体外黑色素减少活性的定量分析

摘要

我们描述了三种在体外评估化学物质脱色素活性的实验方法：1）细胞酪氨酸酶活性的定量，2）黑色素含量的定量，以及3）通过细胞黑色素染色和图像分析来测定黑色素。

摘要

本研究介绍了在体外定量测定脱色素活性的实验室方法。黑色素是黑色素细胞中的主要色素，其合成受到多种细胞和环境因素的调控。黑色素可保护皮肤细胞免受紫外线损伤，同时还具有多种生物物理和生化功能。黑色素在黑色素细胞中过度生成或积聚可导致多种皮肤问题，如雀斑、色素沉着斑、黄褐斑和痣。因此，对于有临床或美容需求的个体，使用脱色素剂调控黑色素生成具有重要意义。黑色素主要在黑色素细胞的黑素体中，通过一个称为黑色素生成的复杂生化过程合成，该过程受到激素、炎症、年龄和紫外线照射等内外因素的影响。本文描述了三种用于测定化学物质或天然物质在黑色素细胞中脱色素活性的方法：1）细胞酪氨酸酶活性测定，2）黑色素含量测定，以及3）通过图像分析对细胞内黑色素进行染色与定量分析。

在黑色素生成过程中，酪氨酸酶催化限速步骤，将L-酪氨酸转化为3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），再进一步转化为多巴醌。因此，抑制酪氨酸酶是减色素形成的主要机制。在培养的黑色素细胞中，可通过添加L-DOPA作为底物，并利用分光光度法测定多巴醌的生成量来定量酪氨酸酶活性。黑色素生成也可通过测定细胞内黑色素含量来评估。含黑色素的细胞组分可用NaOH提取，并通过分光光度法对黑色素进行定量。此外，还可通过Fontana-Masson染色后进行图像分析来定量黑色素含量。尽管这些体外实验的结果未必总能在人体皮肤中重现，但这些方法在黑色素生成研究中被广泛使用，尤其作为筛选潜在减色素活性的初步步骤。这些方法也可用于评估黑色素细胞的活性、生长及分化状态。三种不同方法获得一致的结果可确保所观察效应的有效性。

引言

黑色素在皮肤、眼睛和大脑等多个器官的生理学、病理学及毒理学中发挥着关键作用¹。黑色素的主要功能包括光屏蔽作用和生物化学效应。黑色素可吸收近红外光、可见光以及紫外线（UV）辐射，且对波长较短的光具有更高的吸收率；因此，黑色素能够保护组织免受可见光或紫外线辐射造成的损伤²。黑色素具有抗氧化特性，并能与金属及其他有毒化学物质结合；因此，其可保护组织免受氧化应激和化学应激的损害³。然而，黑色素的过度生成会导致皮肤相关疾病。

皮肤和虹膜中黑色素的数量和质量是决定皮肤和虹膜颜色的最重要因素。不同个体对肤色可能存在不同偏好；一些人偏爱晒黑的肤色，而另一些人则更喜欢较浅的肤色。根据这些消费者特征，已开发出减色素化妆品，以满足不同人群对理想肤色的市场需求⁴。因此，对减色素作用及抗黑色素生成活性的研究在科学和实际应用上均具有重要意义。

黑色素生成是黑色素细胞中通过一系列酶促和非酶促化学反应合成黑色素的复杂过程。一个黑色素细胞周围大约有36个角质形成细胞，黑色素细胞作为黑色素合成的“工厂”，将其产物分配给邻近的角质形成细胞。在皮肤中，黑色素细胞内黑色素体区室中产生并储存的黑色素被转运至表皮中的邻近角质形成细胞。 通过 树突

L-酪氨酸是黑色素生成的初始底物，酪氨酸酶催化两个连续反应，将L-酪氨酸转化为3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA），再转化为多巴醌。这些反应是黑色素生成过程中的限速步骤^5,6。因此，首先可通过直接测定细胞内酪氨酸酶活性来评估去色素活性。具体方法是将含有酪氨酸酶的黑素细胞提取物与DOPA共同孵育，通过分光光度法在475 nm处测定样品中生成的多巴醌。测定值以样品的蛋白浓度进行归一化处理，具有去色素活性的物质与对照组相比，多巴醌的生成量减少。

