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方法文章

用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定

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DOI：

10.3791/58210

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2018年9月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

本文内容

摘要

免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外 使用地址素包被毛细管分析抗整合素抗体、趋化因子或其他因素对人类细胞动态黏附影响的检测方法

摘要

免疫细胞向肠道归巢在炎症性肠病（IBD）的发病机制中具有重要作用。整合素依赖性的细胞黏附至归巢地址素是该过程中的关键步骤，目前已有成功干扰黏附过程的治疗策略。抗α4β7整合素抗体维多珠单抗（vedolizumab）已用于克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）的临床治疗，未来可能还会有更多类似药物问世。

由于该领域功能研究可用的技术有限，整合素抗体的黏附过程细节及其作用机制在许多方面仍不明确。

本文介绍了一种动态黏附检测方法，用于在流动条件下对人类细胞黏附功能进行分析，并研究抗整合素疗法在炎症性肠病（IBD）背景下的影响。该方法基于将原代人类细胞灌注通过地址素包被的超薄玻璃毛细管，并进行实时显微分析。该检测方法具有多种优化和修改的可能性，在机制研究和转化应用方面具有广阔潜力。

引言

细胞运动是一个受到严密调控的过程，对多细胞生物的发育和功能至关重要，但也与多种疾病的发病机制相关1。近年来，免疫细胞从血液循环向周围组织归巢的过程受到越来越多的关注，因为它在免疫介导性疾病中促进了炎症组织内致病细胞的补充和扩增2,3。特别是，在炎症性肠病（IBD）中，归巢过程已被证实具有转化医学意义。干扰肠道归巢的治疗性抗α4β7整合素抗体维多珠单抗（vedolizumab）在大规模临床试验中显示出疗效4,5，并在真实世界临床实践中成功应用6,7,8。未来可能还会有更多类似药物问世9,10。类似地，治疗性抗α4整合素抗体那他珠单抗（natalizumab）已被用于多发性硬化症（MS）的治疗11。

然而，我们对归巢过程的整体功能理解，特别是对这类治疗性抗体作用机制的理解仍然有限。众所周知，归巢过程包含多个步骤，包括细胞的初始黏附与滚动，随后是细胞黏附，导致牢固的停滞，最终发生跨内皮迁移12,13。上述抗体通过中和细胞表面的整合素，阻止其与血管壁内皮上的地址素相互作用，从而被认为可抑制细胞的牢固黏附14,15。然而，我们才刚刚开始了解特定整合素在不同细胞亚群归巢过程中的差异化作用。此外，抗整合素抗体对不同细胞亚群的影响及其剂量-效应关系在很大程度上仍不清楚，这导致肠道归巢及炎症性肠病（IBD）中抗黏附治疗领域仍存在大量未解的问题。

因此，迫切需要便捷的工具来解决此类问题。迄今为止，抗整合素抗体对整合素-地址素相互作用的影响主要通过流式细胞术评估结合效率/结合抑制，或通过静态黏附实验进行评价。16,17,18,19,20因此，该方法在明显简化的同时偏离了生理状况。我们近期建立了一种动态黏附实验，用于研究在剪切应力条件下人细胞通过整合素依赖性方式与地址素的黏附作用以及抗整合素抗体的影响2该技术的原理此前已在小鼠细胞中得到验证21,22在此，该方法经过改进和发展，以解决上述转化医学问题，为深入理解抗整合素抗体治疗的机制开辟了新的途径 体内.

