本实验采用加压热水提取法（PHWE），利用未经改装的家用意式浓缩咖啡机，在实验室中向本科生介绍天然产物化学。实验包括两个部分：从丁香中提取丁子香酚和乙酰丁子香酚，以及从澳大利亚植物Correa reflexa中提取二氢山芹素和(+)-环氧栓果芹素。
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方法文章
在本科实验教学中应用加压热水萃取技术探索天然产物化学
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摘要
摘要
一种新近开发的加压热水提取（PHWE）方法利用未经改装的家用意式浓缩咖啡机促进天然产物研究，该方法也已作为有效的教学工具得到应用。具体而言，该技术已被用于在实验室内向大学二年级和三年级本科生介绍天然产物化学的相关内容。本报告中介绍了两个实验：从丁香中提取丁子香酚和乙酰丁子香酚的PHWE实验，以及从澳大利亚特有植物种类Correa reflexa中提取蛇床素和(+)-环氧栓芹素的PHWE实验。通过在这些实验中采用PHWE技术，二年级本科生从丁香中获得了占其质量4–9% w/w的富含丁子香酚和乙酰丁子香酚的粗提物，而三年级学生从C. reflexa中分别以最高达1.1% w/w和0.9% w/w的产率分离得到了蛇床素和(+)-环氧栓芹素。前者被开发为传统水蒸气蒸馏实验的替代方案，用以介绍提取与分离技术；后者则采用引导式探究教学方法，旨在模拟天然产物生物勘探过程。这主要归因于该PHWE技术相较于传统提取方法更为快速，而传统方法通常难以适应本科生实验课的时间限制。这种快速且实用的PHWE方法可用于高效地从多种植物物种中分离各类有机分子。此前研究也已证实该技术与更传统的提取方法具有互补性。
引言
天然产物的分离与鉴定对科学界乃至整个社会都具有重要意义。1 生物勘探（bioprospecting），即在自然界中寻找有价值的有机分子，仍是发现新药先导化合物和潜在治疗剂不可或缺的过程。据估计，1981年至2014年间获批的小分子药物中，约有75%为天然产物、天然产物衍生化合物或受天然产物启发而设计的化合物。1 此外，天然产物具有巨大的结构和化学多样性。因此，它们也可作为有价值的化学骨架，直接用于有机合成，或用于手性配体和催化剂的开发。2,3
传统上，像浸渍、索氏提取和水蒸气蒸馏等相对耗时的步骤一直是植物次生代谢产物分离研究的主要方法。4 更现代的提取技术，包括加速溶剂萃取，致力于缩短提取时间并建立更环保的实验方案。4,5 2015年，一种新型加压热水提取（PHWE）方法被报道。6 该技术使用未经改装的家用意式浓缩咖啡机，实现了从八角茴香中快速且高效地提取莽草酸。意式浓缩咖啡机专门设计并制造用于从适当研磨的咖啡豆中提取有机分子。为实现这一目的，这些仪器可将水加热至最高96 °C，并在通常为9 bar的压力下运行。7 鉴于此，利用意式浓缩咖啡机从多种植物材料中高效提取天然产物也就不足为奇了。
后续涉及多种陆生植物物种的研究表明，该PHWE技术能够高效提取极性范围相对较广的天然产物。6,8,9,10,11,12,13,14,15 此外，含有某些较敏感官能团的化合物，如醛类、环氧化物、糖苷以及可能具有差向异构化能力的手性中心，在提取过程中通常不受影响。该技术相对于更传统方法的互补性也已得到证实。12,16 此PHWE方法还被用于分离克级数量的天然产物，这些产物已被用于制备新型天然产物衍生物以及更广泛的复杂分子合成。8,11,17
研究发现，这种新的加压热水萃取（PHWE）方法可作为一种有效的教学工具，适用于本科实验教学。这主要得益于该技术相较于传统萃取方法更为快速，而传统方法通常因耗时较长，难以适应本科实验课程的时间限制。因此，该技术已取代了塔斯马尼亚大学以往以水蒸气蒸馏法从丁香中提取丁子香酚的传统本科化学实验。9,18 自此以后，其他多所大学也陆续采用了该实验的若干改进版本，目前悉尼大学的本科化学实验课程中已纳入一项以丁香的加压热水萃取（PHWE）为重点的改进实验（见下文）。
为了展示将这种新型PHWE方法应用于教学的实用性和可行性，本研究提供了两个实验方案。本报告的第一部分介绍了一项从丁香中提取丁子香酚和乙酰丁子香酚的PHWE实验，该实验是悉尼大学本科二年级实验课程的一部分（图1）。该实验旨在向学生介绍天然产物化学，同时培养其基本的实验操作技能。第二部分介绍了一项对澳大利亚特有植物物种Correa reflexa进行PHWE提取的实验，该实验是塔斯马尼亚大学本科三年级实验课程的一部分（图2）。该实验旨在模拟天然产物的生物勘探过程，并强化核心实验技术。11
