本文介绍了一种方法，即从术后腹腔灌洗液中分离的人类低密度中性粒细胞（LDN）能够大量产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），并有效捕获随后生长的游离肿瘤细胞。
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本文内容
摘要
摘要
活化的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），可捕获并杀灭微生物。近期研究表明，NETs 参与多种疾病过程，如自身免疫性疾病、血栓形成及肿瘤转移。本文详细展示了 体外 一种用于检测中性粒细胞胞外诱捕网（NET）在捕获游离肿瘤细胞过程中活性的技术，这些肿瘤细胞在附着于NET后继续生长。首先，我们从接受开腹手术患者的术后腹腔灌洗液中分离低密度中性粒细胞（LDN）。对LDN进行短期培养后，可观察到大量NET形成，通过绿色荧光核及染色体复染可实现可视化。将人胃癌细胞系MKN45、OCUM-1和NUGC-4与NET共孵育后，大量肿瘤细胞被NET捕获。随后，使用DNase I降解NET可完全消除肿瘤细胞的附着。延时录像显示，被NET捕获的肿瘤细胞并未死亡，而是在持续培养中旺盛增殖。该方法可应用于检测NET与多种类型细胞及材料之间的黏附相互作用。 中性粒细胞胞外诱捕网，NET，肿瘤细胞捕获，DNase I，低密度中性粒细胞，腹腔灌洗液，MKN45，OCUM-1，NUGC-4，延时成像，细胞黏附，NET降解
引言
循环血液中的多形核中性粒细胞通常通过密度梯度分离法从单个核细胞中分离出来。然而，某些被称为低密度中性粒细胞（LDN）的中性粒细胞，具有CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)和CD14(-)的表型，会与单个核细胞共同被纯化。在多种病理状态下，LDN的相对数量显著增加，包括自身免疫性疾病1,2、脓毒症3和癌症4,5。先前的研究表明，LDN是一类在表型和功能上均不同于常规中性粒细胞的独特细胞亚群6。值得注意的是，循环血液中的LDN比正常密度的中性粒细胞更倾向于形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）2,7。NETs是由核酸、组蛋白、蛋白酶以及颗粒和胞质蛋白组成的网状结构，能够有效捕获并杀灭病原体8。
最近研究表明，NETs 不仅能够捕获微生物，还能捕获血小板和循环肿瘤细胞，从而促进血栓形成9 和肿瘤转移10,11然而，NETs与血小板或肿瘤细胞之间黏附相互作用的分子机制仍不明确。最近，一项 体外 黏附实验表明，髓系白血病细胞（K56212）和肺癌细胞（A54913通过 β1 和 β3 整合素与 NETs 结合。作者使用从中性粒细胞分离并经佛波酯 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯（PMA）激活的 NET 原液作为黏附底物14尽管该检测方法能够在无中性粒细胞的情况下检测到与NET组分的真实相互作用，但其是否能够 "无细胞NET储备液" 通过高速离心分离获得的物质保持了与产生的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）相同的分子结构 体内最近，我们发现腹部手术后的腹腔灌洗液中含有大量成熟的低密度中性粒细胞（LDN），这些细胞可产生大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），并附着于肿瘤细胞，导致腹膜转移15在本研究中，我们成功地在未进行任何物理操作的情况下检测了肿瘤细胞与完整中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的黏附。本文展示了检测NETs与游离肿瘤细胞之间黏附相互作用的技术细节。
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方案
LDN 来源于本研究中入组的患者，并获得了日本 Jichi 医科大学机构审查委员会的批准。
1. 从腹腔灌洗液中分离低密度中性粒细胞（LDN）及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测
- 样本获取
- 在因胃肠道恶性肿瘤接受腹部手术的患者中，于关闭切口前将1,000 mL无菌生理盐水直接灌注至腹腔内。
注意：样本来自接受胃切除术、结肠切除术或食管切除术的患者，采集时未根据年龄或性别进行偏倚选择。将生理盐水转移至容器后，在一分钟内倾倒至整个腹腔。此操作通常作为术后腹腔冲洗常规进行，对患者无明显影响。 - 至少对腹腔进行1分钟的充分灌洗。
注意：建议外科医生用手缓慢搅动灌注液，以使样本均匀。 - 使用四个 50 mL 注射器回收 200 mL 灌洗液。
注意：有时使用橡胶接头来吸收液体。
- 在因胃肠道恶性肿瘤接受腹部手术的患者中，于关闭切口前将1,000 mL无菌生理盐水直接灌注至腹腔内。
- 使用粒细胞特异性单克隆抗体 CD66b 对腹腔低密度中性粒细胞（LDN）进行纯化16.