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方案

以下各节所述研究均经埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学伦理委员会批准后开展。

1. 毛细管的制备

  1. 用小剪刀将橡胶管的一端剪开并撑开，小心地将矩形毛细管插入管中约0.5 cm。用塑料石蜡膜密封毛细管与橡胶管之间的连接处。
  2. 用 20 µL 地址素（重组 Fc 嵌合体；5 µg/mL 地址素）包被毛细管， 例如 使用移液枪（p20）将MAdCAM-1（溶于包被缓冲液中，150 mM NaCl + 1 mM HEPES）或相应的同型对照溶液加入毛细管中（液体将自行渗入毛细管内）。然后用塑料封口膜封闭未连接管路的一端，并在37 °C下孵育至少1小时。以仅含包被缓冲液或相应同型对照的毛细管作为空白对照。
  3. 移除毛细管尖端的塑料封口膜，将毛细管开口端朝下接触纸巾，使包被液被吸出，随后每根毛细管加入20 µL封闭液（含5% BSA的1x PBS），于37 °C封闭至少1小时。用塑料封口膜密封毛细管开口端。在进行显微镜观察前，不要移除封闭液。

2. 细胞分离、处理及显微镜观察前准备

注意：这些步骤可在毛细管制备所需的孵育期间进行。

  1. 从志愿者的肘静脉使用无菌采血套装采集18 mL抗凝全血（例如， 在获得当地伦理委员会规定下的书面知情同意后，对炎症性肠病患者和/或健康对照者进行研究。
    注意：此步骤应由经过培训且具有经验的医务人员根据国家和/或地方规定进行操作。
  2. 将血液注入50 mL离心管中，并用1×PBS稀释至35 mL。随后在血液-PBS混合液下方轻缓加入10 mL密度梯度介质。
  3. 进行密度梯度离心，800 × g，15 分钟 g 并在24 °C下不刹车离心以分离细胞。
  4. 通过吸取位于密度梯度介质层（透明中层）正上方的白细胞层，收集外周血单个核细胞（PBMCs）。将PBMCs转移至一个新的50 mL离心管中，用1×PBS补至50 mL，300 × g离心10分钟 g 和 10 °C。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL 1×PBS中，随后进行细胞计数。 例如， 使用血细胞计数板进行细胞计数。
  6. 可选：如需研究粒细胞的黏附性，请执行以下步骤；否则，继续进行步骤 2.7 或 2.8。
    1. 收集密度梯度离心后的粒细胞层（最底层，同时含有红细胞）。用40 mL 1×PBS重悬细胞，然后加入8 mL 6% Dextran的1×PBS溶液，轻轻混匀，室温静置沉降30分钟。
      注意：红细胞将沉降至管底，而粒细胞将保持悬浮状态。
    2. 30 分钟后，收集上清液，转移至新的 50 mL 管中，在 300 x g 条件下离心 6 分钟 g 以及 4 °C。弃去上清液，通过加入 5 mL 0.2% NaCl 溶液（ddH₂O 配制）裂解残留的红细胞2O. 孵育1分钟。
    3. 加入 5 mL 的 1.4% NaCl 溶液至 ddH₂O 中2O，再孵育1分钟。加入20 mL 1×PBS终止低渗裂解，300 × g离心6分钟 g 和 4 °C。
    4. 将细胞沉淀重悬于10 mL 1×PBS中，然后使用血细胞计数板（Neubauer细胞计数室）进行细胞计数。
  7. 可选：为研究PBMC亚群的黏附特性，可分离纯化不同细胞类型或亚群（例如， CD4+ 和 CD8+ T细胞或CD19+ 使用微珠根据制造商方案或通过荧光激活细胞分选（FACS）分离B细胞。否则，继续进行步骤2.8。