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方案
注意：建议所有操作均在通风橱中进行。学生在实验室中必须始终佩戴适当的个人防护装备，并在使用每种试剂前查阅相关的安全数据表（SDS）。
1. 丁香的加压热水萃取：丁子香酚和乙酰丁子香酚的分离
- 从丁香中提取丁子香酚和乙酰丁子香酚
- 将粗磨的丁香（12.5 g）放入250 mL烧杯中。
- 将砂糖（12.5 g）加入丁香粉中，充分混合。
- 收集一个手柄滤网（样品室），将整粒丁香与砂子的混合物装入滤网篮中，用压粉锤轻轻压实样品。
注意：切勿过度压缩混合物，否则液体将无法流过。 - 将手柄装入意式咖啡机，并在其下方放置一个洁净的250 mL烧杯。加入30%乙醇/H2如果意式咖啡机的水箱水量不足一半，请向水箱中加入 O 溶液。
- 使用意式咖啡机收集100 mL提取液。
注意：若仪器出现堵塞现象，请咨询指导教师。 - 让冲煮手柄滴完最后一滴后，从意式咖啡机上取下。
警告：研磨部位及周围金属区域将会发热。 - 使用刮刀将粉碗中的咖啡粉残渣刮除，并丢入废物桶中。
- 用 H 冲洗冲煮手柄中的残留固体2在水槽中的水龙头下冲洗，并将其归还供下一位使用者使用。
- 将丁香提取物置于冰浴中冷却，直至温度降至至少30 °C。
- 将提取物放入250 mL分液漏斗中，加入30 mL己烷，轻轻振荡。
- 将分液漏斗置于固定在铁架台上的铁环中，静置使水相和有机相分层，然后将下层水相收集回250 mL烧杯中。
注意：分层可能需要长达10分钟。建议学生在等待首次分层完成的同时，进行薄层色谱的溶剂体系优化（见步骤1.2）。 - 将有机相（上层，含产物）转移至一个洁净的250 mL锥形瓶中，然后将下层水相倒回分液漏斗中。
- 用正己烷（2 × 30 mL）进一步萃取水相两次。
- 每次萃取后，将有机相（上层）合并至同一烧瓶中。
- 第三次液-液萃取后，将合并的有机相倒入分液漏斗中，用 100 mL H2O，通过剧烈振荡。将有机相（上层）收集至一个洁净的250 mL锥形瓶中，并通过加入MgSO₄进行干燥。4 并轻轻旋动烧瓶。
- 将所得混合物通过置于玻璃漏斗中的褶皱滤纸过滤，收集至预先称重的250 mL圆底烧瓶中。
注意：固体残留物（水合 MgSO₄）4) 可丢弃至废弃物中。 - 使用旋转蒸发仪（水浴温度：60 °C，真空压力：350 mbar）将收集的滤液中的溶剂（正己烷）蒸发，然后重新称量含有所得油状物的烧瓶。
- 薄层色谱（TLC）溶剂体系的优化
注意：学生将以小组为单位，由指导教师指定一种溶剂体系，溶剂体系的组成范围为100:0丙酮:环己烷至0:100丙酮:环己烷 以确定能够最大程度分离丁香酚与乙酰丁香酚的最佳比例。- 获取纯丁子香酚和乙酰丁子香酚的薄层色谱参考溶液。
注意：纯丁子香酚和乙酰丁子香酚的薄层色谱（TLC）对照溶液已由实验室技术人员在实验课前配制完毕。 - 在薄层色谱板上标记一个 基线 距底部约1.5 cm处用软铅笔标记，等距标出三个点。
- 使用薄层色谱点样器，在第一泳道点加一滴纯丁香酚薄层色谱对照溶液，第三泳道点加一滴纯乙酰丁香酚薄层色谱对照溶液，第二泳道点加等量的两种对照溶液混合样（共点样）。
- 在TLC观察柜中，使用紫外灯（254 nm）观察TLC板，检测丁香酚和乙酰丁香酚的存在。
注意：薄层色谱（TLC）参考溶液点样处的板上应出现小的（1–2 mm 宽）黑色斑点。若无斑点或斑点较浅，请继续点加相应的 TLC 溶液，直至在紫外光下观察到黑色斑点为止。 - 向一个洁净干燥的薄层色谱罐中加入10 mL指定的溶剂混合物。
注意：确保层析缸中的溶剂高度不超过约1 cm。 - 使用镊子将制备好的薄层色谱板放入薄层色谱展开缸中，盖上盖子。
注意：溶剂液面必须低于薄层色谱板的基线。 - 让溶剂沿薄层色谱板向上展开。当溶剂前沿距板顶端约1 cm时，用镊子将薄层色谱板从展开缸中取出，并用铅笔标记溶剂前沿的位置。
- 让溶剂从薄层色谱板上挥发（约1分钟），然后在紫外灯（254 nm）下观察薄层色谱板。用铅笔圈出在薄层色谱板上观察到的黑色斑点。
- 计算保留因子（Rf通过将丁香酚和乙酰丁香酚的斑点移动距离除以溶剂前沿移动距离，计算其比移值（Rf）。
- 计算 R 之间的差值f 丁香酚和乙酰丁香酚的值（ΔR）f).
