我们描述了三种在体外评估化学物质脱色素活性的实验方法：1）细胞酪氨酸酶活性的定量，2）黑色素含量的定量，以及3）通过细胞黑色素染色和图像分析来测定黑色素。
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摘要
摘要
本研究介绍了在体外定量测定脱色素活性的实验室方法。黑色素是黑色素细胞中的主要色素，其合成受到多种细胞和环境因素的调控。黑色素可保护皮肤细胞免受紫外线损伤，同时还具有多种生物物理和生化功能。黑色素在黑色素细胞中过度生成或积聚可导致多种皮肤问题，如雀斑、色素沉着斑、黄褐斑和痣。因此，对于有临床或美容需求的个体，使用脱色素剂调控黑色素生成具有重要意义。黑色素主要在黑色素细胞的黑素体中，通过一个称为黑色素生成的复杂生化过程合成，该过程受到激素、炎症、年龄和紫外线照射等内外因素的影响。本文描述了三种用于测定化学物质或天然物质在黑色素细胞中脱色素活性的方法：1）细胞酪氨酸酶活性测定，2）黑色素含量测定，以及3）通过图像分析对细胞内黑色素进行染色与定量分析。
在黑色素生成过程中，酪氨酸酶催化限速步骤，将L-酪氨酸转化为3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），再进一步转化为多巴醌。因此，抑制酪氨酸酶是减色素形成的主要机制。在培养的黑色素细胞中，可通过添加L-DOPA作为底物，并利用分光光度法测定多巴醌的生成量来定量酪氨酸酶活性。黑色素生成也可通过测定细胞内黑色素含量来评估。含黑色素的细胞组分可用NaOH提取，并通过分光光度法对黑色素进行定量。此外，还可通过Fontana-Masson染色后进行图像分析来定量黑色素含量。尽管这些体外实验的结果未必总能在人体皮肤中重现，但这些方法在黑色素生成研究中被广泛使用，尤其作为筛选潜在减色素活性的初步步骤。这些方法也可用于评估黑色素细胞的活性、生长及分化状态。三种不同方法获得一致的结果可确保所观察效应的有效性。
引言
黑色素在皮肤、眼睛和大脑等多个器官的生理学、病理学及毒理学中发挥着关键作用1。黑色素的主要功能包括光屏蔽作用和生物化学效应。黑色素可吸收近红外光、可见光以及紫外线（UV）辐射，且对波长较短的光具有更高的吸收率；因此，黑色素能够保护组织免受可见光或紫外线辐射造成的损伤2。黑色素具有抗氧化特性，并能与金属及其他有毒化学物质结合；因此，其可保护组织免受氧化应激和化学应激的损害3。然而，黑色素的过度生成会导致皮肤相关疾病。
皮肤和虹膜中黑色素的数量和质量是决定皮肤和虹膜颜色的最重要因素。不同个体对肤色可能存在不同偏好；一些人偏爱晒黑的肤色，而另一些人则更喜欢较浅的肤色。根据这些消费者特征，已开发出减色素化妆品，以满足不同人群对理想肤色的市场需求4。因此，对减色素作用及抗黑色素生成活性的研究在科学和实际应用上均具有重要意义。
黑色素生成是黑色素细胞中通过一系列酶促和非酶促化学反应合成黑色素的复杂过程。一个黑色素细胞周围大约有36个角质形成细胞，黑色素细胞作为黑色素合成的“工厂”，将其产物分配给邻近的角质形成细胞。在皮肤中，黑色素细胞内黑色素体区室中产生并储存的黑色素被转运至表皮中的邻近角质形成细胞。 通过 树突
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方案
1. 培养基、化合物和试剂的准备
- 准备B16F10细胞完全培养基。在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（PEST）。
- 配制500 mL完全培养基时，将445 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、50 mL FBS和5 mL PEST加入1 L无菌玻璃瓶中。轻轻混匀后，通过0.2 µm瓶顶滤器过滤至新的无菌玻璃瓶中，4 °C保存。
注意：所有细胞培养操作均应在生物安全柜中采用无菌技术进行，以确保无菌状态。
- 配制500 mL完全培养基时，将445 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、50 mL FBS和5 mL PEST加入1 L无菌玻璃瓶中。轻轻混匀后，通过0.2 µm瓶顶滤器过滤至新的无菌玻璃瓶中，4 °C保存。
- 配制裂解缓冲液：含0.1% Triton X-100（v/v）的20 mM Tris（羟甲基）氨基甲烷缓冲液，pH 7.5（用HCl调节pH）。该缓冲液室温（RT）保存可使用3个月。使用前立即加入蛋白酶抑制剂。
- 配制酪氨酸酶抑制剂检测缓冲液。分别配制1 M NaH2PO4（一碱）和1 M Na2HPO4（二碱）储备液。取46.3 mL Na2HPO4与53.7 mL NaH2PO4混合，得到0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 6.8）。
- 用H2O将上述混合液定容至1 L（终体积）。调节终溶液pH至6.8。该....
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结果
以下展示了熊果苷（一种抗黑色素生成化合物）在B16F10黑色素细胞中脱色素活性的代表性结果。图1A显示，与溶剂处理对照组相比，熊果苷显著抑制了细胞酪氨酸酶活性。同样，经熊果苷刺激的细胞其黑色素含量也较对照组显著降低（图1B）。图1C展示了经Fontana-Masson染色后的细胞显微图像。与对照组相比，熊果苷处理减少了黑色色素的分布面积。
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讨论
我们介绍了利用培养的黑色素细胞评估受试化合物脱色活性的实验方案。代表性结果展示了熊果苷的脱色效果，该物质是一种酪氨酸酶抑制剂，可抑制酪氨酸酶活性及细胞内黑色素含量。这些方法广泛应用于抗黑色素生成活性的研究。在过去十年中，利用这些检测方法，我们已成功鉴定出多种对B16F10细胞具有抑制黑色素生成作用的生物活性化合物9,10,11,12,13,14。
黑色素由多种色素细胞中的黑色素体产生，包括皮肤中的黑素细胞。在本研究中，我们使用了能够产生黑色素的B16F10黑色素瘤细胞，其产生的黑色素会使培养基变为深棕色或黑色15。原代黑素细胞可能是在研究体内效.......
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披露
作者无任何披露事项需要报告。
致谢
本工作由韩国食品、农业与林业技术规划与评估研究所（IPET）通过农业生物产业技术开发项目资助，该项目由农业、食品与农村事务部（MAFRA）资助（项目编号：116159-02-2-WT011），以及韩国大学BK21 PLUS生命科学与生物技术学院支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3,4-二羟基-L-苯丙氨酸 | Sigma | D9628 | |
| 氢氧化铵溶液 | Sigma | #320145 | |
| 熊果苷 | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| 福尔马林 | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| 氯金酸 | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| 核固红 | Merck | 100121 | 含5%硫酸铝的0.1%核固红溶液 |
| 青霉素-链霉素溶液 | HyClone | SV30010 | |
| 硝酸银 | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| 磷酸二氢钠 (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| 五水硫代硫酸钠 | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| 吐温X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| 蘑菇来源酪氨酸酶 | Sigma | T3824 | 25 KU |
参考文献
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J.
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重印与许可
