本文描述了一种在无血清条件下长期培养牛颗粒细胞的模型。该模型可使研究人员研究不同铺板密度等多种因素和条件对产雌激素的牛颗粒细胞特性的影响。
本文内容
摘要
摘要
卵巢颗粒细胞（GC）是雌二醇合成的主要来源。在排卵前黄体生成素（LH）激增的诱导下，卵泡膜细胞特别是颗粒细胞层的细胞发生显著的形态学、生理学和分子特征改变，形成可产生孕酮的黄体，后者在维持妊娠中起关键作用。细胞培养模型是研究卵泡-黄体转化过程中相关调控机制的重要工具。本实验方案重点介绍从小到中等大小卵泡（< 6 mm）中分离牛颗粒细胞并进行冷冻保存的操作步骤。利用该技术可获得近乎纯化的颗粒细胞群体。冷冻保存程序显著提高了细胞培养工作的时程管理灵活性，无需依赖即时的原代组织（卵巢）供应。本方案描述了一种无血清的细胞培养模型，可模拟牛颗粒细胞的雌二醇活性状态。文中详细讨论了实现类固醇激素活性细胞培养所必需的关键条件。结果表明，提高细胞接种密度可诱导特异性反应，表现为基因表达谱的改变和激素分泌水平的变化。此外，该模型为深入研究颗粒细胞分化及其他相关应用提供了基础。
引言
成功的排卵和黄体化依赖于不同体性卵泡细胞类型中精细调控且高度协调的分子改变。由于这些发育过程的细节尚未完全阐明，仍需进一步研究加以明确。 体内 方法复杂且成本高昂，尤其无法阐明卵泡发生过程中发生的特定分子机制。因此，还原性 体外 此外，还需要模型以深入了解细胞和分子层面的细节。不同研究描述了在以下情境中对完整卵泡进行培养的方法 体外 授精技术1,2,3由于研究人员关注分化机制，许多研究集中于卵泡颗粒细胞（GC）。这些细胞与卵母细胞直接相关，是雌激素生成的主要来源，因此在卵泡发生和黄体化过程中发挥着至关重要的作用4.
已从不同物种建立了胃癌（GC）的永生化细胞系。然而，其中大多数细胞系并未表现出足够的类固醇激素分泌能力5迄今为止，仅建立了一株牛颗粒细胞系6，但该细胞系在多次传代后失去了类固醇生成活性7因此，由于类固醇生成，特别是雌二醇的产生，是颗粒细胞功能的关键特征，建议在原代细胞培养模型中研究这些方面。既往研究表明，只有在无血清培养条件下才能观察到显著的雌二醇生成8,9此外，补充雌二醇合成的前体物质是另一个必要条件，因为颗粒细胞无法表达将孕酮转化为雄烯二酮所需的酶。10此外，FSH 和 IGF-1 补充的协同作用 体外 显示芳香化酶（aromatase）活性得到优化，该酶是雌二醇合成的关键酶11在本实验方案中，还描述了其他对颗粒细胞培养模型具有显著影响的重要因素。特别是，细胞接种密度对实验结果具有巨大影响。12此外，可建立一种对牛颗粒细胞（GC）生理特性在培养过程中无显著干扰的冷冻保存技术。该技术有助于优化细胞培养工作的安排，并确定理想的接种密度。
方案
注意：牛卵巢取自商业屠宰场。根据德国法律，屠宰副产品的收集无需伦理审批。
1. 工作条件与准备工作
- 为确保无菌，所有培养基和组织制备以及所有培养操作均需在专用的细胞培养实验室中使用层流台进行。
- 准备含有100 IU青霉素、0.1 mg/mL链霉素和0.5 µg/µL两性霉素的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），用于卵巢的运输。
注意：在此条件下，从收到卵巢到分离颗粒细胞（GC）的最长时间为2小时。
2. 牛颗粒细胞的分离
- 在开始分离操作前，用1×PBS（含100 IU青霉素、0.1 mg/mL链霉素和0.5 µg/µL两性霉素）反复冲洗卵巢数次，以去除表面残留的血液。使用烧杯，将卵巢放入其中，加入1×PBS，然后弃去PBS。
- 重复此洗涤步骤3–4次，直至卵巢表面无残留血液。
- 用浸有70%酒精的实验室擦拭纸擦拭一个卵巢，以尽量减少可能的污染。
- 使用3 mL注射器和18 G针头，穿刺小至中等大小的卵泡（<6 mm，用尺子测量），吸取颗粒细胞（GC），并将卵泡液收集至一个50 mL离心管中。
注意：为润湿注射器，可吸入少量1×PBS（含100 IU青霉素、0.1 mg/mL链霉素和0.5 µg/µL两性霉素）。这有助于收集少量卵泡液，并防止细胞黏附在注射器内部。 - 穿刺多个卵泡后，用1×PBS冲洗注射器和针头，进行中间清洁。
3. 细胞的冷冻保存
- 使用台盼蓝染色法并在血细胞计数板下计数细胞。
- 为计数活细胞数量，准备一个含有1.5 µL 0.25%台盼蓝溶液的离心管。
注意：活细胞不会被染色，因为台盼蓝只能进入死细胞的细胞膜，从而使死细胞呈现蓝色。 - 向台盼蓝溶液中加入15 µL颗粒细胞悬液，并轻轻混匀。
- 将混合液加入血细胞计数板的两个计数室中。在每个计数室的一个大方格内计数活细胞（例如，未染色）的数量。