- 与班级其他同学分享实验结果。记录其他同学使用不同溶剂比例所获得的保留值。
- 确定最适合分析粗丁香酚溶液及后续纯化步骤的溶剂体系。
注意：最佳的薄层色谱溶剂比例应使丁香酚与乙酰丁香酚之间的分离度最大，以最大的ΔR值表示f 值。如果 ΔRf 以溶剂组成为横坐标作图时，曲线应呈钟形。
- 获取纯丁子香酚和乙酰丁子香酚的薄层色谱参考溶液。
- 丁香酚与乙酰丁香酚的液-液萃取分离
- 将正己烷（10 mL）加入步骤1.1.17所得的含丁香酚粗提物中，混匀后转移至250 mL分液漏斗中。
- 用正己烷（10 mL）冲洗圆底烧瓶，并将冲洗液加入分液漏斗中。
- 用3 M的水相NaOH溶液萃取己烷溶液（2次） 25 mL）通过液-液萃取。每次萃取后收集并合并水相下层液体，置于250 mL锥形瓶中。将有机相收集至50 mL锥形瓶中，并通过加入MgSO₄进行干燥。4 并轻轻旋动烧瓶。
警告：氢氧化钠具有腐蚀性，避免与皮肤接触。
注意：乙酰丁香油酚保留在有机相中，而丁香油酚则存在于碱性水相提取物（下层）中。 - 保留有机层（有机溶液 A），用于后续薄层色谱分析。
- 将步骤1.3.3中得到的碱性水相组分置于锥形瓶中，在冰水浴中搅拌，并缓慢加入10 M的水溶液HCl，直至形成白色乳状液；用移液管吸取一滴溶液滴在刚果红试纸上检测其酸性（试纸应变为蓝色）。
警告：盐酸具有腐蚀性，避免接触皮肤。加入盐酸时可能产生剧烈气泡，应小心缓慢加入，并将锥形瓶置于冰上。
注意：需要 20–30 mL 盐酸（10 M 水溶液）。 - 用250 mL分液漏斗，以正己烷（2 × 30 mL）对乳白色水相乳液进行液-液萃取。在加入正己烷前，确保水相提取物的温度处于室温或更低。将两次正己烷萃取液合并至一个洁净的100 mL锥形瓶中。
注意：丁香酚现位于合并后的有机相（上层）中（有机溶液B）。 - 加入 MgSO₄4 干燥有机相B。
- 使用上一阶段确定的优化薄层色谱溶剂比例，对有机溶液A、有机溶液B、纯丁子香酚薄层色谱对照品及乙酰丁子香酚薄层色谱对照品进行薄层色谱分析。
- 将有机溶液 A 和 B 分别通过褶皱滤纸过滤至不同的容器中 预先称重的250 mL圆底烧瓶。弃去固体残渣（水合MgSO₄）。4) 在废液中。
- 使用旋转蒸发仪从圆底烧瓶中除去溶剂（水浴温度：60 °C，真空压力：350 mbar）。
- 向每份中加入二乙醚（5 mL） 圆底烧瓶，并转移纯化的乙酰丁香酚（有机相 A） 将丁香酚（有机溶液B）通过漏斗加入未标记的预称重小瓶中。
- 用额外的5 mL二乙醚冲洗烧瓶，并将冲洗液转移至小瓶中。使用配备小瓶附件的旋转蒸发仪（水浴温度：50 °C，真空压力：800 mbar）蒸发溶剂。记录产物收率，并正确标记小瓶。
- 使用上一阶段确定的优化后薄层色谱溶剂比例，对有机溶液A、有机溶液B、丁子香酚纯品薄层色谱对照品及乙酰丁子香酚薄层色谱对照品进行薄层色谱分析。
注意：水溶液可直接倒入水槽处理。正己烷和乙醚废液应弃置于非氯化有机废液瓶中。
2. Correa reflexa 的PHWE：分离西塞林和(+)-环氧苏倍罗辛
- 第1次实验：Correa reflexa 的加压热液萃取（PHWE）
- 使用电动香料研磨机研磨 Correa reflexa 叶片（10 g），然后将研磨后的植物材料转移至250 mL烧杯中。
注：研磨时间应为20–30秒。 - 向盛有植物材料的烧杯中加入约2 g粗砂。
- 混合后装入冲煮手柄（portafilter）的滤篮（样品室）中，并用压粉锤将样品压实。
注：样品不可压得过紧。 - 向意式咖啡机的水箱中加入约300 mL的35%乙醇/水（H2O）溶液。
- 将冲煮手柄安装到意式咖啡机上，并在其下方放置一个洁净的250 mL烧杯。
- 收集约100 mL萃取液，等待约1分钟后，再收集另外100 mL。
