本文介绍一种通过将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的指数生长曲线拟合至指数生长方程，来评估其呼吸代谢与发酵代谢的实验方案。通过计算动力学参数，可筛选不同物质或化合物对发酵作用或线粒体呼吸的影响。
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摘要
摘要
Saccharomyces cerevisiae 细胞在指数生长期通过发酵和/或线粒体呼吸产生 ATP 来维持其生长。可发酵碳源的浓度主要决定了酵母细胞生成 ATP 的方式；因此，可发酵碳水化合物水平的变化驱动了 S. cerevisiae 的能量代谢。本文介绍了一种基于酵母指数生长的高通量方法，用于评估碳源浓度变化及其性质对呼吸代谢和发酵代谢的影响。通过测定 600 nm 处的光密度（OD），在微孔板或振荡锥形瓶中测量 S. cerevisiae 的生长情况。随后绘制 OD 随时间变化的生长曲线，以识别并选取指数生长期，并利用指数生长方程拟合曲线获得动力学参数。较低的比生长速率和较长的倍增时间通常代表呼吸生长；相反，较高的比生长速率和较短的倍增时间则表明为发酵生长。通过已知的呼吸或发酵条件（例如非发酵性碳源或较高浓度的可发酵糖）估算倍增时间和比生长速率的阈值，该阈值针对每种特定菌株分别确定。最后，将计算得到的动力学参数与阈值进行比较，以判断酵母表现为发酵生长和/或呼吸生长。该方法的优势在于相对简单，可用于理解某种物质或化合物对发酵或呼吸代谢的影响。需要强调的是，生长是一个复杂且精细的生物学过程，因此该方法所得的初步数据必须通过氧气消耗量和发酵副产物积累量的定量分析加以验证。因此，该技术可作为可能干扰或增强发酵或呼吸代谢的化合物/物质的初步筛选手段。
引言
Saccharomyces cerevisiae 的生长被用作鉴定数十种生理和分子机制的重要工具。其生长主要通过三种方法进行测定：用于点种实验的系列稀释法、菌落形成单位计数法以及生长曲线法。这些技术可单独使用，也可结合多种底物、环境条件、突变株和化学物质，以研究特定的生物学响应或表型。
线粒体呼吸是一种生物学过程，其生长动力学已成功应用于发现未知机制。在此情况下，通过在培养基中添加甘油、乳酸或乙醇等非发酵性碳源（这些物质仅通过线粒体呼吸进行代谢）作为唯一的碳源和能源，可以评估呼吸生长情况，这对于检测氧化磷酸化活性的扰动具有重要意义1。另一方面，使用生长动力学模型作为解析发酵机制的方法则较为复杂。
研究发酵作用和线粒体呼吸作用对于阐明某些表型（如 Crabtree 效应和 Warburg 效应）背后的分子机制至关重要2,3。Crabtree 效应的特征是在可发酵碳水化合物浓度较高（>0.8 mM）时，糖酵解通量增加，线粒体呼吸作用受到抑制，并以发酵作为主要的 ATP 生成途径4,5。Warburg 效应在代谢上与 Crabtree 效应类似，不同之处在于哺乳动物细胞中发酵的主要产物是乳酸6。事实上，多种癌细胞均表现出 Warburg 效应，即使在有氧条件下也会触发葡萄糖的摄取和消耗7。因此，研究 Crabtree 效应中从呼吸向发酵转换的分子基础，不仅在生物技术领域（如乙醇生产）具有重要意义，也对癌症研究具有潜在影响。
