在此，我们介绍一种在正交可调生物材料中三维培养患者来源的胶质母细胞瘤细胞的实验方案，该生物材料旨在模拟脑基质。该方法提供了一种 体外，可维持多种特性的实验平台 体内 胶质母细胞瘤细胞在培养过程中通常会丢失。
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本文内容
摘要
摘要
胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且致死性最高的中枢神经系统肿瘤。近年来，许多研究聚焦于脑部独特微环境中细胞外基质（ECM）组分（如透明质酸，HA）如何促进GBM的进展与侵袭。然而，大多数体外（in vitro）培养模型并未将GBM细胞置于ECM环境中进行研究。小鼠异种移植模型也被广泛使用，但体内（in vivo）模型难以分离肿瘤微环境复杂组分中各个特征对肿瘤行为的独立影响。本文介绍一种基于透明质酸（HA）水凝胶的三维（3D）培养平台，使研究人员能够独立调控HA的浓度与刚度。该水凝胶由高分子量HA和聚乙二醇（PEG）组成，并在活细胞存在下通过迈克尔加成反应交联形成。来源于患者的GBM细胞在该3D水凝胶培养系统中表现出与标准胶质瘤球培养相当甚至更优的存活率和增殖能力。该水凝胶系统还可掺入模拟ECM的多肽，以单独研究特定细胞-ECM相互作用的影响。水凝胶具有良好的光学透明性，便于对3D培养中的活细胞进行成像。最后，HA水凝胶培养体系与多种常规分子和细胞分析技术兼容，包括PCR、蛋白质印迹（Western blotting）以及冷冻切片后免疫荧光染色。
引言
三维（3D）培养系统在模拟细胞与其天然组织中周围细胞外基质（ECM）之间的相互作用方面，优于二维（2D）培养系统1,2。组织工程领域的进展已催生出复杂的3D培养平台，可实现对以下两方面进行可控研究：1）基质微环境中化学和物理组分如何影响细胞行为；2）针对多种疾病（包括癌症）的新治疗策略的有效性2。尽管体外（in vitro）模型无法涵盖内分泌和免疫信号等全身性因素，因而不能完全替代体内（in vivo）模型，但其具有诸多优势，包括可重复性高、实验可控性强、成本低且速度快。本文中，我们描述了脑仿生水凝胶的应用，其中源自患者的脑肿瘤细胞的3D培养可再现肿瘤生理的多个方面，特别是获得治疗耐药性的动态过程3。与其他体外（in vitro）方法相比，这些培养模型能更真实地反映体内（in vivo）肿瘤模型和临床观察结果3。
胶质母细胞瘤（GBM）是起源于大脑的最常见且致死率最高的癌症，其中位生存期仅为1-2年4,5。近年来，许多研究聚焦于肿瘤....
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方案
所有人体组织采集步骤均在经机构批准的方案下进行。
1. 透明质酸的硫醇化
注意：摩尔比是相对于羧酸根基团的总数而言，除非另有说明。
- 在已高压灭菌的 250 mL 锥形瓶中，将 500 mg 透明质酸钠（HA，500–750 kDa）以 10 mg/mL 的浓度溶于去离子蒸馏水（DiH2O）中。室温下搅拌溶液（约 200 rpm）2 小时，使 HA 完全溶解。在巯基化过程中，使用搅拌子和磁力搅拌器持续搅拌反应液。
- 用 0.1 M 盐酸（HCl）将 HA 溶液的 pH 调至 5.5。称取 69.6 mg（0.25× 摩尔比）1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）。
注：尽管未溶解的 EDC 可直接加入 HA 溶液中，但通常更便于先将其溶于 1 mL DiH2O 中，然后迅速将 EDC 溶液加入 HA 溶液。在步骤 1.3 和 1.4 中加入反应前，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和盐酸胱胺也可预先溶于 1 mL DiH2O 中。 - 向反应体系中加入 17.9 mg（0.125× 摩尔比）NHS。用 0.1 M HCl 将反应液 pH 调至 5.5，并在室温下孵育 45 分钟。
- 向反应液中加入 70.0 mg（0.25× 摩尔比）盐酸胱胺。用 0.1 M 氢....
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结果
每批巯基化HA均应使用1H-NMR或Ellman法检测巯基化程度。采用本方案进行HA修饰可稳定获得约5%的巯基化率（定义为巯基与HA二糖单元的摩尔比）(图1)。
建立这一新型培养平台需要各实验室在开展大规模实验前进行严格的测试，以确保良好的细胞培养活性。我们采用80 µL水凝胶，接种密度为500,000 cells/mL（即每凝胶40,000个细胞），其细胞增殖率始终与胶质瘤球体培养相当，甚至更优(图2A-2C)。由于HA/PEG水凝胶具有良好的光学透明性，可通过相差显微镜或荧光显微镜直接观察活体三维培养中的细胞行为。图3A显示，在包封4天后，含有RGD的水凝胶中的胶质母细胞瘤（GBM）.......