注意：此时机器和萃取液温度较高。 - 将该混合物置于冰浴中冷却，并使用旋转蒸发仪（水浴温度：约40 °C）蒸发乙醇。
- 将水相萃取液转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯（4 × 50 mL）进行萃取。
注：每次萃取之间可能需要一定时间，以使乳化层充分分离。 - 合并有机相萃取液，加入MgSO4干燥，轻轻旋摇烧瓶，再用烧结玻璃漏斗过滤，最后使用旋转蒸发仪（水浴温度：约35 °C）蒸发溶剂，得到粗提物。
- 获取1H核磁共振（NMR）谱图（如有需要，请向指导教师寻求帮助）。11
- 对粗提物进行薄层色谱（TLC）分析，以确定用于分离所提取化合物的合适溶剂体系。
注：TLC分析参照步骤1.2中所述方法进行。
- 使用电动香料研磨机研磨 Correa reflexa 叶片（10 g），然后将研磨后的植物材料转移至250 mL烧杯中。
- 第2次实验：通过快速柱色谱分离西塞林（seselin）和(+)-环氧苏柏罗辛（(+)-epoxysuberosin）11,19
注：以下实验方案涉及使用快速柱色谱分离有机化合物。请咨询指导教师，学习如何装填快速硅胶柱。- 将色谱柱（直径约30 mm）固定在铁架台的夹子上，并在柱下方放置一个100 mL锥形瓶。
- 向柱内加入硅胶（60 μm快速色谱级），填充至约10 cm高度，然后向柱中加入正己烷（约100 mL）。
- 用玻璃塞封住柱口，将柱从夹子上取下并轻轻摇动，形成匀浆。再将柱放回夹子中，静置使其沉降。
- 打开柱阀，使用连接压缩空气管线的气体适配器将柱内液体排出，直至硅胶床层上方保留约2 mm溶剂。随后取下气体适配器并关闭柱阀。
- 使用锥形瓶中收集的正己烷（约5 mL），配合带有橡胶隔垫的巴斯德移液管，将柱壁上残留的硅胶冲洗至柱内。
- 重复步骤2.2.4，然后在柱顶加入一层薄砂（约1 cm）。
- 向盛有步骤2.1.9所得粗提物的烧瓶中加入二氯甲烷（约1 mL）。使用带有橡胶隔垫的巴斯德移液管，小心地将所得溶液加样至柱上。打开柱阀，使样品吸附于硅胶表面。
- 重复步骤2.2.7两次。
- 小心地向柱中加入正己烷（约20 mL）。重复步骤2.2.4。
- 小心地向柱中加入约180 mL的15%乙酸乙酯/正己烷溶液。打开柱阀，使用连接压缩空气管线的气体适配器将柱内液体排出，直至硅胶床层上方保留约2 mm溶剂，并将洗脱组分收集至10 mL试管中。
注：此步骤可实现西塞林的分离。 - 将含有西塞林的试管组分合并至250 mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪（水浴温度：约35 °C）蒸发溶剂。
注：通过TLC分析确定目标组分，分析方法参照步骤1.2所述。 - 小心地向柱中加入约75 mL的25%乙酸乙酯/正己烷溶液。打开柱阀，使用连接压缩空气管线的气体适配器将柱内液体排出，直至硅胶床层上方保留约2 mm溶剂，并将洗脱组分收集至10 mL试管中。
注：此步骤可实现(+)-环氧苏柏罗辛的分离。 - 将含有(+)-环氧苏柏罗辛的试管组分合并至250 mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪（水浴温度：约35 °C）蒸发溶剂。
注：通过TLC分析确定目标组分，分析方法参照步骤1.2所述。 - 使用核磁共振（NMR）波谱法对分离得到的化合物样品进行分析。11
注：NMR波谱实验由实验室技术人员操作。
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结果