注意：由于密度梯度离心后中间层含有大量单个核细胞，因此采用CD66b单克隆抗体对多形核中性粒细胞进行阳性筛选。- 将腹腔灌洗液转移至50 mL离心管中。
注意：在此步骤中，将液体通过100 µm 尼龙滤膜以去除杂质。 - 在室温下以270 × g离心腹膜液7分钟。
- 将沉淀重悬于5 mL含0.02% EDTA的PBS中。
- 将5 mL细胞悬液小心地覆盖在3 mL密度梯度溶液上。
- 在室温下以 1,700 x g 离心 15 分钟，期间不暂停。
- 收集含有中间层的约 2–3 mL 溶液（图1A用移液管吸取并加入10 mL含0.02% EDTA的PBS中混匀。
- 在室温下以 400 x g 离心腹膜液 7 分钟，并弃去上清液。
- 加入10 mL含0.02% EDTA的PBS，室温下以270 × g离心7分钟。弃去上清液。
- 溶解细胞沉淀（1 × 10⁶ 细胞）7）在 60 µ磁性细胞分离试剂盒用缓冲液 L
- 加入20 µ加入1 L Fc封闭液至沉淀物中，4℃孵育10分钟 °C.
- 加入20 µL 的与微珠偶联的抗 CD66b 抗体，4 ℃下再孵育 10 分钟 °C.
- 用500 μL的溶液洗涤并重悬沉淀 µL MACS缓冲液
- 将细胞悬液加入置于合适磁性分离器磁场中的磁性柱，用15 mL缓冲液洗涤柱子，收集流出液，其中含有CD66b(-)细胞。
- 从磁性分离器上取下色谱柱，并立即通过用力推动柱塞将磁性标记的CD66b(+)细胞从柱中冲洗出来。
注意：CD66b(+) 细胞群体主要由中性粒细胞组成，经FACS分析证实 >CD66(+) 细胞群中95%为CD11b、CD15和CD16阳性，但CD14阴性。
- 将腹腔灌洗液转移至50 mL离心管中。
- NETs 的生成
- 在室温下以 270 x g 离心 7 分钟后，重悬分离的 LDN（5 x 10⁶）6) 加入1 mL含10% FCS的RPMI1640培养基中。
- 将低密度中性粒细胞接种于6孔聚-L-赖氨酸包被的培养板（直径6 cm）中，在37℃培养2 h ˚5% CO₂ 中的 C2.
- 加入绿色荧光复染剂（一种用于染色细胞核和染色体的膜非渗透性染料），终浓度为 5 µM.
- 立即在荧光显微镜下观察 NETs 的形态（LDN 释放的细胞外 DNA 成分）。
2. 使用红色荧光细胞连接染料标记肿瘤细胞
- 准备人源癌细胞系 MKN45、NUGC 和 OCUM-1。
- 在 15 mL 离心管中用含 0.02% EDTA 的 PBS 洗涤 1 × 107 个细胞，并在室温下以 270 × g 离心 7 分钟。
- 向细胞沉淀中加入 1 mL 染色液，轻轻吹打混匀。
- 将 4 µL 红色荧光细胞连接染料溶解于 1 mL 染色液中，与步骤 2.2 的细胞悬液混合。
- 在室温下孵育 4 分钟。
- 加入 4 mL DMEM（含 10% FBS）以终止染色反应。
- 以 270 × g 离心 7 分钟，弃去上清液。
- 重复步骤 2.6 和 2.7 两次。
- 在荧光显微镜下（激发波长 = 551 nm，发射波长 = 567 nm）检查肿瘤细胞是否被染成红色。
3. 肿瘤细胞与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）黏附的分析
- 将红色荧光标记的肿瘤细胞（1 × 106）重悬于 1 mL 含 0.1% BSA 的 RPMI 1640 培养基中。
- 将肿瘤细胞加入由步骤 1.3 所述方法产生 NETs 的低密度中性粒细胞（LDN）培养物中。
- 在 37 ˚C 下孵育 5 分钟，使肿瘤细胞与 NETs 接触。
注意：长时间孵育会导致肿瘤细胞黏附于 LDN 或培养板上。 - 移除培养基，加入 2 mL 预热的培养液（0.1% BSA + RPMI 1640），轻轻晃动培养皿，温和洗涤各孔。
- 重复步骤 3.4 的洗涤操作两次。
注意：由于 NETs 与培养板的结合较弱，洗涤时应尽可能轻柔，以避免将 NETs 本身洗脱。 - 加入终浓度为 5 µg/mL 的绿色荧光染料，对细胞核和染色体进行染色，以便观察 NETs。
- 使用适当的滤光片观察 NETs 及其黏附的肿瘤细胞（绿色：激发波长 = 504 nm，发射波长 = 523 nm；红色：激发波长 = 551 nm，发射波长 = 567 nm）。
- 合并图像，以显示被 NETs 捕获的肿瘤细胞。
注意：在部分实验中，在共孵育前 5 分钟向 LDN 培养物中加入 DNA 降解酶（终浓度为 100 U/mL），孵育 5 分钟。
4. 被捕获肿瘤细胞的延时视频分析
- 按照步骤1.3所述，将腹腔低密度中性粒细胞（LDN）培养于经多聚-L-赖氨酸包被的35 mm圆形培养皿中。
- 按照步骤1.3所述，加入绿色荧光染料对细胞核和染色体进行染色，以可视化中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。
- 孵育1分钟后，移除培养基，并加入2 mL含0.1% BSA的RPMI 1640培养基。
- 移除培养基，加入未染色的1 × 106 MKN45细胞，细胞悬浮于含0.1% BSA的RPMI 1640培养基中，在室温下孵育5分钟。
- 按照步骤3.4所述，通过轻柔洗涤去除未贴附的肿瘤细胞，然后加入含10%胎牛血清（FCS）并补充100 u/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基。
- 将培养皿安装于全视野细胞观察系统中，选择肿瘤细胞被NETs捕获的合适视野。
- 继续共培养额外2天，并在白光和荧光条件下每6分钟连续拍摄该视野的图像，分别用于检测MKN45细胞和NETs。
- 对每个时间点的图像进行叠加，并使用Image Viewer软件构建延时视频。
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结果
在2小时培养中，源自腹腔灌洗液的CD66b(+)低密度中性粒细胞显示出被绿色荧光染料染色的核与染色体的串状结构图1B），而CD66b(-)单核细胞则无此现象（图1C）。然而，当LDN培养物经100 U/mL DNase I预处理后，其特征性结构被破坏（图 1D），表明它们由中性粒细胞释放的细胞外DNA组成。当将低密度中性粒细胞（LDN）培养于未包被的塑料培养板上时，可见大量悬浮于培养基中的NET簇，而底部附着的NET较少。图1E).