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讨论
使用该三维培养系统生成可重复数据需要：1）透明质酸（HA）批次间巯基化的一致性；2）熟练掌握水凝胶前体的有效混合以及水凝胶培养物的操作技巧，以避免损伤；3）针对所用的每种细胞系优化接种密度。
当希望在水凝胶中达到特定的透明质酸（HA）质量百分比时，HA的巯基化程度决定了交联密度。我们建议每次巯基化反应使用相同量的HA，以尽量减少批次间的差异。建议每次巯基化反应至少使用300 mg的HA，以便同一批次的巯基化HA可用于多次实验重复。四臂PEG上巯基与马来酰亚胺基团的摩尔比应始终为1.1:1，以确保最大的交联效率。因此，如果巯基化程度发生变化，则必须相应调整加入的PEG-Mal的量。当肽段在凝胶形成前与马来酰亚胺偶联时，在计算中必须从可用马来酰亚胺总数中减去估计的带有连接肽段的PEG臂数量。此外，我们建议将HA的巯基化程度控制在10–15%以下，以避免形成二硫键，从而防止材料无法溶解或凝胶过程不一致。
巯基与马来酰亚胺基团之间的迈克尔加成反应可确保凝胶化在不到一分钟内完成。尽管这种快速凝胶化可最大限度地减少悬浮在水凝胶前体中的细胞.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：R21NS093199）和加州大学洛杉矶分校（UCLA）ARC 3R's 奖项的资助。我们诚挚感谢Harley Kornblum博士实验室提供了HK301和HK157细胞系。同时感谢加州大学洛杉矶分校组织病理学核心实验室（TPCL）提供的冷冻切片服务，感谢加州大学洛杉矶分校加州纳米系统研究所（CNSI）先进光学显微镜/光谱学核心设施（ALMS）提供共聚焦显微镜的使用，感谢加州大学洛杉矶分校Crump分子成像研究所提供IVIS成像系统的使用，感谢加州大学洛杉矶分校分子仪器中心（MIC）提供磁共振波谱分析支持，以及感谢加州大学洛杉矶分校Jonsson综合癌症中心（JCCC）流式细胞术核心实验室提供流式细胞术相关仪器设备。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pH计 | Thermo Fisher | N/A | 任何具有pH 2-10检测灵敏度的pH计 |
| 磁力搅拌器 | Thermo Fisher | N/A | 常规实验室设备 |
| 锥形瓶（125mL） | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| 透析管 | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L聚丙烯烧杯 | Thermo Fisher | S01916 | |
| 透明质酸钠 | Lifecore | HA700k-5 | 分子量范围500-750 kDa |
| 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC） | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） | Sigma Aldrich | 130672-5G | |
| 盐酸（HCl） | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| 胱胺二盐酸盐 | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman试剂（5-(3-羧基-4-硝基苯基)二硫代-2-硝基苯甲酸） | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| 重水（氧化氘） | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm 真空驱动滤器 | CellTreat | 229706 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks'平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4臂-PEG-马来酰亚胺 | JenKem Technology | A7029-1 | 分子量约为20 kDa |
| 4臂-PEG-巯基 | JenKem Technology | A7039-1 | 分子量约为20 kDa |
| L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | C7880-100G | |
| RGD细胞外基质模拟肽 | Genscript Biotech | N/A | 定制肽，序列为"GCGYGRGDSPG"，N端应乙酰化 |
| 硅胶模具 | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | 使用剃刀切割成单个片状 |
| 完全培养基 | Various | Various | DMEM/F12（Thermo Fisher）添加无血清补充剂（GeminiBio的G21）、表皮生长因子50 ng/mL（Peprotech）、成纤维细胞生长因子20 ng/mL（Pepro Tech）和肝素25µg/mL（Sigma Aldrich）；不同实验室培养基配方可能不同 |
| 患者来源的胶质母细胞瘤细胞 | N/A | N/A | |
| 20G针头 | BD医疗 | 305175 | |
| 1mL注射器 | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL注射器 | BD医疗 | 302995 | |
| RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂小片剂 | Sigma Aldrich | 5892970001 | |
| 涡旋振荡器 | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm细胞筛 | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| 多聚甲醛 | Thermo Fisher | AC416785000 | 溶于PBS配制成4%（w/v），保持pH 7.4 |
| D-蔗糖 | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| 最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂 | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| 细胞培养孵箱 | Thermo Fisher | N/A | 任何具备5% CO₂和37°C条件的通用孵箱 |
| 冰箱/冷冻柜 | Thermo Fisher | N/A | 任何具备-20°C和-80°C制冷能力的通用实验室设备 |
| 一次性包埋模具 | Thermo Fisher | 12-20 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco | N/A | 任何可达到-105°C的冻干机 |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| 棕色小瓶 | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| 宽口移液器吸头 | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-甲基丁烷 | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| 干冰 | N/A | N/A |
参考文献
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103
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