丁香的PHWE。在进行液-液萃取步骤时，学生常常遇到乳化现象（加入饱和食盐水通常无效）。在此阶段，学生被要求让混合液在分液漏斗中静置，同时探究洗脱剂组成对薄层色谱（TLC）分离丁香酚和乙酰丁香酚的影响。需要注意的是，在液-液萃取步骤中，己烷可用庚烷或二氯甲烷替代。9 学生被分配了不同比例的丙酮-环己烷展开剂，并获得丁香酚和乙酰丁香酚的纯品标准样，随后进行TLC分析（图3）。他们的实验结果被汇总在白板上，并通过小组讨论分析溶剂组成对保留因子（Rf）的影响以及最佳展开剂的选择（表1）。学生确定的最佳溶剂组成通常为5-20%丙酮/环己烷，ΔRf在0.1-0.2之间。
在完成薄层色谱（TLC）洗脱剂的优化后，学生们回到丁香酚提取实验中。粗丁香...
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讨论
从丁香中通过水蒸气蒸馏法分离丁香酚的经典实验程序几十年来一直是悉尼大学中级化学实验课程的一部分，但该实验于2016年进行了现代化改进，采用了加压热水萃取（PHWE）方法（图1）9,18。这一改进带来了多项优势。首先，在实验室环境中使用家用意式浓缩咖啡机，通过展示一种非传统、替代性方法来完成经典科学实验，立即引起了学生的浓厚兴趣并增强了他们的参与度。此外，新方法缩短了萃取所需的时间，使得在该实验的新版本中可以引入更多附加实验内容。具体而言，这使得能够加入薄层色谱（TLC）分析，并为高阶学生提供快速柱色谱分析的机会。
本实验以丁香的加压热水萃取（PHWE）为重点，是为大学二年级化学专业本科生设计的入门级实验课程，因此采用了说明式教学方法。9 这种更具指导性、类似食谱式的操作流程，使在有机化学方面经验相对有限的学生也能够高效完成从丁香中提取丁子香酚（eugenol）...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢塔斯马尼亚大学理学院化学系和悉尼大学化学学院提供的经费支持。B.J.D. 和 J.J. 感谢澳大利亚政府提供的研究培训计划奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 意式咖啡机 | Breville/Sunbeam | Breville 意式咖啡机型号 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II | |
| 旋转蒸发仪 | Buchi 和 Heidolph | ||
| 丁香（植物材料） | Dijon Food Pty Ltd | 丁香必须由学生使用食品加工机进行研磨。 | |
| 反折山龙眼（Correa reflexa，植物材料） | 样品采自塔斯马尼亚 | 样品采集自塔斯马尼亚大学Thomas Crawford保护区内的成熟灌木 | |
| 砂子 | Ajax | 1199 | |
| 乙醇 | Redoc Chemicals | E95 F3 | |
| 己烷 | Ajax | 251 | |
| 硫酸镁 | Ajax | 1548 | |
| 乙醚 | Merck | 1009215000 | |
| 硅胶铝薄层色谱板 | Merck | 1055540001 | |
| 丁子香酚 | Merck | 1069620100 | |
| 乙酸丁香酯 | Aldrich | W246905 | |
| 丙酮 | Redox Chemicals | Aceton13 | |
| 环己烷 | ChemSupply | CA019 | |
| 硅胶 60 | Trajan | 5134312 | 40 - 63 µm（230-400目） |
| 刚果红试纸 | ChemSupply | IS070-100S | |
| 32% 盐酸 | Ajax | 256 |
参考文献
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