其次，可通过直接测定培养的黑素细胞中的黑色素含量来量化脱色素活性。用待测物质处理细胞后，在碱性条件下提取黑色素，并在400 nm波长下通过分光光度法测定黑色素含量。具有脱色素作用的试剂会导致黑色素含量低于对照组⁷。

最后，可通过Fontana-Masson黑色素染色及后续图像分析来定量评估色素减退活性。在Fontana-Masson染色中，黑色素颗粒将氨性硝酸银还原为可见的黑色金属状态，显微图像中细胞的黑色区域代表黑色素的含量。

一种美白剂通常在这三种方法中产生一致且可比较的结果，这表明该物质的活性是有效的。此外，检测测试物质对黑色素生成过程中关键基因和蛋白质表达的影响，也有助于评估其美白活性。除了酪氨酸酶外，酪氨酸酶相关蛋白（TRP-1）和多巴色素异构酶（TRP-2）也是黑色素生成过程中的关键酶⁸。转录因子小眼畸形相关转录因子（MITF）是黑色素生成的主要调控因子，通过定量其基因/蛋白质表达水平或进行启动子活性检测，也可用于评估美白活性。

方案

1. 培养基、化合物和试剂的准备

1. 准备B16F10细胞完全培养基。在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（PEST）。
   1. 配制500 mL完全培养基时，将445 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、50 mL FBS和5 mL PEST加入1 L无菌玻璃瓶中。轻轻混匀后，通过0.2 µm瓶顶滤器过滤至新的无菌玻璃瓶中，4 °C保存。
      注意：所有细胞培养操作均应在生物安全柜中采用无菌技术进行，以确保无菌状态。
2. 配制裂解缓冲液：含0.1% Triton X-100（v/v）的20 mM Tris（羟甲基）氨基甲烷缓冲液，pH 7.5（用HCl调节pH）。该缓冲液室温（RT）保存可使用3个月。使用前立即加入蛋白酶抑制剂。
3. 配制酪氨酸酶抑制剂检测缓冲液。分别配制1 M NaH₂PO₄（一碱）和1 M Na₂HPO₄（二碱）储备液。取46.3 mL Na₂HPO₄与53.7 mL NaH₂PO₄混合，得到0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 6.8）。
   1. 用H₂O将上述混合液定容至1 L（终体积）。调节终溶液pH至6.8。该缓冲液4 °C保存可使用1个月。
4. 配制酪氨酸酶底物溶液：将0.1% 3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（DOPA，w/v）溶解于酪氨酸酶抑制剂检测缓冲液中（参见步骤1.3）。
   注意：使用时需置于冰上。
5. 可选，配制100 U/mL蘑菇酪氨酸酶溶液。将冻干的蘑菇酪氨酸酶溶解于酪氨酸酶抑制剂检测缓冲液中。该溶液–20 °C保存可使用2个月。细胞材料存在条件下测定蘑菇酪氨酸酶活性及细胞内酪氨酸酶活性。
   注意：溶液应分装后冷冻，避免反复冻融。使用时保持置于冰上。
6. 配制1 N NaOH溶液。称取4 g NaOH置于容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至100 mL。
7. 配制固定液（10%福尔马林）。将27 mL 37%甲醛与73 mL蒸馏水混合。每日新鲜配制。
8. 配制氨银储备液。在容量瓶中配制5 mL 10%硝酸银溶液。逐滴加入氨水，直至沉淀完全溶解。再加入200 μL 10%硝酸银溶液，溶液将略显浑浊。
   注意：避免接触和吸入。应在通风橱中操作。
9. 配制氨银工作液。将2.5 mL氨银储备液与7.5 mL蒸馏水混合。使用一次后即弃去。
   注意：避免接触和吸入。应在通风橱中操作。
10. 配制0.1%氯金酸溶液。在容量瓶中配制1 mL 10%氯金酸溶液，加入99 mL蒸馏水稀释。每日新鲜配制。
11. 配制磷酸盐缓冲液（PBS）。在800 mL蒸馏水中加入8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄和0.24 g KH₂PO₄。用HCl调节pH至7.4，再用蒸馏水定容至1 L（终体积）。
12. 配制5%（w/v）硫代硫酸钠溶液，溶于蒸馏水中。

