一种用于通过生物沉积法量化双壳软体动物滤食和摄食行为的流通式装置已针对船载使用进行了改进。该装置周围构建了一个二维万向节平台，可将设备与船只运动隔离开来，从而能够在 offshore 贝类养殖现场准确量化双壳类动物的滤水相关参数。
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摘要
摘要
随着贝类养殖从沿海海湾和河口区域向离岸海域转移，量化养殖双壳类动物（例如，贻贝、牡蛎和蛤类）与生态系统之间的相互作用面临新的挑战。要确定离岸贝类养殖场重要的生态相互关系，包括其承载能力、与浮游动物群落的竞争、不同水深下营养资源的可利用性以及向海底的沉积情况，必须获取关于滤食性软体动物摄食行为的定量数据。生物沉积法可用于在自然环境中量化滤食性双壳类的摄食参数，相较于实验室实验，该方法能更真实地反映实际情况。然而，该方法依赖于一个稳定的平台，以确保供给贝类的水流速率保持恒定，且贝类不受干扰。本研究对原本基于陆地使用的生物沉积法装置及操作流程进行了改进，通过在设备周围构建一个二维万向平衡台，使其适用于船上使用。平面仪数据显示，尽管船只发生移动，盛放试验贝类的实验腔室仅表现出极小的俯仰和偏摆，腔室内的流速保持恒定，操作人员能够以足够的稳定性收集生物沉积物（粪便和假粪便），从而在离岸贝类养殖现场准确测定双壳类的水体清除率、滤水率、选择性摄食、摄入量、排出量及吸收率。
引言
全球野生捕捞渔业正在衰退1。因此，未来海产品供应的增长必须依赖水产养殖业的扩展。海产品的水产养殖产量持续增长，并将在2025年前继续保持快速增长，使水产养殖成为增长最快的食品生产系统2。双壳类软体动物（如贻贝、牡蛎、扇贝和蛤类）的滤食性养殖被认为是环境影响最小的水产养殖形式之一，因为这些生物无需额外投喂，而是通过摄取天然浮游植物获取营养，并将有机物传递给底栖生物3,4。事实上，贝类养殖正被视为改善富营养化河口水质和营养结构的有效工具5,6。尽管在沿海海湾和河口扩大贝类养殖总体前景乐观，但与商业和休闲渔业、 recreational activities 以及沿海土地所有者的审美需求等其他海洋利益之间的冲突——这些社会性限制因素被统称为"社会承载力"——已促使一些人将目光投向"公海"，以寻求贝类养殖的大规模扩展7。
将贝类养殖从近岸转移到开阔海域，为贝类养殖业的扩展提供了巨大潜力，但也给海洋生态系统中的生物带来了前所未有的挑战8。首先，大多数养殖的滤食性双壳类物种是河口生物，其进化环境在许多方面与开阔海洋生态系统不同9。盐度、温度和水化学的季节性与昼夜变化，以及近岸水域中高且多变的营养物质所激发的强烈生物活动，促使贻贝、牡蛎、扇贝和蛤类进化出特定的行为和生理特征，而这些特征在相对稳定、稀释的海洋环境中可能作用有限10。已知双壳类会通过调节滤水行为来响应这些环境变化，以利用水质良好的时段并优化摄食效率11,12。在如开阔水域这样更稳定的环境中，尚不清楚双壳类是否仍能有效调节其泵水和滤水速率，以维持快速生长所需的正向能量平衡。 offshore 贝类养殖面临的第二个挑战与海洋中悬浮颗粒物（seston）食物资源相对匮乏有关。由于远海的浮游植物密度远低于河口区域，目前在河口成功养殖的双壳类物种能否获得足够的食物以维持新陈代谢和生长仍存疑问？当前在河口地区采用的绳索、网袋、网箱或其他围栏方式养殖贝类，会形成三维滤水结构，即使在富营养化的近岸水域也可能导致局部浮游植物耗竭13,14。在开阔海洋环境中，可能需要重新思考养殖装置设计、放养密度、养殖绳间距以及养殖周期等假设，以兼顾养殖场的生产承载力和当地海洋生态系统的生态承载力15,16。近岸密集式贝类养殖模式可能需要调整，才能适应海洋中低浓度的环境条件。