接下来，为了检测肿瘤细胞系对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的黏附能力，将用红色荧光染料标记的MKN45细胞加入NETs中，共同孵育5分钟。轻柔洗涤后，发现大量MKN45细胞发生黏附（<...
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讨论
既往研究报道，循环肿瘤细胞可在体内被中性粒细胞胞外诱捕网（NET）基质捕获in vivo10,11。已有研究表明，转移性乳腺癌细胞可激活中性粒细胞并诱导NET形成，从而促进肿瘤细胞在靶器官中的生长17。此外，我们发现，来自术后灌洗液的低密度中性粒细胞（LDN）短期培养后可大量产生NETs，且无需额外刺激即可高效捕获肿瘤细胞15。这些观察结果提示NET在转移过程中可能发挥机械性参与作用。然而，介导NET与肿瘤细胞之间黏附相互作用的具体分子机制仍不明确。近期研究利用活化中性粒细胞来源的NET储备液作为黏附基质，提示整合素可能参与该过程12,13。但纯化和浓缩的NET组分其分子结构可能与天然NET存在显著差异。相比之下，本方法使用未经物理处理的完整NET，因而在研究NET与细胞间黏附相互作用的详细机...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢清水女士和新田女士在技术与文书工作方面的协助。 同时感谢松本史郎博士、原田英德博士、仓坂健太郎博士和高桥一也博士在手术室样本采集过程中提供的合作与支持。 本研究由日本文部科学省、日本学术振兴会科学研究费补助金（17K10606）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare，瑞典 | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ 全血 CD66b 微珠 | Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-104-913 | |
| Fc 封闭剂 | Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-059-901 | |
| MACS 洗涤液 | Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-091-222 | |
| MACS BSA 储存液 | Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-091-376 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-041-306 | |
| MACS 磁性分离器 | Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫 | 130-042-501 | |
| SYTOX Green 核酸染料（5 mM 溶液，溶于 DMSO） | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | S7020 | |
| PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于通用细胞膜标记） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | P9691 | |
| 稀释液 C | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | CGLDIL | |
| RPMI1640 培养基 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | R8758 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基-高糖（DMEM） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D5796 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲盐水（DPBS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D8537 | |
| 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） | nacalai tesque，日本 | 06894-14 | |
| 胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准 | gibco by life technologies，墨西哥 | 10437-028 | |
| 牛血清白蛋白冻干粉，≥96%（琼脂糖凝胶电泳法） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | A2153 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin 预防性支原体清除剂 | InvivoGen，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington，美国新泽西州莱克伍德 | LS002138 | |
| 聚-L-赖氨酸包被 6 孔微孔板 | IWAKI，日本 | 4810-040 | |
| 聚-L-赖氨酸包被 24 孔微孔板 | IWAKI，日本 | 4820-040 | |
| 荧光体视显微镜 | BX8000，Keyence，日本大阪 | BZ-X710 | |
| 全视野活细胞观察系统 | Nikon，日本神奈川 | BioStudio（BS-M10） | |
| MKN45 人胃癌细胞系 | Riken，日本筑波 | N/A | |
| NUGC-4 人胃癌细胞系 | Riken，日本筑波 | N/A | |
| OCUM-1 人胃癌细胞系 | 日本大阪市立大学 | N/A | 由 M. Yashiro 博士惠赠 |
参考文献
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