动态粘附法在炎症性肠病抗粘连治疗功能分析中的作用

摘要

免疫细胞对血管壁的动态黏附是肠道归巢的前提。在这里, 我们提出了一个功能性的体外检测的协议, 以影响分析抗整合素抗体, 趋化因子或其他因素的细胞动态细胞黏附的人体细胞使用 addressin 涂层毛细血管。

摘要

免疫细胞的肠道归巢对炎症性肠病 (IBD) 发病有重要意义。整合素依赖细胞黏附 addressins 是这一过程中的关键步骤, 并成功地建立了干扰粘连的治疗策略。anti-α4β7整合素抗体, vedolizumab, 用于临床治疗克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC) 和进一步的化合物可能会跟随。

由于该领域功能研究的有限可用技术, 抗整合素抗体的黏附程序和作用机制的细节在许多方面仍然不清楚。

在此, 我们提出了动态粘附试验的功能分析的人细胞黏附在流动条件下的影响, 抗整合素疗法的背景下, IBD。它的基础上, 通过 addressin 涂层超薄玻璃毛细血管灌注的原发性人类细胞和实时显微分析。该检测提供了各种改进和修改的机会, 并持有机械发现和转化应用的潜力。

引言

细胞运动是对多细胞生物体的发展和功能必不可少的严格调控的过程, 但也牵涉到多种疾病的发病机制¹。近年来, 从血流到外周组织的免疫细胞的归巢过程越来越受到重视, 因为它有助于免疫介导疾病炎症组织中致病细胞的补充和扩张^{2 ,3}。特别是, 在炎症性肠病 (IBD) 中, 归巢已被证明具有平移相关性。治疗 anti-α4β7整合素抗体 vedolizumab 干预肠道归巢已显示疗效的大型临床试验^4,5 , 已成功地用于实际临床实践^6,7,8. 进一步的化合物可能会跟随^9,10。同样, 治疗 anti-α4整合素抗体, natalizumab, 用于治疗多发性硬化症 (MS)¹¹。

然而, 我们对整个归巢过程的功能理解, 特别是这种治疗抗体的作用机制仍然是有限的。这是很好的确定, 归巢包括几个步骤, 包括细胞的结合和滚动的后续细胞黏附导致坚定的逮捕后, 反式内皮移植^12,13。上述抗体中和整合在细胞表面防止与 addressins 的相互作用的血管壁内皮。这被认为阻碍牢固的细胞黏附力^14,15。然而, 我们只是开始了解特定整合对细胞归一化的差异相关性。此外, 抗整合素抗体对不同细胞亚群和剂量反应关联的影响在很大程度上是未知的, 导致肠内归巢和抗粘连治疗在 IBD 领域的许多开放性问题。

因此, 迫切需要解决这些问题的方便工具。抗整合素抗体对整合蛋白-addressin 相互作用的影响迄今主要通过评估结合效能/束缚抑制与流式细胞术或通过静态黏附力测定^{16,17 ,18,19,20}, 因而以明显的简单化和偏离从生理情况。我们最近建立了动态粘附试验研究整合素依赖性的人体细胞对 addressins 和抗整合酶抗体在剪切应力下的作用²。该技术的原理已被证明与小鼠细胞^21,22。在这里, 它的适应和发展, 以解决上述的翻译问题, 开辟了新的途径, 以更好地了解治疗机制的抗整合素抗体在体内。

方案

以下各节所述的研究是根据埃尔兰根-亚历山大大学的道德委员会的批准进行的。

1. 毛细血管的制备

1. 将矩形毛细血管连接到橡胶管材上, 用小剪刀将油管一侧拉伸, 并小心地将毛细管 (大约0.5 厘米) 插入管内。用塑料石蜡膜密封毛细管与管的连接。
2. 毛细管与20µL 的 addressin (重组 Fc 嵌合体; 5 µg/毫升 addressin,如MAdCAM-1, 在涂层缓冲器 (150 毫米氯化钠 + 1 毫米 HEPES)) 或适当的同种控制解决方案使用 p20 吸管 (流体将浸泡到毛细管)。然后, 用塑料石蜡膜封住未与油管连接的侧面, 并在37摄氏度处孵育至少1小时。使用只用涂层缓冲器填充的毛细管或用适当的同种控制作为负控制。
3. 从毛细管尖端取出塑料石蜡膜, 通过让液体浸泡在纸巾上的毛细管上, 并在1小时内用20µL 的阻塞溶液 (1x PBS 和 5% BSA) 在37摄氏度的情况下, 将涂层清空。用塑料石蜡膜密封毛细管的开口面。在继续进行显微术之前, 请勿删除阻塞解决方案。