为了推进我们对近海贝类养殖实践可能需要如何调整才能在离岸环境中取得成功的理解，获取贝类与拟议为潜在养殖地点的离岸区域中悬浮颗粒（seston）相互作用的定量数据至关重要。目前已开发出多种技术，用于量化悬浮摄食性双壳软体动物对颗粒物的滤食、清除、摄取、排出和吸收过程17,18。其中一些方法已被优化，可用于检测极短时间内发生的变化、对不同类型颗粒的选择性，或对各种环境变化的生理响应19,20,21。近年来，对所谓“生物沉积法”（biodeposition method）的改进使其被广泛接受为一种有效工具，可用于量化贻贝、牡蛎和蛤类的大多数关键滤食与摄食参数17,22。
生物沉积法通常采用质量平衡法，以无机悬浮颗粒物组分为示踪物，在数小时的时间尺度上量化单个贝类对有机和无机悬浮颗粒物组分的分配比例，包括捕获、排斥、摄食和吸收的比例。17为确保该方法的准确性，至关重要的是向各个贝类输送的水流速率必须保持恒定且精确已知，同时应避免对贝类造成物理干扰，以使其维持稳定的滤食行为。此外，还需在双壳类摄食的同时同步采集水样，并在其消化后同步收集所产生的粪便样品。即，排遗）。这两个过程（摄食与排遗）之间的时间差，等于颗粒物通过双壳类消化道所需的时间。消化道通过时间是指从摄食食物到以粪便形式排出未消化物质之间所经历的时间。此外，从实际操作角度来看，研究人员需要在生物沉积物被水流分散之前定量收集这些沉积物。因此，采用生物沉积法测定双壳类滤水能力的装置和操作程序，迄今仅限于近岸区域，即实验所用的稳定平台（陆地或固定码头）必须靠近被研究的贝类种群。为了使生物沉积法能够在离岸环境中应用，必须找到一种在船上提供稳定平台以满足该方法要求的解决方案。
几个世纪前，航海者为了将船上的物品与船舶的运动隔离开来，发明了稳定环架（gimbal）。稳定环架在与船体相连的平台和待隔离的物体之间引入一个或多个枢轴，使得被隔离的物体更多地响应重力而非船舶的运动。我们在设计一种装置时，采用了或许是最简单的稳定环架结构——即采用呈90°夹角的销钉枢轴，该装置是在Galimany及其同事22所报道的装置基础上改进而成。在本报告中，通过以下三个方面验证了该装置的有效功能：1）比较带有贝类培养室的平台与船舶本身的运动情况；2）在海上运行期间，20个重复培养室中水流速率的一致性；3）在三艘不同船只上、于三个近海地点对贻贝进行测试所获得的滤水性能数据。
方案
1. 万向架台与进样装置
- 构建并组装云台桌，使其由两个框架、一个云台桌和一个压载水箱组成，如图1a所示。
- 使用直径为0.65 cm的聚氯乙烯（PVC）材料制作最外层框架，其长度为130 cm，宽度为92 cm，高度为90 cm。采用不锈钢螺母和螺栓连接构成框架。
- 使用4 cm × 10 cm的聚氯乙烯（PVC）材料制作最内层框架（长125 cm，宽80 cm）。在框架短边顶部安装经过加强的结构部分，以容纳内层云台框架。将不锈钢销钉永久固定，使内层框架可在外层框架内自由摆动。
- 类似地，在内层框架的长边也设置加强结构，用于安装插入云台桌的不锈钢销钉，从而使云台桌能够自由摆动。
- 在PVC立方体中配置可拆卸的压载物。向压载水箱中注入85 kg海水，并在水箱底部放入一块50 kg的锌块作为配重；该配重可起到阻尼作用，减缓云台桌的摆动，但不完全限制其运动。
注：压载水箱通过不锈钢螺母和螺栓固定在云台桌上。
图1：在船上利用生物沉积法量化双壳类悬浮摄食所开发的万向架台和摄食装置。（a）本图显示组装好的万向架台与摄食装置的实物图像。（b）本图显示组装后摄食装置的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
