靶向胎盘硫酸软骨素A（plCSA）的脂质-聚合物纳米颗粒的合成与表征

摘要

本文介绍了一种胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）偶联脂质-聚合物纳米颗粒的合成方案。 通过 单步超声处理与生物偶联技术。这些颗粒构成了一种新型工具，可用于将治疗药物靶向递送至大多数人类肿瘤及胎盘滋养层细胞，以治疗癌症和胎盘相关疾病。

摘要

一种有效的癌症治疗方法能够在最小化全身毒性的前提下缩小并消除肿瘤。主动靶向的纳米颗粒为癌症治疗提供了有前景的策略。糖胺聚糖胎盘软骨素硫酸A（plCSA）在多种癌细胞和胎盘滋养层细胞上表达，而疟原虫蛋白VAR2CSA能够特异性地与plCSA结合。已有研究报道，来源于疟原虫蛋白VAR2CSA的胎盘软骨素硫酸A结合肽（plCSA-BP）也可特异性结合癌细胞和胎盘滋养层细胞上的plCSA。因此，plCSA-BP偶联的纳米颗粒可作为靶向药物递送至人类癌症及胎盘滋养层细胞的工具。在本实验方案中，我们描述了一种合成载有多柔比星的plCSA-BP偶联脂质-聚合物纳米颗粒（plCSA-DNPs）的方法；该方法包括单一超声步骤和生物偶联技术。此外，还介绍了多种对plCSA-DNPs进行表征的方法，包括测定其理化性质以及在胎盘绒毛膜癌（JEG3）细胞中的细胞摄取情况。

引言

一种有效的癌症治疗方法能够在最小化全身毒性的前提下缩小并消除肿瘤。因此，选择性靶向肿瘤是探索成功治疗手段的关键。纳米颗粒为癌症治疗提供了广阔前景，而具有不同功能基团的分子组装体可提高药物疗效并减少相关副作用^1,2。此外，纳米颗粒系统主要通过被动靶向和主动靶向机制到达目标肿瘤³。

被动靶向利用纳米颗粒的固有特性以及增强的渗透性和滞留效应（EPR效应）来实现向肿瘤细胞的递送。阳离子脂质体已在临床应用中成功用于将多种抗癌药物递送至肿瘤^4,5,6。尽管具有潜在的有效抗癌治疗效果，但被动靶向纳米颗粒仍存在两个主要局限性：肿瘤区域药物浓度较低，以及无法区分肿瘤细胞与正常组织⁷。

主动靶向策略利用抗原-抗体、配体-受体及其他分子识别相互作用，将药物特异性地递送至肿瘤组织⁸。糖胺聚糖胎盘软骨素硫酸A（plCSA）在大多数癌细胞和胎盘滋养层细胞上广泛表达。此外，疟原虫蛋白VAR2CSA可特异性结合....

方案

1. 储备液的配制

1. 通过将 4 mL 无水乙醇用 100 mL 超纯水稀释，配制 4% 乙醇水溶液。将该溶液储存于 4 °C。
   注意：超纯水是指不含细菌、颗粒物、离子或核酸酶等污染物的水。本实验所用超纯水来自电阻率为 18.2 mΩ·cm 的水净化系统，表明其阴离子污染水平较低。
2. 将 20 mg 大豆卵磷脂溶解于 20 mL 4% 乙醇水溶液中，配制 1 mg/mL 大豆卵磷脂储备液。将大豆卵磷脂储备液储存于 4 °C。
3. 将 100 mg DSPE-PEG-COOH 溶解于 4 mL 4% 乙醇水溶液中，配制 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH 储备液。将储备液储存于 -20 °C。
4. 将 50 mg DOX 溶解于 5 mL 超纯水中，配制 10 mg/mL DOX 储备液。将 DOX 储备液避光储存于 4 °C。
5. 将 20 mg PLGA 溶解于 10 mL 乙腈中，配制 2 mg/mL PLGA 储备液。将 PLGA 储备液储存于 4 °C。
   警告：乙腈易燃且有毒。操作时应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备，如实验服、护目镜和乳胶手套。
6. 将 2.17 g 2-(吗啉代)乙磺酸（MES，pH 6.0）溶解于 100 mL 超纯水中，配制 0.1 M MES（pH 6.0）储备液。将储备液储存于 4 °C。