2. 细胞分离、治疗和显微镜制备

注意: 这些步骤可以在毛细血管准备所需的潜伏期内执行。

1. 根据当地的规定, 在知情同意的情况下, 从志愿者的肘静脉收集18毫升的抗凝全人类血液和无菌血收集集 (如IBD 患者和/或健康控制)。道德委员会。
   注: 这一步骤只应由训练有素和有经验的医务人员根据国家和/或地方条例执行。
2. 将血液填入50毫升管, 稀释到35毫升的体积, 1x PBS。然后用10毫升的密度梯度培养基将血 PBS 混合物衬底。
3. 执行密度梯度离心15分钟在 800 x g和24°c 没有刹车分开的细胞。
4. 通过在密度梯度介质层 (清中层) 顶部吸白细胞层, 收集外周血单个核细胞 (PBMCs)。转移 PBMCs 到一个新鲜的50毫升管, 填补高达50毫升与 1x PBS 和离心机10分钟在 300 x g和10°c。
5. 放弃上清, 并用重悬细胞颗粒在10毫升 1x PBS 和随后计数细胞数,例如,通过使用 Neubauer 细胞计数室。
6. 可选: 研究粒细胞的黏附力执行以下步骤。否则, 请继续执行步骤2.7 或2.8。
   1. 收集粒度层 (密度梯度离心后还含有红细胞的最底层层)。并用重悬细胞在40毫升 1x PBS。然后在 1x PBS 中加入8毫升6% 葡聚糖, 轻轻混合, 让细胞在室温下沉淀30分钟。
      注: 红细胞会下沉到管的底部, 而粒细胞将保持悬浮。
   2. 30分钟后, 收集上清, 转移到一个新鲜的50毫升管和离心机6分钟在 300 x g和4°c。在 ddH₂o 溶解中加入5毫升0.2% 氯化钠, 在1分钟内, 放弃上清, 并将其余的红细胞加在一起。
   3. 在 ddH₂O 加5毫升1.4% 氯化钠, 再孵化一分钟。在 300 x g和4°c 中加入20毫升 1x PBS 和离心机, 以6分钟停止低渗裂解。
   4. 并用重悬10毫升 1x PBS 中的细胞颗粒。然后, 使用 Neubauer 细胞计数室对细胞数进行计数。
7. 可选: 根据制造商的协议或荧光活化的方法, 研究 PBMC 亚群的黏附性, 纯化不同的细胞类型或子集 (例如, CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞或 CD19⁺ B 细胞)单元格排序 (外地资产管制)。否则, 请继续执行步骤2.8。
8. 离心机细胞悬浮10分钟在 300 x g和10°c。根据制造商的指示, 丢弃上清和染色细胞与细胞追踪染料 (如CFSE)。
9. 随后, 离心细胞10分钟在 300 x g, 并放弃上清。并用重悬在 1x PBS, 确定细胞数和离心机10分钟在 300 x g。
10. 丢弃上清和并用重悬在适当数量的黏附缓冲 (150 毫米氯化钠 + 1 毫米 HEPES + 1 毫米氯化镁₂ + 1 毫米 CaCl₂) 的染色细胞颗粒获得悬浮 1.5 x 10⁶细胞/毫升。然后, 添加适当数量的100毫米 MnCl₂获得最终浓度为1毫米。
    注意: 这些细胞现在已经准备好显微镜。
11. 可选: 用细胞因子、中和抗体或其他化合物治疗细胞。否则, 请继续执行步骤3。
    1. 省略步骤2.10 和并用重悬从步骤2.9 中的 RPMI 培养基 (10% 血清和1% 青霉素/链霉素) 的染色细胞颗粒获得浓度 1.5 x 10⁶细胞/毫升。
    2. 吸管1毫升这个细胞悬浮入许多井的48井板, 因为有条件要分析。总是准备一个良好的未经处理的细胞被灌流通过未涂布毛细管作为阴性控制和一个良好的未经处理的细胞通过 addressin 涂层毛细管灌注作为积极的控制。
    3. 对于抗整合素抗体治疗, 增加适当数量的抗体 (例如, 10 µg/毫升 vedolizumab) 的细胞悬浮。在37摄氏度孵育1小时。为治疗细胞因子, 增加适当数量的重组细胞因子 (例如, 10 CXCL10/毫升) 的细胞悬浮。孵育5分钟, 在37摄氏度。
    4. 孵化后, 用 p1000 吸管 resuspending 细胞多次收获细胞。将细胞转化为2毫升管, 再用1毫升 1x PBS 冲洗好, 并加入2毫升管。确定单元格编号。
       注: 黏附细胞种群的孵化 (例如, 单核) 可能需要额外的措施 (如, 与胰蛋白酶的治疗), 以分离细胞从板块。
12. 离心细胞为10分钟在 300 x g在10°c。丢弃上清液并并用重悬细胞颗粒在适当数量的黏附缓冲, 以获得悬浮 1.5 x 10⁶细胞/毫升。然后, 添加适当数量的100毫米 MnCl₂获得最终浓度为1毫米。当预处理与趋化因子不增加 MnCl₂到细胞悬浮。这些细胞现在已经准备好进行显微镜检查了。
    注: 用于化验的最小容积取决于所使用的泵和油管。在这项研究中, 使用蠕动泵和材料表中规定的油管, 至少需要400µL 的体积。如果需要和适用 (取决于细胞类型和产量), 悬浮液中的细胞浓度可以增加, 以测量更短的时间内的更高的黏附力。
13. 潜在修正: 竞争性动态粘附试验
    1. 执行上述步骤与不同的细胞群进行比较 (例如,通过磁珠隔离隔离的调节和效应 T 细胞, 按照制造商的指示, 按照步骤 2.7)。
    2. 用不同的染料 (例如, CFSE 和 FarRed) 染色每个种群, 如步骤所述2.8–2.9 在显微镜下能够区分细胞群。
    3. 丢弃上清和并用重悬在适当数量的黏附缓冲 (150 毫米氯化钠 + 1 毫米 HEPES + 1 毫米氯化镁₂ + 1 毫米 CaCl₂) 的染色细胞丸获得悬浮 1.5 x 10⁶细胞/毫升。
    4. 混合相同数量的细胞悬浮液 (例如, 500 µL 的调节 t 细胞和500µL 的效应 t 细胞), 以获得最终混合细胞浓度 1.5 x 10⁶细胞/毫升。然后, 添加适当数量的100毫米 MnCl₂获得最终浓度为1毫米。这种悬浮物随后可用于对黏附过程的竞争性分析通过灌注不同的细胞群通过同一毛细管。