S. cerevisiae 的生长可能是研究 Crabtree 效应和 Warburg 效应的合适工具。这一观点基于以下事实：在酵母指数生长期，用于产生 ATP 的中心代谢途径是线粒体呼吸和发酵，这两种途径对维持生长至关重要。例如，S. cerevisiae 的生长与其 ATP 生成途径的功能密切相关。在 S. cerevisiae 中，线粒体呼吸每分子葡萄糖大约产生 18 个 ATP 分子，而发酵仅产生 2 个 ATP 分子，因此生长速率与 ATP 生成的代谢途径之间存在紧密关联8。在这方面，当发酵是主要的 ATP 生成途径时，酵母通过提高葡萄糖摄取速率来补偿较低的 ATP 产量。相反，以线粒体呼吸为主要 ATP 来源的酵母细胞对葡萄糖的消耗量较低。这表明，酵母在决定如何生成 ATP 之前，必须感知碳水化合物的可利用性。因此，葡萄糖的可利用性在 S. cerevisiae 中发酵与线粒体呼吸之间的转换过程中起着重要作用。当存在大量葡萄糖时，酵母倾向于将发酵作为生成 ATP 的主要途径。有趣的是，在发酵状态下，酵母的比生长速率保持在最大值。另一方面，在葡萄糖浓度较低的情况下，S. cerevisiae 通过线粒体呼吸产生 ATP，此时生长速率较低。因此，葡萄糖浓度的变化以及其他碳源的利用会诱导酵母在发酵性生长和呼吸性生长之间的偏好发生改变。结合指数生长方程考虑这一现象，可以揭示动力学参数（如倍增时间（Dt）和比生长速率（µ））的生物学意义。例如，当酵母以线粒体呼吸为主要代谢途径时，测得的 µ 值较低；相反，在有利于发酵的条件下，µ 值较高。该方法可用于评估任何化学物质对 S. cerevisiae 发酵和线粒体呼吸可能作用机制的影响。
本文的目的是提出一种基于生长动力学的方法，用于筛选特定物质或化合物对线粒体呼吸或发酵的影响。
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方案
1. 培养基与接种物制备
- 配制100 mL的2%酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）液体培养基（将1 g酵母提取物、2 g酪蛋白胨和2 g葡萄糖加入100 mL蒸馏水中）。将培养基分装至15 mL可灭菌的锥形管中，每管3 mL。在121 °C、1.5 psi条件下高压灭菌15分钟。
注意：培养基可在4–8 °C下保存长达一个月。 - 取250 μL保存于-20 °C甘油中的S. cerevisiae细胞，接种至装有3 mL冷却的无菌2% YPD液体培养基的锥形管中。在30 °C下置于摇床中振荡培养过夜，转速为200 rpm。
- 用无菌接种环将锥形管中培养的细胞在含有无菌2% YPD琼脂的培养皿（60 × 15 mm2）上划线（配制方法：将10 g酵母提取物、20 g酪蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g细菌学琼脂加入1,000 mL蒸馏水中）。将培养皿置于30 °C培养，直至出现单菌落并可见生长。
- 挑取一个单菌落接种至装有10 mL冷却的无菌2% YPD液体培养基的锥形管中，制备预接种培养物，并在30 °C下以200 rpm持续振荡培养过夜。
2. 微孔板中的培养基与生长曲线
- 制备10 mL的1% YPD肉汤（将0.1 g酵母提取物、0.2 g蛋白胨和0.1 g葡萄糖加入10 mL蒸馏水中），10 mL的2% YPD肉汤（将0.1 g酵母提取物、0.2 g蛋白胨和0.2 g葡萄糖加入10 mL蒸馏水中），以及10 mL的10% YPD肉汤（将0.1 g酵母提取物、0.2 g蛋白胨和1 g葡萄糖加入10 mL蒸馏水中）。在121 °C、1.5 psi条件下对这些培养基进行高压灭菌15分钟。
注意：该培养基用于发酵生长的对照。 - 制备10 mL的2%酵母提取物-蛋白胨-乙醇（YPE）肉汤和10 mL的2%酵母提取物-蛋白胨-甘油（YPG）肉汤。对于2% YPE：将0.1 g酵母提取物、0.2 g蛋白胨和0.2 mL乙醇加入10 mL蒸馏水中。对于2% YPG：将0.1 g酵母提取物、0.2 g蛋白胨和0.2 mL甘油加入10 mL蒸馏水中。在121 °C、1.5 psi条件下对这些培养基进行高压灭菌15分钟。