结果

在此方案中，PLGA、DSPE-PEG-COOH 和大豆卵磷脂分别为代表性的聚合物、脂质-PEG-COOH 偶联物和脂质。靶向 plCSA 的脂质-聚合物纳米颗粒的合成 通过 一种单步超声处理方法和EDC/NHS技术被展示于 图1首先，在超声条件下，大豆卵磷脂、PLGA 和 DSPE-PEG-COOH 自组装形成具有核-壳结构的 DNPs。其中，核由 PLGA 及包载的 DOX 构成，壳由 DSPE-PEG-COOH 组成，大豆卵磷脂单层位于壳与核的界面处。随后，暴露在 DNP 表面的 -COOH 基团与 -NH₂ 肽的组别 通过 采用EDC/NHS法合成plCSA-DNPs。

本实验方案制备的DNPs直径为82.3 ± 4.7 nm，与plCSA-BP偶联后，初级DNPs的直径增至109.3 ± 5.9 nm（

讨论

本方案提供了一种高效且可重复的合成plCSA-BP偶联脂质-聚合物纳米颗粒的方法。采用一步超声法制备脂质-聚合物纳米颗粒，具有快速、可重复的优点，且不同于需要加热、涡旋或蒸发等步骤的传统纳米沉淀法。因此，该方法显著缩短了合成时间。此外，本方案中使用的EDC/NHS生物偶联技术是将多肽和抗体与纳米颗粒偶联的常用且便捷的方法。因此，将一步超声法与EDC/NHS生物偶联技术相结合，用于合成靶向plCSA的脂质-聚合物纳米颗粒，具备向临床应用放大的潜力。

某些步骤对于成功合成和表征plCSA-DNPs至关重要。首先，卵磷脂、PLGA和DSPE-PEG-COOH的相对浓度决定了脂质-聚合物纳米颗粒的粒径和多分散性。当卵磷脂浓度固定时，DSPE-PEG-COOH浓度越高，纳米颗粒的多分散性越低，粒径越小^13,15，但随之导致药物包封率（LE）下降。当PLGA浓度固定时，增加卵磷脂替代DSPE-PEG-COOH的比例，会导致纳米颗粒的多分散性升高、粒径增大

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
plCSA 肽	Shanghai GL Biochem	573518	用于多肽合成
无水乙醇	Sinopharm Chemical	10009218	用于纳米颗粒合成
大豆卵磷脂	Avanti Polar Lipids	441601	用于纳米颗粒合成
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	用于纳米颗粒合成
阿霉素	JKChemical	113424	用于纳米颗粒合成
乙腈	上海凌峰	1008621	用于纳米颗粒合成
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	用于纳米颗粒合成
超声波处理器	Sonics	VCX130	用于纳米颗粒合成
离心过滤器（截留分子量 10 kDa）	Millipore	UFC801024	用于纳米颗粒纯化
离心机	Sigma	3-18KS	用于纳米颗粒纯化
2-[吗啉代]乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M3671	用于多肽偶联
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）	Sigma-Aldrich	3450	用于多肽偶联
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	Sigma-Aldrich	56480	用于多肽偶联
透析袋	Spectrum	132592T	用于纳米颗粒纯化
PBS	Hyclone	SH30028.01	用于细胞培养
10 mL 聚丙烯离心管	Aladdin	S-025	用于纳米颗粒合成
15 mL 聚丙烯离心管	Corning	430791	用于多种应用
0.22 μm 无菌注射器滤器	Millipore	SLGV033RB	用于纳米颗粒纯化
1 ml 聚丙烯注射器	BD	328421	用于纳米颗粒合成
马尔文粒度分析仪	Malvern	Nano ZS	用于粒径分析
磷钨酸			用于透射电镜（TEM）
透射电镜载网	EMCN	BZ10024a	用于透射电镜（TEM）
紫外-可见分光光度计	Leagene	DZ0035	用于透射电镜（TEM）
透射 电子显微镜	JEOL	JEM-100CXII	用于粒径分析
BCA 试剂 A	Thermo Fisher Scientific	23228	用于 BCA 检测
BCA 试剂 B	Thermo Fisher Scientific	23224	用于 BCA 检测
96 孔板	Corning	3599	用于 BCA 检测
酶标仪	Thermo Fisher Scientific	Multiskan™ GO	用于 BCA 检测
12 孔板	Corning	3513	用于细胞培养
JEG3 细胞	中国科学院细胞库	TCHu195	人胎盘来源
DMEM/F12	Hyclone	SH30272.01	无酚红
胎牛血清（FBS）	GIBCO	10100	用于细胞培养
青霉素/链霉素	GIBCO	15070063	用于细胞培养
荧光显微镜	OLYMPUS	CKK53	用于细胞摄取实验
多聚甲醛	上海凌峰	1372021	用于细胞摄取实验
DAPI	生工生物	A606584	用于细胞摄取实验
封片剂	Life	P36961	用于细胞摄取实验