  8. 将细胞悬液在300 x g条件下离心10分钟 g 以及 10 °C。弃去上清液，并用细胞示踪染料对细胞进行染色（例如， CFSE）按照制造商说明书操作。
  9. 随后，以 300 x g 离心细胞 10 分钟 g，弃去上清液。用1×PBS重悬，测定细胞数量后，再次以300 × g离心10分钟 g.
  10. 弃去上清液，将染色后的细胞沉淀重悬于适量的黏附缓冲液中（150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl₂）2 + 1 mM CaCl2) 以获得浓度为 1.5 × 106 细胞/mL。然后，加入适量的100 mM MnCl₂2 以获得终浓度为 1 mM。
    注意：这些细胞现在可用于显微镜观察。
  11. 可选：用细胞因子、中和抗体或其他化合物处理细胞。否则，直接进行步骤3。
    1. 省略步骤2.10，将步骤2.9中染色后的细胞沉淀重悬于RPMI培养基（含10% FBS和1%青霉素/链霉素）中，调整细胞浓度至1.5 × 106 细胞/毫升
    2. 将1 mL该细胞悬液移液至48孔板中，孔数根据待分析的条件数量而定。每次实验均需设置一个未处理细胞孔，用于在未包被毛细管中灌注，作为阴性对照；另设一个未处理细胞孔，用于在地址素包被的毛细管中灌注，作为阳性对照。
    3. 对于使用抗整合素抗体的处理，加入适量的抗体（例如，10 µg/mL 维多珠单抗）加入细胞悬液中，37 °C 孵育 1 小时。进行细胞因子处理时，加入适量的重组细胞因子（例如， 向细胞悬液中加入10 ng/mL CXCL10，于37 °C孵育5分钟。
    4. 孵育后，使用 p1000 移液器反复重悬细胞以收获细胞。将细胞转移至 2 mL 离心管中，用 1 mL 1×PBS 充分清洗一次，随后加入同一 2 mL 离心管中。测定细胞数量。
      注意：贴壁细胞群体（例如单核细胞）的孵育可能需要采取额外措施例如，用胰蛋白酶处理以使细胞从培养板上脱落。
  12. 离心细胞10分钟，300 x g g 在10 °C下离心，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适量的黏附缓冲液中，以获得浓度为1.5 × 10⁶的细胞悬液6 细胞/mL。然后，加入适量的100 mM MnCl₂2 以获得 1 mM 的终浓度。若用趋化因子进行预处理，则不要添加 MnCl₂。2 加入细胞悬液中。这些细胞现在可用于显微镜观察。
    注意：检测所需的最小体积取决于所用的泵和管路。在本研究中，使用了特定的蠕动泵和指定的管路 材料表，所需最小体积为 400 µL。根据需要和具体情况（取决于细胞类型和得率），可提高细胞悬液中的细胞浓度，以在更短时间内测量到更高的黏附性。
  13. 潜在修饰：竞争性动态黏附实验
    1. 对需相互比较的不同细胞群体执行上述步骤例如， 按照步骤2.7所述，根据制造商说明书通过磁珠分离法分离调节性T细胞和效应T细胞。
    2. 用不同的染料对每个细胞群进行染色（例如， CFSE 和 FarRed），以便在显微镜下区分细胞群体，具体步骤见 2.8–2.9。
    3. 弃去上清液，将染色后的细胞沉淀重悬于适量的黏附缓冲液中（150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl₂）2 + 1 mM CaCl2) 以获得浓度为 1.5 × 10 的悬液6 cells/mL
    4. 混合等体积的细胞悬液（例如， 500 µL 调节性T细胞和 500 µL 效应T细胞，以获得终浓度为 1.5 x 10 的混合细胞6 细胞/mL。然后，加入适量的100 mM MnCl₂2 以获得终浓度为 1 mM。随后可将此类悬浮液用于通过同一毛细管灌注不同细胞群体，以竞争性分析黏附过程。