- 构建并组装喂养装置，该装置由一个高位水箱和两组共10个喂养腔室组成（图1b）。
- 使用6.5 mm的PVC材料制作高位水箱，尺寸为长70 cm × 宽30 cm × 高12 cm（图2a）。在左侧30 cm侧壁顶部下方3 cm处的中心位置钻一个直径为25 mm的孔。
- 在矩形结构的每段70 cm长的PVC板上钻10个直径为13 mm的孔，使每个孔的中心距离底部2.5 cm。第一个孔距离高位水箱侧壁40 mm；随后各相邻孔的中心间距为69 mm。
- 在每个孔中安装内径为7 mm的塑料穿舱接头，以便水从高位水箱流出。将内径为6.5 mm的硅胶管连接到接头上。在每根管子的中部（位于高位水箱与喂养腔室之间）连接可调节阀门，以控制进入喂养腔室的水流。
注意：为确保颗粒物在高位水箱的水中保持悬浮状态，并均匀分布至各个喂养腔室，需通过气石或通气管在整个水箱内持续供气。 - 每个喂养腔室的内部尺寸为长17.5 cm × 宽6 cm × 高6 cm（图2b）。在其中一个6 cm侧壁的中心位置钻一个直径为13 mm的孔，孔中心距底部15 mm。在每个腔室相对的另一侧6 cm侧壁上，钻一个直径为13 mm的孔，孔中心距底部45 mm。
- 在每个喂养腔室内设置一块挡板；该挡板为一块高3 cm、宽6 cm的PVC片，应放置在距底部15 mm处开孔的6 cm侧壁内侧3.5 cm的位置。将挡板粘接固定在腔室底部，使水流可从其上方通过。
- 另设一块可移动的T形挡板，长度为50 mm（T形底部宽58 mm，距顶部15 mm处；向上扩展至顶部宽度为72 mm）。该形状设计可使挡板稳定架设在喂养腔室壁上，同时允许水流从挡板下方通过（图2c）。将可移动挡板置于双壳类动物前方1–2 cm处，以迫使水流直接冲刷位于腔室底部的双壳类动物。
- 将高位水箱和喂养装置安装在万向节平台顶部，并使用防滑垫固定位置。该系统采用模块化设计，便于包装、搬运和储存。
图 2：头部水箱和喂食室的详细尺寸测量。 （a）为头部水箱的示意图及其详细尺寸。 （b）为一个喂食室的示意图及其详细尺寸。条纹线表示固定挡板的位置。 （c）为可移动挡板的示意图及其尺寸测量。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 喂养室的流速校准
- 为校准流速，将一个100 mL的玻璃或塑料量筒置于喂食室的出口处，立即用秒表开始计时。
- 30秒后，移开量筒并检查所收集的水量。理想情况下应收集到100 mL水，相当于从高位水箱流向喂食室的流速为12 L h-1。
注意：12 L h-1的流速是通过先前的实验室实验确定的，可在无水循环条件下使颗粒在各水族箱之间均匀分布。- 若所收集的水量与目标值100 mL相差超过5 mL，则通过调节位于高位水箱与喂食室之间的阀门来调整流速。再次收集30秒的水样以检查新的流速，并重复此步骤直至达到目标流速。
- 在开始数据采集前，对每个喂食室（包括对照组室）均重复相同的校准程序。
3. 生物沉积法滤膜的制备
注意：水中、假粪及粪便中总颗粒物、有机颗粒物和无机颗粒物的测定采用直径为25 mm的GF/C玻璃纤维滤膜。在样品采集前，需确保滤膜经过清洗、干燥、灼烧并预先称重。所有操作过程中均须使用平头镊子夹取滤膜。若滤膜破损或出现孔洞，应弃用该滤膜。
- 清洗滤膜时，首先将约10个滤膜放入盛有200 mL蒸馏水的烧杯中，手动搅拌。15秒后，注意原本清澈的水中有白色纤维出现；这些是滤膜释放出的松散的粉尘状玻璃纤维。停止搅拌。