注意：甘油和乙醇为非发酵性碳源，仅通过线粒体呼吸进行代谢。因此，它们被用作呼吸生长的对照。在此步骤中，可基于酵母提取物-蛋白胨（YP）肉汤（在1,000 mL蒸馏水中加入10 g酵母提取物和20 g酪蛋白胨）作为基础，改变培养基中碳源的类型和浓度，以测试其对生长表型的影响。若需测试除碳源外其他营养物质的影响，则根据实验目的向合成完全（SC）培养基中添加相应成分。SC培养基的基础成分为：在1,000 mL蒸馏水中加入1.8 g不含氨基酸的酵母氮源基础、5 g硫酸铵[(NH4)2SO4]、1.4 g磷酸二氢钠（NaH2PO4）和2 g缺失成分混合物。根据需要向培养基中补充碳源和额外的氮源至所需浓度。 - 向带有盖子的无菌微孔板（10 × 10孔）的每个孔中加入145 μL适合实验设计的培养基，并接种5 μL预接种液。
注意：如果实验目的是筛选物质/化合物对酵母能量代谢的影响，应在该步骤中加入该物质/化合物。此外，任何带盖的微孔板均可使用。 - 将微孔板置于微孔板读数仪中，在30 °C、200 rpm持续振荡条件下培养48小时，每隔30或60分钟测定一次600 nm处的光密度（OD）。
注意：如果微孔板读数仪不具备培养功能，则可在每次测定OD之间，将微孔板置于相同条件下（30 °C、200 rpm）的轨道摇床上进行培养。
3. 摇动锥形瓶中的生长曲线
- 向20 mL锥形瓶中加入4.8 mL适宜的培养基并进行高压灭菌。在冷却的无菌2% YPD肉汤中，以OD600nm约2的预接种培养物接种200 μL。于30 °C、250 rpm持续振荡条件下培养24 h。
注意：若培养时间超过24 h，应向50 mL锥形瓶中加入12 mL适宜的培养基并进行高压灭菌，接种500 μL预接种培养物。同时需设置发酵生长对照（含1%、2%或10%葡萄糖的YP培养基）和呼吸生长对照（含2%甘油或乙醇的YP培养基）。 - 取100 μL振荡培养后的锥形瓶培养液，加入900 μL蒸馏水中，在1 mL光谱仪比色皿中通过移液轻轻混匀。每2 h使用分光光度计测定600 nm处的OD值。为获得实际OD值，需将测得结果乘以10。
4. 数据处理与动力学参数计算
- 在统计软件包中创建一个新的项目文件。在该软件的相应部分 "新表格和图表"，选择 "XY" 选项
- 选择选项： "从一个空的数据表开始" 在 "样本数据" 部分
- 选择 "点与连接线" 图表类型。保留 "X" 片段中未选中的部分 "用于重复实验或误差值的子列"，以及在 "Y" 选择选项： "在并列的子列中输入（10）个重复值，并绘制均值与误差标准差（SD）"点击创建按钮。
注意：表格格式包含一列 X 和多个 Y 列，每个 Y 列均包含之前选定的 10 个子列。
- 在X列中记录OD测量的时间例如， 0、30、60、90 分钟或 0、1、1.5、2 小时）。在 Y 列中填写从培养物中获得的 OD 值。
- 确定指数生长期，需将Y列数据转换为对数。点击 "分析" 按钮，选择 "转化" 分析，使用 Y = Log(Y) 选择 Y 值。转到 "结果图集"，选择 "转化" 数据表，单击 "分析" 按钮，然后选择 "线性回归" 分析。排除不呈线性行为的 OD 值。要排除某些数值，请在数据表中选中它们，然后输入 "Ctrl + E".
注意：必须排除不遵循指数期的数据点，因为指数增长方程仅与指数期拟合良好。 - 在 "数据表图集"，选择数据表 "数据 1". 点击 "分析" 按钮并选择 "非线性回归（曲线拟合）分析在 "XY 分析".