2. 细胞培养与处理

1. 使用市售的 B16F10 细胞。将 B16F10 细胞维持在完全培养基中。将细胞培养瓶置于湿度控制、含 5% CO₂ 的培养箱中，于 37 °C 培养。
2. 准备待测化合物、抑制剂阳性对照和阴性对照样品。
   1. 用适当的溶剂溶解待测化合物。水溶性化合物溶于双蒸水；水不溶性化合物溶于适当的有机溶剂，例如，DMSO。
   2. 此处使用溶于双蒸水的熊果苷（125 μg/mL）作为阳性对照，以评估与待测化合物或阴性对照相比的脱色素活性。阴性对照（溶剂处理对照）使用待测样品中所用的溶液或缓冲液，例如，双蒸水、DMSO、乙醇。
3. 细胞接种与处理
   1. 用完全培养基将 B16F10 细胞以每孔 5 × 10⁴ 个细胞的密度接种于 24 孔板中，在 CO₂ 培养箱中培养 24 小时。培养后，吸除完全培养基。
   2. 在 CO₂ 培养箱中，用含有待测化合物、抑制剂对照或阴性对照的 DMEM 培养基（不含 FBS，含 1% 青霉素/链霉素）处理细胞，共培养 72 小时。每隔 24 小时在显微镜下观察细胞状态 。完成此步骤后，进入步骤 3-5 进行后续实验。
      注意：待测物质与 DMEM 培养基的混合液应通过 0.2 μm 滤膜过滤。

3. 细胞酪氨酸酶活性的测定

1. 按照步骤2所述方法，吸除培养基，并用300 μL冷PBS洗涤细胞两次。
2. 将细胞培养板置于冰上，加入300 μL裂解缓冲液，冰上孵育5分钟。然后用细胞刮刀收集细胞裂解物，并转移至1.5 mL微量离心管中。
3. 在冰上使用细胞匀浆器以14,500 rpm匀浆2秒，重复3次，以获得细胞内酪氨酸酶。使用针对该匀浆器优化的最佳条件。
4. 在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，将细胞上清液转移至1.5 mL微量离心管中。使用时保持冰上放置。
5. 取70 μL上清液转移至96孔透明聚苯乙烯微孔板中。
6. 向96孔透明聚苯乙烯微孔板中加入140 μL含有酪氨酸酶底物（DOPA）的溶液，轻轻振荡，于37 °C孵育2小时。
7. 可选：向每孔加入70 μL浓度为100 U/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液，于37 °C孵育2小时。
8. 使用微孔板读板仪在475 nm波长处测定酪氨酸酶活性。
9. 将酪氨酸酶活性根据各样品的蛋白浓度进行归一化处理。通过Bradford法测定各样品的蛋白浓度。

4. 测定黑色素含量

1. 按照步骤2中所述方法，移除培养基，并用300 μL冷PBS洗涤细胞两次。 
2. 将细胞培养板置于冰上，加入300 μL裂解缓冲液，冰上孵育5分钟。然后用细胞刮收集细胞裂解液，并转移至1.5 mL微量离心管中。
3. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心10分钟。
4. 将上清液转移至新管中，并测定总蛋白浓度用于归一化。采用Bradford法测定每个样品的蛋白浓度。
5. 向每个沉淀中加入300 μL 1 N NaOH，60 °C孵育1小时。
6. 将溶解后的溶液在4 °C条件下，以12,000 × g离心10 分钟。
7. 取200 μL上清液转移至96孔微孔板中。
8. 在400 nm波长下测定黑色素含量。
9. 将黑色素含量根据蛋白浓度进行归一化处理。