注意：尽管可能观察到一些血细胞，但可通过其极小的尺寸加以区分。 - 根据通用指南，以两个计数室大方格的平均值计算活细胞数量；不同卵巢来源的活细胞比例可能有所差异，但应超过60%13。
- 为计数活细胞数量，准备一个含有1.5 µL 0.25%台盼蓝溶液的离心管。
- 从新分离的颗粒细胞群体中取样作为后续分析的参考样本。
- 根据分离所得GC的细胞数量，保留适量细胞作为RNA、DNA或蛋白质制备的参考样本。
注意：对于RNA提取及后续基因表达分析，1 × 105个细胞已足够，而其他分析可能需要不同且通常更高的细胞数量。 - 将一份或多份参考细胞分装至新的离心管中，在室温下以最大速度（12,000 × g）离心1分钟，以获得细胞沉淀。弃去上清液。
- 立即用液氮对样本进行速冻，并于-80 °C保存。
- 根据分离所得GC的细胞数量，保留适量细胞作为RNA、DNA或蛋白质制备的参考样本。
- 按以下步骤进行冷冻保存。
- 使用80%胎牛血清（FCS）和20%二甲基亚砜（DMSO）配制冷冻保存液。
- 为轻柔地沉淀GC，将GC在室温下以500 × g离心3分钟。
- 小心去除上清液，并用100% FCS（例如，1 mL）重悬细胞，直至无可见细胞团块。
- 向细胞悬液中加入等体积的预冷保存液（例如，1 mL），并将混合液转移至冻存管中。
注意：最终冷冻保护液的组成为90% FCS和10% DMSO。 - 将冻存管放入专用的（市售）程序降温盒中，以防止快速冷冻。样品的降温速率不应超过-1 °C/min。将降温盒置于-80 °C冰箱中至少4小时。
- 如需长期保存，将冻存管转移至超低温储存容器中（例如，液氮气相储存罐）。
注意：此步骤可作为暂停点，因冷冻保存可实现长期存储。
4. 细胞培养用培养基和培养板的制备
- 用0.02%胶原蛋白R包被细胞培养板。
注：已知胶原蛋白R对提高颗粒细胞（GC）在培养中的贴壁效果至关重要。- 使用适用于细胞培养的纯化水配制0.02%胶原蛋白R溶液。
- 在24孔板中每孔加入150 µL（= 2 cm2/孔），确保胶原蛋白R溶液完全覆盖培养孔的整个表面。
- 在超净台中敞盖干燥数小时或过夜。
- 当培养板完全干燥后，用紫外光照射10–15分钟，以减少污染风险。
- 如有需要，可将培养板在4 °C保存最多2个月。
- 在超净台中准备培养所需的培养基和添加剂。为了成功复苏颗粒细胞（GC），必须在解冻后立即进行处理。
- 配制以下培养基。
- 在α-最低必需培养基（α-MEM）中添加2 mM L-谷氨酰胺、0.084%碳酸氢钠、0.1%牛血清白蛋白（BSA）、20 mM HEPES、4 ng/mL亚硒酸钠、5 µg/mL转铁蛋白、10 ng/mL胰岛素和1 mM非必需氨基酸。
- 此外，在培养基中加入100 IU青霉素和0.1 mg/mL链霉素。
注：抗生素在预热后约可稳定48小时。因此，应根据培养设置和计划的换液量分装所需培养基。仅将分装的培养基在水浴中预热至37 °C。配制好的培养基在4 °C保存不得超过3个月。 - 为诱导培养的牛颗粒细胞（GC）类固醇活性，需在α-MEM中额外添加20 ng/mL促卵泡激素（FSH）、50 ng/mL R3 IGF-1和2 µM雄烯二酮。
注：这些成分应在开始培养或换液前立即添加。避免对FSH和IGF-1储备液进行反复冻融，以免影响类固醇活性。
5. 细胞培养操作
- 将细胞在37 °C水浴中快速解冻3–4分钟，然后将细胞悬液转移至37 °C预热的α-MEM培养基（不含激素补充物）中。离心时建议终体积为10 mL。
- 将GC在室温下以500 × g离心3分钟 g弃去上清液。加入预热并补充完全的α-MEM培养基，轻轻重悬细胞。
- 以 1 x 10 的密度接种 GC5 或 1 × 106 每孔细胞数为500 µL终体积。每种条件至少设置三个培养孔的技术重复。
- 将细胞培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2 8天。
- 每隔一天更换一次培养基。仅替换三分之二的培养基，以减少细胞应激，并促进细胞对新鲜培养基的适应。
注意：颗粒细胞在培养数天后会形成典型的成纤维细胞样表型，并倾向于聚集在一起。在高细胞密度培养中，与正常密度的颗粒细胞培养相比，更常观察到较大的细胞簇。图1，左侧 与 右侧面板）。
6. 培养的颗粒细胞的后续分析
- 进行类固醇激素分析时，收集培养基并将其在 -20 °C 冻存。采用适当方法分析用过的培养基中雌二醇和孕酮的浓度[例如， 放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）14.