- 选择要分析的数据集，然后单击 "好的" 按钮。在 "适合" 标签 选择 "指数方程" 部分并选择 "指数增长方程" （，其中 X 即细胞浓度， X0 为零时的细胞浓度， μ 是比生长速率，以及 t 是时间）。使用 "最小二乘法拟合" 作为合适的拟合方法，并取消选中插值部分。点击 "好的" 按钮
注意：非线性拟合结果的标签位于 "结果图集"软件会计算倍增时间（Dt）和比生长速率（μ）。该软件显示 μ 作为 K 在结果标签页中。 - 新建一个项目文件，并在其中 "新表格和图表" 切片，选择柱状图选项。选择该选项 "从一个空的数据表开始" 并选择所需的图表。选择绘制均值与标准差（SD）。选择 "创建" 按钮
- 复制 μ 或 Dt 来自非线性拟合结果选项卡的数值 "结果图集" 并将其粘贴到一列中。最后，选择 "分析" 按钮并选择所需的分析项目 "柱分析" 用于比较不同营养条件下动力学参数的区段。
注意：通过发酵生长对照（含1%、2%或10%葡萄糖的YP培养基）和呼吸生长对照（含2%甘油或乙醇的YP培养基）获得的动力学参数，可分别用于确定发酵代谢和线粒体呼吸作用的阈值。将待测营养条件及待测物质/化合物所得的动力学参数与呼吸和发酵生长对照进行比较，有助于识别其对呼吸或发酵代谢的潜在影响。
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结果
生长曲线可用于初步区分呼吸型与发酵型表型 S. cerevisiae 酵母。因此，我们进行了批次培养 S. cerevisiae (BY4742) 在已被报道可诱导发酵性生长的不同葡萄糖浓度下：1%、2% 和 10%（w/v）9表现出发酵表型的培养物具有较短的滞后期和较高的指数生长期生长速率（图1）。乙醇、甘油和乳酸是仅能通过呼吸作用代谢的碳源；因此，我们使用这些碳源培养酵母。主要通过氧化磷酸化获取能量的培养物在指数生长期表现出更长的滞后期和较慢的生长速率（图2).
生长曲线分析仅能提供定性信息，因此计算动力学参数以获得定量信息至关重要。我们利用指数生长方程计算了Dt和μ（图...
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讨论
自从 J. Monod10 提出细菌培养生长研究是微生物学的基本方法以来，已经过去很长时间了。分子工具的出现延缓了生长作为一项技术的应用与研究。尽管生长过程涉及大量相互关联的复杂过程，但其基本机制仍可通过数学模型加以描述11。这是一种稳健的方法，可作为辅助工具用于阐明最复杂的分子机制12。
为了从该方法中获得可靠的结果，需考虑以下关键步骤。在低碳源且诱导呼吸生长的条件下，250 rpm 的振荡速度对实现良好的生长至关重要，因为在使用较低振荡速度（150–180 rpm）时，我们在呼吸条件下观察到生长受到抑制。实验应使用新鲜的菌种启动，并且在检测过程中维持一致的表型也至关重要。不同菌株的生长动力学阈值存在差异，必须根据实验所用条件进行验证。推荐使用 GraphPad Prism 软件，因其已预载指数生长方程；但任何其他能够编程实现指数生长方程的软件也同样适用。在微孔板中，建议设置三个不含接种物、仅含 150 μL 培养基的孔——此为空白对照，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目得到了墨西哥国家科学技术委员会（资助号：293940）和TELMEX-TELCEL基金会（资助号：162005585）的资助，两项资助均授予IKOM。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 轨道摇床 | Thermo Scientific | 4353 | 用于接种物培养或锥形瓶培养 |
| Bioscreen | 生长曲线 | C MBR | 用于微孔板中的批量培养 |
| 葡萄糖 | Sigma | G7021 | 用于YPD肉汤的配制 |
| 酪蛋白胨，酶解消化物 | Sigma | 82303 | 用于YPD肉汤的配制 |
| 酵母提取物 | Sigma | 09182-1KG-F | 用于YPD肉汤的配制 |
| 细菌学琼脂 | Sigma | A5306 | 用于YPD琼脂的配制 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 用于SC肉汤的配制 |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 用于SC肉汤的配制 |
| 不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基 | Sigma | Y1251 | 用于SC肉汤的配制 |
| 酵母合成缺陷型培养基补充剂 | Sigma | Y1501 | 用于SC肉汤的配制 |
| 硫酸铵颗粒 | J.T. Baker | 0792-R | 用于培养基添加示例 |
| 白藜芦醇 | Sigma | R5010 | 用于培养基添加示例 |
| 半乳糖 | Sigma | G8270 | 用于培养基添加示例 |
| 蔗糖 | Sigma | S7903 | 用于培养基添加示例 |
| 绝对乙醇 | Merck | 107017 | 用于培养基添加示例 |
| 甘油 | J.T. Baker | 2136-01 | 用于培养基添加示例 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 用于数据分析 | |
| Honeycomb微孔板 | Thermo Scientific | 9502550 | 用于微孔板培养 |
参考文献
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