5. Fontana-Masson 染色

1. Fontana–Masson 染色
   1. 用 300 μL 冷 PBS 将细胞洗涤两次。
   2. 每孔加入 200 μL 10% 甲醛溶液，在 4 °C 下孵育 1 小时。
   3. 用蒸馏水冲洗。
   4. 加入 200 μL 预热的氨性银工作液，在 37 °C 下孵育 1 小时，或直至细胞呈现黄色/棕色。
      注意：将新配制的氨性银工作液置于 58–60 °C 水浴中，充分平衡温度。
   5. 去除氨性银工作液，用蒸馏水冲洗 。
   6. 去除蒸馏水，每孔加入 200 μL 0.1% 氯金酸溶液，在室温下孵育 2 分钟。
   7. 去除 0.1% 氯金酸溶液，用蒸馏水冲洗 。
   8. 去除蒸馏水，每孔加入 200 μL 硫代硫酸钠溶液（5%，w/v），孵育 2 分钟。
   9. 去除硫代硫酸钠溶液，用蒸馏水冲洗。
   10. 去除蒸馏水，每孔加入 200 μL 快速核固红染液，孵育 5 分钟。
   11. 去除快速核固红染液，用自来水冲洗 。
   12. 去除自来水，在显微镜下观察染色后的细胞。
2. Fontana–Masson 染色（基于 ImageJ 的阈值分析）
   注：使用 ImageJ 软件进行图像分析的示例见补充材料。
   1. 打开 ImageJ 程序。
   2. 选择 文件 | 打开 | 显微镜图像。
   3. 选择 图像 | 调整 | 颜色阈值。
   4. 为测量 Fontana–Masson 染色区域，将亮度参数条设置为零，并调节亮度条，直至所有染色细胞（黑色或深棕色）均被包含。
   5. 选择 分析 | 分析颗粒。在“分析颗粒”窗口中勾选“汇总”选项，点击 确定。获取汇总结果并粘贴至电子表格中。
      注：结果框中各参数说明如下：
      切片：每幅图像的名称
      计数：染色细胞数量
      总面积：所计细胞的总面积
      平均大小：总面积/计数
      % 面积：染色面积/总面积 × 100%；总面积由软件自动计算。
   6. 利用“总面积”数值计算黑色素染色的相对面积。
      黑色素染色相对面积（%）= 实验样本的总细胞面积值 / 对照组平均总面积 × 100，即

结果

以下显示了抗黑色素生成化合物熊果苷在B16F10黑色素细胞中脱色素活性的代表性结果。图1A显示，与溶剂对照组相比，熊果苷显著抑制了细胞酪氨酸酶活性。同样，经熊果苷刺激的细胞其黑色素含量也较对照组显著降低（图1B）。图1C展示了经Fontana-Masson染色后的细胞显微图像。与对照组相比，熊果苷处理减少了黑色色素的面积。

图...

讨论

我们介绍了利用培养的黑色素细胞评估受试化合物脱色活性的实验方案。代表性结果展示了熊果苷的脱色效果，该物质是一种酪氨酸酶抑制剂，可抑制酪氨酸酶活性及细胞内黑色素含量。这些方法广泛应用于抗黑色素生成活性的研究。在过去十年中，利用这些检测方法，我们已成功鉴定出多种对B16F10细胞具有抑制黑色素生成作用的生物活性化合物^{9,10,11,12,13,14}。

黑色素由多种色素细胞中的黑色素体产生，包括皮肤中的黑素细胞。在本研究中，我们使用了能够产生黑色素的B16F10黑色素瘤细胞，其产生的黑色素会使培养基变为深棕色或黑色¹⁵。原代黑素细胞可能是在研究体内效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3,4-二羟基-L-苯丙氨酸	Sigma	D9628
氢氧化铵溶液	Sigma	#320145
熊果苷	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
福尔马林	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
氯金酸	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
核固红	Merck	100121	含5%硫酸铝的0.1%核固红溶液
青霉素-链霉素溶液	HyClone	SV30010
硝酸银	Duksan Pure Chemicals	#900
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
磷酸二氢钠 (Na2HPO4)	Sigma	S5011
五水硫代硫酸钠	Duksan Pure Chemicals	#2163
三(羟甲基)氨基甲烷	Bio Basic Canada	TB0196
吐温X-100	Union Carbide	T8787
蘑菇来源酪氨酸酶	Sigma	T3824	25 KU