- 针对不同靶分子（RNA、DNA、蛋白质）的后续分析 等等。)，直接在培养皿中加入供应商推荐的适当裂解试剂裂解细胞。
注意：对于大多数分离步骤，可在本步骤暂停实验流程，因为裂解后的细胞可在 -20 °C 下保存长达 1 周。如需更长时间保存，应将细胞置于 -80 °C。 - 为确定转录本丰度，合成cDNA并利用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）技术检测特定转录本15统计学评估应包含至少三次来自不同细胞制备物的不同细胞培养样本（生物学重复）。
结果
以每孔1 × 105个细胞的密度接种的颗粒细胞（GC）呈现出典型的成纤维细胞样形态，其细胞突起与成纤维细胞相似，并倾向于形成细胞簇（图1a 和 1c）。将接种密度提高10倍至每孔1 × 106个细胞时，细胞形态未发生改变，但可观察到更多的细胞簇（图1b 和 1d，箭头所示）。如先前发表的研究所示，培养皿的胶原涂层显著改善了细胞的贴壁能力13。
与直接从新鲜分离样本培养的细胞相比，初始冷冻保存对培养细胞的生理特性没有显著影响。如图2所示，在比较来自冷冻或新鲜分离样本池的培养细胞时，多个标记基因的转录本丰度（通过qPCR测定）并无差异。
图3 显示了在正常条件下培养的牛颗粒细胞（GC）中类固醇激素分析（通过放射免疫测定法，RIA）的代表性结果 与 高密度。与正常密度培养相比，高密度培养中的雌二醇浓度显著降低，而孕酮的生成有升高趋势。
通过qPCR测量的多个基因的比较分析 与 正常密度培养显示显著效应（图4). CYP19A1，编码雌二醇生物合成关键酶芳香化酶的基因，以及促性腺激素受体 FSHR显著下调。相比之下，这些基因 RGS2 和 VNN2 显示出显著上调。这些结果明确表明，增加细胞接种密度可诱导特定的细胞分化过程。
图1：正常密度（左图）和高密度（右图）培养的牛颗粒细胞。（a 和 c）以 1 × 105 个细胞/孔的密度培养的细胞表现出典型的成纤维细胞样表型。（b 和 d）与正常密度培养的细胞（左图）相比，高接种密度（1 × 106 个细胞/孔）培养的颗粒细胞（GC）更频繁地形成大的细胞簇（箭头）。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：分离后直接培养细胞与冻存后培养细胞的比较。 细胞以每孔 1 × 105 个细胞的密度进行培养。检测了多个标志物转录本的基因表达水平，结果显示经过或未经过初始冻存的培养细胞之间无显著差异。箱线图显示了 n = 3 的中位数。采用双尾 Student's t 检验，p 值已标出。本图引自 Baufeld 和 Vanselow16。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：不同接种密度下培养的颗粒细胞中类固醇激素浓度 雌二醇（E2）浓度在颗粒细胞高密度培养时显著降低，而孕酮（P4）浓度仅呈升高趋势。激素浓度根据DNA含量进行校正，以消除细胞数量差异的影响。均值与标准误（SEM）为 n = 3 的样本显示如下。 p > 0.05，双尾t检验 t-测试。该图改编自 Baufeld 等15. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：正常条件下培养的颗粒细胞中功能关键转录本的丰度 与 高接种密度 无血清条件下培养8天的牛颗粒细胞显示出多种选定标志基因的特异性调控。箱线图显示了中位数 n = 3 次独立重复实验。 p < 0.05，双尾t检验 t-测试。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
所提供的细胞培养模型为分析颗粒细胞分化提供了一种工具 体外多项研究表明，无血清培养是维持培养的牛颗粒细胞或其他物种颗粒细胞类固醇活性的前提条件8,9此外，用细胞外基质成分包被培养皿例如胶原蛋白 R13，显著改善了细胞的贴壁情况。另一个重要特征是延长的培养周期。最近研究表明，需要进行长期培养才能获得足够的类固醇生成活性以及颗粒细胞身份标志物的平衡表达17似乎GC需要一定时间来恢复在分离过程中所受到的生理应激。
培养颗粒细胞（GC）时，添加FSH、IGF-1和雄烯二酮可诱导芳香化酶活性。尤其是雄烯二酮的添加至关重要，因为颗粒细胞需要其作为雌二醇合成的前体。该结论已有文献报道11,18，因此本研究未对此进一步探讨。然而，对于其他实验设计，可能需要调整FSH、IGF-1和雄烯二酮的浓度。
本文所述的冷冻保存技术可通过减少对卵巢供应波动的依赖，有助于更好地组织安排组织培养实验。根据先前的测试，冷冻保存不会影响颗粒细胞（GC）的表型或在培养中的类固醇生成能力。此外，培养细胞中标志物转录本的丰度在来自新鲜分离细胞的样本与经过冷冻保存处理的样本之间相比，未显示出显著差异16。
当前GC培养模型的一个关键参数是细胞接种密度。如图所示， 代表性结果，增加铺板密度会显著改变细胞的生理和分子特征。多个基因以特定方式受到调控，类似于黄体生成素（LH）刺激所诱导的变化 体内4,19细胞密度增加可诱导培养的牛颗粒细胞发生类似分化的过程，这一点在本研究的颗粒细胞实验中必须审慎考虑。 体外 为避免重复实验之间出现矛盾结果，应建立模型。因此，与其他研究结果的矛盾可能源于细胞密度的差异，需进一步仔细分析。
此处描述的培养模型对黄体生成素（LH）无反应性，因为受体的转录本 LHCGR 接近检测限。因此，需模拟黄体生成素（LH）激增，类似 体内 该情况未能诱导分化13尽管如此，该模型为在原代培养中研究雌二醇活性的颗粒细胞提供了有用的工具，特别是目前尚无功能性的牛颗粒细胞系存在。
在当前的颗粒细胞（GC）培养模型中，可以测试不同的处理方案，以帮助揭示类固醇生成或颗粒细胞分化的调控机制。此外，参与发育过程的单一因子也可被单独分析。因此，该培养模型为多种不同的应用提供了基础。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Veronica Schreiter在改进既定的冷冻保存技术和细胞培养模型方面提供的出色技术支持和有益建议。此外，我们还要感谢Maren Anders和Swanhild Rodewald在后续分析工作中提供的出色技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS Instamed 不含 Ca2+、Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| 青霉素/链霉素（10,000 IU / 10,000 µg/mL） | Merck-Millipore | A 2213 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| 两性霉素（250 µg/mL） | Merck-Millipore | A 2612 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| 3 mL 注射器（Omnifix Luer） | Braun | 4616025V | |