3. 动态黏附的活细胞成像

  1. 打开显微镜，选择适当的滤光片或激光以激发细胞示踪染料（例如，CFSE 使用 488 nm 激光），选择合适的物镜（例如，40X），并设置为支持延时成像的采集模式。
  2. 从毛细管尖端取下石蜡膜，用一段短管（约 5 cm 长）连接毛细管：先用小剪刀将短管一端稍作拉伸，然后小心地将毛细管插入管中约 0.5 cm。用石蜡膜密封毛细管与管之间的连接处。
  3. 将毛细管固定在固定托盘上（例如，在6孔板盖上开一个略短于毛细管长度的矩形切口），然后将固定好的毛细管放置在显微镜的托盘架上，使毛细管处于焦平面内，准备进行显微观察。
  4. 将橡胶管插入蠕动泵对应的卡槽中，并将未连接毛细管的一端放入含有细胞悬液的样品管中。将毛细管另一侧的短管插入一个 15 mL 离心管中，用于收集流出液。
  5. 以每分钟 500 µL 的流速让管道充满液体，直至细胞悬液接近毛细管。然后以 100 µL/min 的流速使毛细管充满。
    注意：快速填充毛细管可确保细胞悬液在毛细管内分布均匀。
  6. 当毛细管被细胞悬液充满后，将流速调整至 10 µL/min。
    注意：若使用不同尺寸的毛细管或不同型号的蠕动泵，流速可能需要调整。本研究中，10 µL/min 的流速已针对所用泵和毛细管优化，以模拟 体内 血流条件。
  7. 每隔 2 秒采集一次延时图像，持续 3 分钟，记录细胞沿毛细管内壁（已包被寻址素）缓慢移动的过程。
    注意：采集间隔和总时长可根据细胞类型及研究问题进行调整。
  8. 在丢弃毛细管前，通过显微镜目镜全面检查整个毛细管，确保视频中展示的区域具有代表性。如有必要，进行第二次记录。
  9. 将管道从泵上取下，让残余液体回流至 2 mL 管中，然后将毛细管和管道从固定托盘上拆下，继续使用下一个毛细管。

4. 评估与细胞计数

  1. 使用适当的软件打开延时序列，并将前三个图像（“开始”）和最后三个图像（“结束”）导出为 Tiff 文件。
  2. 打开 ImageJ 中的三个“Beginning”图像，并将其转换为 32 位（'图像 | 类型 | 32 位）并合并图片（图像 | 颜色 | 合并通道；将红色、绿色和蓝色分别分配给不同的图像）。将复合图像转换为RGB（图像 | 类型-RGB）并保存为 Tiff 文件。对“End”图像重复上述操作。
    注意：在使用不同颜色标记的细胞进行竞争性动态黏附实验时，应首先将图像的通道拆分，以分别分析不同细胞群体的黏附情况。
  3. 统计“开始”和“结束”复合图像中可见的白细胞数量，并用“结束”图像中的白细胞数减去“开始”图像中的白细胞数。
    注意：该差值表示在3分钟时间间隔内新黏附的细胞数量。在复合图像中，发生移动的细胞会显示为分配给相应帧的特定颜色，因为它们在前一帧和后一帧中的位置不同。对于黏附的细胞，红、绿、蓝信号在同一位置重叠，呈现白色。
  4. 为了更直观地展示结果，将延时序列合成为视频。 例如， 使用 ImageJ。

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结果

本论文所介绍的方法旨在尽可能模拟人体细胞与血管内皮壁黏附的 in vivo 过程，以功能性评估细胞黏附行为及干扰性抗体的作用。因此，采用灌注泵将荧光标记的目标人源细胞灌注至包被了寻址素（addressins）的超薄毛细管中。通过活细胞成像技术，可实时观察人源细胞与寻址素之间的黏附过程（图1）。

该方法特别适用于阐明炎症性肠病（IBD）中抗黏附治疗的作用机制。如图2A所示，当存在三种地址素（addressin）之一时，人外周血单个核细胞（PBMCs）在包被有ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1和同型型Fc融合蛋白的毛细管中灌流会导致显著的细胞黏附。相比之下，在包被同型型对照的毛细管上，细胞黏附极少。使用中和抗体抑制整合素与地址素之间的相互作用通常会显著降低动态黏附，而加入同型型对照抗体则无此抑制作用（代表性结果...