- 倾去烧杯中的水，再次加入200 mL蒸馏水。总共清洗滤膜3次。重复清洗过程，直至获得足够数量的滤膜以进行完整的喂养实验，即若实验持续2小时且每15分钟收集一次水样，则需要约48个滤膜用于水体过滤，以及32个滤膜用于收集16个双壳类动物的粪便和假粪便。
- 将滤膜在60 °C下干燥至少1小时。然后将干燥的滤膜置于马弗炉中，在450 °C下灼烧4小时，以去除任何污染的有机物质。从马弗炉中取出滤膜，转移至干燥器中，使其冷却至室温。
- 使用分析天平称量滤膜并记录重量。记录滤膜重量的两种可行方法如下：
- 使用软铅笔在滤膜边缘处编号，编号位置应位于过滤时不会接触样品的区域之外。编号后称量每个滤膜，将编号和重量记录在笔记本中，并在称量后将滤膜存放回其原始滤膜盒中。
- 逐个称量每个滤膜，然后用经过马弗处理的铝箔包裹，并在铝箔上记录相应的重量。将包裹好的滤膜保存至野外使用，在采集样品后将重量记录在笔记本中。
4. 肠道通过时间
- 将五个双壳类动物分别放入盛有 300 mL 环境温度未过滤海水的玻璃或塑料烧杯中。
- 向每个烧杯中加入 2 mL Tetraselmis sp. 单一培养液，并记录每个双壳类个体开口的时间，其标志为贝壳张开。
注意：Tetraselmis sp. 用于测定肠道通过时间，因为它易于被双壳类物种摄食，且排泄的粪便呈深绿色，可与消化天然浮游生物群落后产生的棕色粪便相区分。 - 每 3 - 5 分钟检查一次每个烧杯，确保双壳类保持开口状态并持续排泄粪便。
- 确认粪便为致密、紧凑的条状物，是双壳类消化过程的产物（图 3），且在用移液器吸取时仍能保持结构完整。
- 确保所收集的沉积物为粪便而非假粪（图 3）；假粪若产生，通常在 Tetraselmis sp. 过量时立即形成，表现为松散、云雾状的未摄食颗粒沉积物，用移液器收集时会迅速重新悬浮。
图3：双壳类动物真粪与假粪在形态上的差异示意图。 左侧图显示一扇沟纹贻贝（Geukensia demissa），箭头指示其产生的真粪和假粪。右侧图详细展示了在过滤了Tetraselmis sp. 单一培养物后产生的绿色真粪与假粪，以及在过滤天然浮游植物群落后产生的褐色真粪与假粪。请点击此处查看该图的放大版本。
- 当双壳类动物排出绿色粪便时，记录每个个体的时间。双壳类动物从壳张开到排出绿色粪便所经历的时间即为其肠道通过时间。取五只双壳类动物重复样本的肠道通过时间的平均值，作为确定水样与粪样采集时间间隔的依据。
注意：设置五个重复样本，以防一个或多个双壳类动物未能张开外壳或未排便。理想情况下，平均肠道通过时间应基于三个以上的重复样本计算得出。
5. 样本采集
- 采集头部水箱溢出的水样、对照组水箱中的水样（对照组水箱中放置与实验所用双壳类相同物种的空壳，每侧两个）、以及每个双壳类个体产生的粪便和假粪便。在将双壳类放入摄食室之前，需清除其体表的附生生物及其他附着生物，以避免其他生物干扰滤食过程。
注意：双壳类动物放入摄食室后可能会移动，因此为了便于收集粪便和假粪便，可使用固定装置将它们固定在各自的室内例如， 魔术贴- 每15分钟收集300 mL水，持续2小时。分别将溢流水和两组对照室中的水通过预先称重的滤膜进行过滤即，每个时间点3个滤膜）。当滤膜仍在过滤装置上时，用约5 mL等渗甲酸铵溶液冲洗滤膜。
- 根据第4节所述方法测定的平均肠道通过时间，将生物排泄物收集的开始时间相对于水样收集延迟相应时长。例如，若平均肠道通过时间为1 h，则在滤食 chamber 中的双壳类动物开口后立即开始收集水样；1 h后，清除 chamber 中产生的全部粪便和假粪便，随后开始收集此后产生的所有粪便和假粪便。
- 为双壳类动物的摄食室和肠道转运容器遮光，以增加开口摄食的双壳类数量。