3. 动态粘附活细胞成像

1. 打开显微镜, 选择适当的过滤器或激光, 以激发细胞跟踪染料 (例如, 488 nm 激光 CFSE), 一个适当的目标 (如40X) 和捕获模式, 使时间推移成像。
2. 从毛细管尖端取出塑料石蜡膜, 用小剪刀将毛细管与短油管 (大约5厘米长) 连接, 并仔细插入毛细管 (大约0.5 厘米)。入管。用塑料石蜡膜密封毛细管与管的连接。
3. 将毛细管安装在固定托盘上 (例如, 6 井板上的盖子, 矩形切口稍短于毛细管长度), 并将固定毛细管放在显微镜的托盘架上, 使毛细管聚焦并准备好显微镜。
4. 将橡胶油管插入蠕动泵的相应凹槽中, 并将未附着在毛细管上的端部置于含有细胞悬浮物的试样管中。将毛细管的另一侧的短管插入15毫升管, 以收集水流。
5. 让油管填充500µL 每分钟的流量, 直到细胞悬浮几乎达到毛细管。然后让毛细管填充的流速为100µL/分钟。
   注意: 毛细管的快速填充确保毛细血管内细胞悬浮的规律分布。
6. 当毛细管填充细胞悬浮液时, 调整流速为10µL/分钟。
   注: 当使用不同大小或不同的蠕动泵的毛细血管时, 这些流速可能会有所不同。本研究对10µL/分钟的流速进行了优化, 为泵和毛细血管模拟体内血流。
7. 捕获的时间推移图像的细胞移动缓慢通过毛细管沿 addressin 涂层内壁每2秒, 总共3分钟。
   注: 间隔和总时间可能因单元类型和要处理的问题而异。
8. 在丢弃毛细管之前, 通过显微镜的眼片筛过整个毛细管, 以确保视频中显示的部分具有代表性。如有必要, 请进行第二次录音。
9. 从泵中释放油管, 让剩余的流体回到2毫升管中, 然后从固定托盘中拔下毛细管和油管, 然后继续下一个毛细管。

4. 评价和细胞计数

1. 使用适当的软件打开延时序列, 并将前三个图像 ("开始") 和最后三个图像 ("End") 导出为 Tiff 文件。
2. 打开 ImageJ 中的三 "开始" 图像, 转换为32位 ('图像 |类型 |32位 ') 和合并图片 (' 图像 |颜色 |合并通道 ";将红色、绿色和蓝色的颜色分配给不同的图片)。将复合图像转换为 RGB ("图像 |"键入 RGB ') 并另存为 Tiff 文件。重复使用 "结束" 图像。
   注: 在竞争性动态粘附试验中, 用不同颜色染色的细胞, 首先分割图像的通道, 分别分析不同细胞种群的黏附力。
3. 计算 "开始" 和 "结束" 复合体中可见的白色单元格, 并从 "结束" 中的白色单元格中减去 "开始" 中的白细胞数。
   注意: 差异表示3分钟时间间隔内新粘附单元格的数目。在复合图像中, 移动的单元格在指定给相应帧的特定颜色中可见, 因为它们在上一帧和下面的框架中的另一个位置进行本地化。对于粘附的单元格, 同一位置的红色、绿色和蓝色信号与白色重叠。
4. 为了更好地可视化结果, 从时间推移序列中编译视频,例如使用 ImageJ。