| 18 G 针头 | Roth | C724.1 | |
| 胎牛血清 | Merck-Millipore | S 0115 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| 冻存管（2 mL） | TPP Faust | TPP 89020 | |
| CoolCell LX 细胞冻存容器 | Corning | 432004 | |
| 培养皿，24 孔，平底 | TPP Faust | TPP 92424 | |
| 胶原酶 R（0.2 %） | Serva | 47254 | |
| α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Merck-Millipore | K 0282 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| 碳酸氢钠 | Merck-Millipore | L 1713 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| 亚硒酸钠 | Sigma | S9133 | 溶于无菌水 |
| 转铁蛋白 | Sigma | T1283 | 溶于无菌水 |
| 胰岛素（10 mg/mL） | Sigma | I0516 | 溶于 1× PBS |
| NEA | Merck-Millipore | K 0293 | 最初购自 Biochrom AG，该公司现为 Merck-Millipore 公司的一部分；Biochrom 的货号仍然有效 |
| FSH | Sigma | F4021 | 我们倾向于使用 2 µg/mL 的储存液，用 0.9 % NaCl 稀释 |
| LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | 我们使用 2 µg/mL 的储存液，溶于含 1 mg/mL BSA 的 10 mM HCl 和 1× PBS 中 |
| 雄烯二酮 | Sigma | 46033 | 我们使用 10 mM 的储存液，用 100 % 乙醇稀释 |
参考文献
- Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro. Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).
- Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture. Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Christenson, L. K., et al. Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes. Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).
- Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. Ovarian granulosa cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).
- Bernath, V. A., et al. Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).
- Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors. Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).
- Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics. Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).
- Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media. Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).
- Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited. Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).
- Silva, J. M., Price, C. A. Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro. Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).
- Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells. Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).
- Schneider, F., Brüssow, K. P. Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts. Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).
- Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15(2018).
- Yenuganti, V. R., Vanselow, J. Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions. Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).
- Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells. Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).
- Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period. Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).
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