- 使用玻璃移液管分别收集粪便和假粪便，并在2小时的收集期间，将每种生物排泄物分别保存在不同的容器（烧瓶或试管）中。将每个容器中的生物排泄物分别过滤至已称重的滤膜上，并用5 mL等渗甲酸铵溶液冲洗。
注意：在2小时收集结束时，将有16个容器盛有收集的粪便，以及16个容器盛有收集的假粪，共计32个容器需要过滤。 - 将滤膜存放在培养皿中或用锡箔纸包裹后运输至实验室。若使用锡箔纸进行运输，应先将滤膜对折，使滤膜材料位于折痕内侧，以防止过滤物因接触锡箔纸而损失。所有滤膜均应存放于装有冰块的冷藏箱中运输。
- 在实验室中，将所有滤膜置于烘箱中干燥 60 °C 至少 24 h。
- 使用分析天平重新称量每个滤膜。用最终重量减去初始重量，以确定总颗粒物质量。
- 在马弗炉中灼烧所有滤膜 450 °C 4小时。将滤膜从炉中取出，转移至干燥器中，使其冷却至室温。再次使用分析天平称量滤膜。用烘干后滤膜重量减去灼烧后滤膜重量，计算颗粒无机物含量。
注意：颗粒有机质是总颗粒物与颗粒无机质之间的差值。
结果
利用生物沉积法量化双壳类摄食行为的方法已较为成熟，该方法能够在自然水体环境中，利用天然悬浮颗粒物，全面获取双壳类滤食和摄食性能的数据。以往生物沉积法的应用仅限于近岸地点，因为该方法需要稳定的平台。而在远海海域研究双壳类的滤食与摄食行为则需依赖船舶进行测量，但即使在最平静的条件下，船舶也难以提供足够的稳定性。为此，我们设计并测试了在现有滤食装置上加装万向平衡台的方案，以构建生物沉积法所必需的稳定平台。
除了为双壳类提供稳定的滤食平台外，我们还报告了数据，表明在摄食装置的各个独立腔室之间，颗粒物分布均匀（基于对20%截尾均值的Welch检验的推广，p = 0.99723；图4）。悬浮物质的这种均匀分布表明，从高位水箱向各个独立腔室输送颗粒物的过程是一致的；因此，所有双壳类所接触的食物数量和质量均相同，可被视为真正的重复样本。
图4：空室颗粒分布测试期间各摄食室中的平均细胞丰度。 本图展示了在质量保证试验中，从每个摄食室（编号1–20）的出口管采集的海水中浮游植物细胞/mL的平均数量（±标准差），以确保流过系统中颗粒分布均匀。请点击此处查看该图的放大版本。
在三个不同悬浮物数量和组成的地点，针对三种贻贝物种共进行了四次船上试验（图5）。所研究的不同物种具有潜在或当前正在开展 offshore 养殖的可能性；我们采用多个物种以验证该装置的普遍适用性。在首次康涅狄格州（CT）实验和马萨诸塞州（MA）实验中使用了紫贻贝（Mytilus edulis）。在第二次康涅狄格州（CT）实验中使用了肋贻贝（Geukensia demissa）。在加利福尼亚州（CA）实验中使用了地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）。两次实验在康涅狄格州沿海的长岛湾进行，分别于2013年6月12日和2013年6月19日，在米尔福德以东1.5公里处开展。第三次实验在马萨诸塞州沿海的葡萄园湾进行，于2013年7月23日在梅内姆沙以东1公里处开展。第四次实验在加利福尼亚州近海进行，于2013年8月20日在长滩以东10公里处开展。
这三个地点的环境条件涵盖了贝类养殖评估中可能遇到的近海环境范围。水中总悬浮颗粒物含量在CT最高，MA次之，CA最低（均 p≤ 0.001，采用修剪均值的Dunnett's T3方法的推广及自助法t 技术23）。相比之下，悬浮物的有机质含量在CA中最高，MA中较低，CT中最低（均 p≤ 0.01，采用针对修剪均值的Dunnett's T3方法的推广形式及自助法t 技术23; 图5).