结果

本论文提出的方法旨在模拟人体细胞粘附到内皮壁的体内过程, 尽可能地对细胞黏附力和干扰抗体的作用进行功能性评估。因此, 超薄毛细血管涂上 addressins, 用灌注泵将荧光标记的人类细胞灌注。使用活细胞成像可以实时观察人体细胞与 addressins 的黏附力 (图 1)。

该方法特别适用于炎症性肠病的抗粘连治疗机制。如图 2A所示, 用 ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 和同种 Fc 嵌合体的毛细血管灌流会导致明显的粘附, 当其中三 PBMCs 存在时。相比之下, 对同种涂层毛细血管的黏附力是极小的。使用中和抗体抑制整合素-addressin 的相互作用通常会导致动态黏附力的显著下降, 当同种控制抗体添加时 (代表性图 2B所示, 汇集

讨论

上述协议描述了一种有效的方法来研究人体免疫细胞对内皮配体的动态黏附力。通过涂层配体的变化, 灌注细胞类型或亚群, 孵化与附加刺激或不同中和抗体, 它有几乎无限的潜在应用。因此, 这种动态黏附力的检测可能有助于回答基本研究的基本问题, 以及翻译查询, 可以帮助开发和优化临床治疗与药物干扰粘连的过程。

这项试验的效用, 以调查临床抗粘连治疗的效果最近已经证明。此外, 不同的细胞群表达不同类型和数量的整合显示一致水平的动态粘附到各自的 addressins, 支持的有效性的化验²³。

总的来说, 《议定书》的完成需要大约6小时的工作, 并提出了中级技术挑战。一旦毛细管的涂层开始, 一个关键的问题是避免脱水。这需要准确的密封在孵化步骤和仔细处理毛细血管, 当交换解决方案。此外, 启动灌注过程需要一些谨慎。由于油管的体积过大, 不能用最终的灌注流速填充整个油管。另一方面, 高速冲洗毛细管后流速的变化, 必然会导致流动中断的风险, 造成静态粘附的可能性, 限制了动态粘附的有效性。因此, 及时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48 孔板	Sarstedt	833,923
缓冲液：150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
封闭溶液：ddH2O 中的 1x PBS + 5% BSA
牛血清白蛋白 （BSA）	Applichem	A1391,0100
CaCl2	Merck	2382
毛细管：矩形 Boro 管 0.20 mm x 2.00 mm 内径，50 mm 长度	CM Scientific	3520-050
CCL-2，人	免疫工具	11343384
CD4-微珠，人	Miltenyi Biotec	130-045-101
CellTrace™CFSE 细胞增殖试剂盒	ThermoFischer Scientific	C34554
离心机 （Rotixa 50 RS）	Hettrich
涂层缓冲液：150 mM NaCl + 1 mM HEPES
共聚焦显微镜 （TCS SP8）	Leica
CXCL-10，人	免疫工具	11343884
葡聚糖 500	Roth	9219.3
EDTA KE/9 mL Monovette	Sarstedt
Falcons （50 mL）	Sarstedt	62,547,004
Fc 嵌合体同种型对照	R&D Systems	110-HG
流速蠕动泵 （LabV1）	保定申辰精密泵业有限公司
HEPES	VWR	J848-100ML
人 IgG 同种型对照	ThermoFischer Scientific	31154
细胞间粘附分子 1 （ICAM-1） Fc 嵌合体	R&D Systems	720-IC-050
LS 色谱柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
MgCl2	Roth
MnCl2	>Roth
小鼠 IgG 同种型对照	Miltenyi Biotec	130-106-545
粘膜血管寻源蛋白细胞粘附分子 1 （MAdCAM-1） Fc 嵌合体	研发&D Systems	6056-MC
NaCl	Roth	3957.3
Natalizumab	Biogen
Neubauer 计数室	Roth	T729.1
Pancoll，人	PAN Biotech	P04-601000
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Biochrom	L 182-10	w/o Mg 和 Ca
塑料石蜡膜：石蜡膜 （PM-996）	VWR	52858-000
纯化的抗人 CD18	Biolegend	302102
RPMI 培养基 1640	Gibco Life Technologies	61870-010
橡胶管：SC0059T 3 挡 LMT-55 管，内径 1.02 mm，长度 406.4 mm	Ismatec	SC0059
血清学 Pipetts	Sarstedt	861,254,025
台盼蓝	Roth	CN76.1
血管细胞粘附分子 1 （VCAM-1） Fc 嵌合体	Biolegend	553706
Vedolizumab （Entyvio）	田