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讨论

上述方案描述了一种用于研究人类免疫细胞与内皮配体动态黏附的有用技术。通过改变包被的配体、灌注的细胞类型或亚群、加入额外刺激物或不同的中和抗体，该方法具有几乎无限的应用潜力。因此，此类动态黏附实验不仅有助于回答基础研究中的基本科学问题，也可用于解决转化医学领域的问题，从而助力开发和优化针对黏附过程的临床药物治疗方案。

该检测方法在研究临床抗黏附疗法效果方面的实用性 recently 已得到证实。此外，表达不同类型和数量整合素的不同细胞群体对相应地址素表现出一致的动态黏附水平，这支持了该检测方法的有效性23。

总体而言，完成该方案大约需要6小时的工作时间，技术难度中等。一旦毛细管包被开始，一个关键问题是避免脱水。这要求在孵育步骤中进行精确的密封，并在更换溶液时小心操作毛细管。此外，启动灌注过程时需格外谨慎。由于管路存在死体积，无法以最终的灌注流速直接填满整个管路。另一方面，若在高速冲洗毛细管后改变流速，则存在流体中断的风险，可能导致静态黏附，从而影响动态黏附实验结果的有效性。因此，及...

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披露

M.F.N. 曾担任 Pentax、Giuliani、MSD、Abbvie、Janssen、Takeda 和 Boehringer 的顾问。M.F.N. 与 S.Z. 收到了来自 Takeda 和 Roche 的研究资助。

致谢

CN、IA、MFN 和 SZ 的研究工作得到了埃尔朗根-纽伦堡大学临床跨学科研究中心（IZKF）和 ELAN 项目、Else Kröner-Fresenius 基金会、Fritz-Bender 基金会、德国克罗恩病与结肠炎基金会（DCCV）、德国研究基金会（DFG）炎症性肠病临床研究组（CEDER）、DFG 微生物组专题计划、新兴领域倡议项目，以及 DFG 合作研究中心 643、796 和 1181 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48孔板Sarstedt833,923
黏附缓冲液：150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
封闭液：ddH2O 中的 1x PBS + 5% BSA
牛血清白蛋白（BSA）ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
毛细管：矩形硼硅玻璃管，内径 0.20 mm × 2.00 mm，长度 50 mmCM Scientific3520-050
CCL-2，人源Immunotools11343384
CD4-磁珠，人源Miltenyi Biotec130-045-101
CellTrace™ CFSE 细胞增殖检测试剂盒ThermoFischer ScientificC34554
离心机（Rotixa 50 RS）Hettrich
包被缓冲液：150 mM NaCl + 1 mM HEPES
共聚焦显微镜（TCS SP8）Leica
CXCL-10，人源Immunotools11343884
葡聚糖 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL 一次性采血管Sarstedt
离心管（50 mL）Sarstedt62,547,004
Fc 嵌合体同型对照R&D Systems110-HG
流速蠕动泵（LabV1）保定申晨精密泵业有限公司
HEPESVWRJ848-100ML
人源 IgG 同型对照ThermoFischer Scientific31154
细胞间黏附分子 1（ICAM-1）Fc 嵌合体R&D Systems720-IC-050
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
小鼠 IgG 同型对照Miltenyi Biotec130-106-545
黏膜血管地址素细胞黏附分子 1（MAdCAM-1）Fc 嵌合体R&D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
那他珠单抗Biogen
血细胞计数板（Neubauer 计数室）RothT729.1
Pancoll，人源PAN BiotechP04-601000
磷酸盐缓冲液（PBS） BiochromL 182-10不含 Mg 和 Ca
塑料封口膜：Parafilm（PM-996）VWR52858-000
纯化的抗人 CD18 抗体Biolegend302102
RPMI 1640 培养基Gibco Life Technologies61870-010
橡胶管：SC0059T 3-Stop LMT-55 管，内径 1.02 mm，长度 406.4 mmIsmatecSC0059
血清移液管Sarstedt861,254,025
台盼蓝RothCN76.1
血管细胞黏附分子 1（VCAM-1）Fc 嵌合体Biolegend553706
维多珠单抗（Entyvio）Takeda

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细胞在流动条件下的黏附抗整合素治疗外周血单个核细胞地址素包被的毛细管实时显微分析密度梯度离心延时成像整合素与地址素相互作用
用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定
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