguez、IFC 在本文拍摄过程中提供的便利条件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 穆拉希格 && 霍格兰-斯科格基本盐混合物 | PhytoTechnology Laboratories | M524 | 包装规格：50 L 试剂（mg/L） 硝酸铵 (1650) 硼酸（6.2） 氯化钙，无水（322.2） 氯化钴•H2O (0.025) 硫酸铜•5H2O (0.025) 钠2EDTA•2H2O (37.26) 硫酸亚铁•7H2O (27.8) 硫酸镁，无水（180.7） 硫酸锰•H2O (16.9) 钼酸（钠盐）• 2H2O (0.25) 碘化钾 (0.83) 硝酸钾 (1900) 磷酸二氢钾（170） 硫酸锌•7H2O (8.6) 添加了 肌醇（100） 硫胺素（10） 半胱氨酸（25） 蔗糖（30000） 2,4-二氯苯氧乙酸（3） 6-苄氨基嘌呤 (1) |
| 咖啡因 | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| 可可碱 | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG 薄层色谱扫描仪-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS 薄层色谱管理软件 | CAMAG | 1.4.10 | 软件 |
| 异戊醇（24:1） | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| 环己烷 | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| 丙酮 | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| 甲醇 | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| 氯仿 | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC 硅胶 60 F254 | 默克 | 1.05554.0001 | 薄层色谱板 |
| β-巯基乙醇 | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-抗坏血酸钠 | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma碱 | SIGMA | T6066 | 1 千克 |
| 盐酸 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 232227 | 试剂盒 |
| 甲基[3H]-S-腺苷甲硫氨酸 | Perkin Elmer | NET155 | 15 Ci/mmol 的比活性 |
| 液体闪烁计数瓶 | SIGMA | Z253081 | |
| 恒温水浴/循环器 | Cole Parmer | 60714 | |
| 微量离心管 | Eppendorf | 1.5 mL 离心管 | |
| 冻存管 | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| 涡旋 | Thermolyne | LR 5947 | |
| 瓷研钵 | Fisherbrand | FB961B | |
| 滤纸 | 沃特曼 | Z274844 | 多孔介质 |
| 微量离心机 | Stratagene | 400550 | 2000 × g |
| 分析天平 | 以及 | HR-120 | Model HR-120 |
| 闪烁计数器 | Beckman Coulter | 6500 | |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| 紧凑型紫外灯 | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE 布氏漏斗 | SIGMA | 2419907 | 37600 型混合器 |
| TRIzol 试剂 | 赛默飞世尔科技 | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid 逆转录酶 | 赛默飞世尔科技 | #EP0441 | 10000 U |
| 寡核苷酸(dT)18 引物 | 赛默飞世尔科技 | #S0131 | 100 µM |
| DNase I，无RNase | 赛默飞世尔科技 | #EN0525 | 1000 U |
| 氯化镁 | 赛默飞世尔科技 | EN0525 | 1.25 mL |
| 乙二胺四乙酸 | 赛默飞世尔科技 | EN0525 | 1 mL |
| dNTP混合物 | 赛默飞世尔科技 | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | 赛默飞世尔科技 | K0251 | 200次25微升反应 µL |
| PikoReal | 赛默飞世尔科技 | 2.2 | 软件 |
| 苯酚，pH 8.0，平衡，分子生物学级，超纯 | USB | J75829 | 100 mL |
| 异丙醇 | Karal | 2040 | 1 L |
| 乙醇 | SIGMA | 64175 | 1 L |
| 焦碳酸二乙酯 | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| 实验室旋转仪 | LW Scientific | Mod. LW210 |
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