由腹腔灌洗液中获取的低密度中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网促进肿瘤细胞生长与黏附

摘要

本文介绍了一种方法，即从术后腹腔灌洗液中分离的人类低密度中性粒细胞（LDN）能够大量产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），并有效捕获随后生长的游离肿瘤细胞。

摘要

活化的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），可捕获并杀灭微生物。近期研究表明，NETs 参与多种疾病过程，如自身免疫性疾病、血栓形成及肿瘤转移。本文详细展示了 体外 一种用于检测中性粒细胞胞外诱捕网（NET）在捕获游离肿瘤细胞过程中活性的技术，这些肿瘤细胞在附着于NET后继续生长。首先，我们从接受开腹手术患者的术后腹腔灌洗液中分离低密度中性粒细胞（LDN）。对LDN进行短期培养后，可观察到大量NET形成，通过绿色荧光核及染色体复染可实现可视化。将人胃癌细胞系MKN45、OCUM-1和NUGC-4与NET共孵育后，大量肿瘤细胞被NET捕获。随后，使用DNase I降解NET可完全消除肿瘤细胞的附着。延时录像显示，被NET捕获的肿瘤细胞并未死亡，而是在持续培养中旺盛增殖。该方法可应用于检测NET与多种类型细胞及材料之间的黏附相互作用。 中性粒细胞胞外诱捕网，NET，肿瘤细胞捕获，DNase I，低密度中性粒细胞，腹腔灌洗液，MKN45，OCUM-1，NUGC-4，延时成像，细胞黏附，NET降解

引言

循环血液中的多形核中性粒细胞通常通过密度梯度分离法从单个核细胞中分离出来。然而，某些被称为低密度中性粒细胞（LDN）的中性粒细胞，具有CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)和CD14(-)的表型，会与单个核细胞共同被纯化。在多种病理状态下，LDN的相对数量显著增加，包括自身免疫性疾病^1,2、脓毒症³和癌症^4,5。先前的研究表明，LDN是一类在表型和功能上均不同于常规中性粒细胞的独特细胞亚群⁶。值得注意的是，循环血液中的LDN比正常密度的中性粒细胞更倾向于形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）^2,7。NETs是由核酸、组蛋白、蛋白酶以及颗粒和胞质蛋白组成的网状结构，能够有效捕获并杀灭病原体⁸。

最近研究表明，NETs 不仅能够捕获微生物，还能捕获血小板和循环肿瘤细胞，从而促进血栓形成⁹ 和肿瘤转移^1....

方案

LDN 来源于本研究中入组的患者，并获得了日本 Jichi 医科大学机构审查委员会的批准。

1. 从腹腔灌洗液中分离低密度中性粒细胞（LDN）及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测

1. 样本获取
   1. 在因胃肠道恶性肿瘤接受腹部手术的患者中，于关闭切口前将1,000 mL无菌生理盐水直接灌注至腹腔内。
      注意：样本来自接受胃切除术、结肠切除术或食管切除术的患者，采集时未根据年龄或性别进行偏倚选择。将生理盐水转移至容器后，在一分钟内倾倒至整个腹腔。此操作通常作为术后腹腔冲洗常规进行，对患者无明显影响。
   2. 至少对腹腔进行1分钟的充分灌洗。
      注意：建议外科医生用手缓慢搅动灌注液，以使样本均匀。
   3. 使用四个 50 mL 注射器回收 200 mL 灌洗液。
      注意：有时使用橡胶接头来吸收液体。
2. 使用粒细胞特异性单克隆抗体 CD66b 对腹腔低密度中性粒细胞（LDN）进行纯化¹⁶.
   注意：由于密度梯度离心后中间层含有大量单个核细胞，因此采用CD66b单克隆抗体对多形核中性粒细胞进行阳性筛选。
   1. 将腹腔灌洗液转移至50 mL离心管中。
      注意：在此步骤中，将液体通过100 µm 尼龙滤膜以去除杂质。

结果

在2小时培养中，源自腹腔灌洗液的CD66b(+)低密度中性粒细胞显示出被绿色荧光染料染色的核与染色体的串状结构图1B），而CD66b(-)单核细胞则无此现象（图1C）。然而，当LDN培养物经100 U/mL DNase I预处理后，其特征性结构被破坏（图 1D），表明它们由中性粒细胞释放的细胞外DNA组成。当将低密度中性粒细胞（LDN）培养于未包被的塑料培养板上时，可见大量悬浮于培养基中的NET簇，而底部附着的NET较少。图1E).

接下来，为了检测肿瘤细胞系对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的黏附能力，将用红色荧光染料标记的MKN45细胞加入NETs中，共同孵育5分钟。轻柔洗涤后，发现大量MKN45细胞发生黏附（<.......

讨论

既往研究报道，循环肿瘤细胞可在体内被中性粒细胞胞外诱捕网（NET）基质捕获in vivo^10,11。已有研究表明，转移性乳腺癌细胞可激活中性粒细胞并诱导NET形成，从而促进肿瘤细胞在靶器官中的生长¹⁷。此外，我们发现，来自术后灌洗液的低密度中性粒细胞（LDN）短期培养后可大量产生NETs，且无需额外刺激即可高效捕获肿瘤细胞¹⁵。这些观察结果提示NET在转移过程中可能发挥机械性参与作用。然而，介导NET与肿瘤细胞之间黏附相互作用的具体分子机制仍不明确。近期研究利用活化中性粒细胞来源的NET储备液作为黏附基质，提示整合素可能参与该过程^12,13。但纯化和浓缩的NET组分其分子结构可能与天然NET存在显著差异。相比之下，本方法使用未经物理处理的完整NET，因而在研究NET与细胞间黏附相互作用的详细机.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare，瑞典	17-1440-02
StraightFrom™ 全血 CD66b 微珠	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-104-913
Fc 封闭剂	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-059-901
MACS 洗涤液	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-091-222
MACS BSA 储存液	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-091-376
LS 柱	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-041-306
MACS 磁性分离器	Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-042-501
SYTOX Green 核酸染料（5 mM 溶液，溶于 DMSO）	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	S7020
PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于通用细胞膜标记）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P9691
稀释液 C	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	CGLDIL
RPMI1640 培养基	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	R8758
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基-高糖（DMEM）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	D5796
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	D8537
0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）	nacalai tesque，日本	06894-14
胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准	gibco by life technologies，墨西哥	10437-028
牛血清白蛋白冻干粉，≥96%（琼脂糖凝胶电泳法）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	A2153
青霉素-链霉素	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin 预防性支原体清除剂	InvivoGen，美国加利福尼亚州圣地亚哥	ant-mpp
DNase I	Worthington，美国新泽西州莱克伍德	LS002138
聚-L-赖氨酸包被 6 孔微孔板	IWAKI，日本	4810-040
聚-L-赖氨酸包被 24 孔微孔板	IWAKI，日本	4820-040
荧光体视显微镜	BX8000，Keyence，日本大阪	BZ-X710
全视野活细胞观察系统	Nikon，日本神奈川	BioStudio（BS-M10）
MKN45 人胃癌细胞系	Riken，日本筑波	N/A
NUGC-4 人胃癌细胞系	Riken，日本筑波	N/A
OCUM-1 人胃癌细胞系	日本大阪市立大学	N/A	由 M. Yashiro 博士惠赠