图5：三个实验地点水中颗粒物的组成与含量。 本图显示了在三个不同实验地点采集的水样中，平均颗粒有机物（POM）（± 标准差；数据与误差线为灰色）和平均颗粒无机物（PIM）（± 标准差；数据为白色，误差线为黑色）的含量。完整柱形（灰色 + 白色）表示总颗粒物（TPM）。CT 1 = 康涅狄格实验1；CT 2 = 康涅狄格实验2；MA = 马萨诸塞实验；CA = 加利福尼亚实验。请点击此处查看该图的放大版本。
双壳类动物的摄食行为既具有物种特异性，也依赖于环境条件。个体能够根据水中颗粒物数量及其类型（有机和无机）的不同，调整自身的摄食行为。因此，来自三个地点的四项滤食实验结果反映了双壳类对食物数量和质量的可塑性生理响应，以及在四项实验中三项实验所体现的物种间差异。在第一次CT实验中，贻贝的吸收效率显著高于第二次CT实验，也显著高于CA实验；但其余所有成对比较均无统计学意义，这可能是由于MA和CA测量值中均观察到较高的变异性所致（显著性检验水平α = 0.05，经多重检验校正；采用修剪均值的Dunnett T3方法推广形式并结合自助法进行检验）。t 技术；23 图6）。被截留的过滤材料比例在CT中最高，在MA中较低，在CA中为零（全部 p≤ 0.005，采用针对修剪均值的Dunnett's T3方法的推广形式及自助法t 技术23).
图6：船上试验中贻贝对总颗粒物的截留率及对有机物的吸收率。 本图展示了三个实验地点贻贝的颗粒物截留率和有机物吸收率（± 标准差）。CT 1 = 康涅狄格州实验1；CT 2 = 康涅狄格州实验2；MA = 马萨诸塞州实验；CA = 加利福尼亚州实验。康涅狄格州实验1（CT 1）和马萨诸塞州实验（MA）使用蓝贻贝（Mytilus edulis）；康涅狄格州实验2（CT 2）使用肋纹贻贝（Geukensia demissa）；加利福尼亚州实验（CA）使用地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）。请点击此处查看该图的高清版本。
马萨诸塞州（MA）和加利福尼亚州（CA）的实验揭示了在环境条件变化期间可能出现的常见问题。在马萨诸塞州，较高的海况导致测得的假粪中有机物含量具有较大的相对变异性。
图 7：三个实验地点中水体、粪便和假粪的有机物含量。 本图展示了在三个地点开展的四组不同实验中，三种贻贝物种的水体、粪便及假粪中有机质平均百分比（± 标准差）。CT 1 = 康涅狄格州实验 1，使用蓝贻贝（Mytilus edulis）；CT 2 = 康涅狄格州实验 2，使用肋贻贝（Geukensia demissa）；MA = 马萨诸塞州实验，使用蓝贻贝；CA = 加利福尼亚州实验，使用地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）。请点击此处查看该图的放大版本。
在加利福尼亚州（CA）的摄食行为研究结果中，低颗粒物区域常见的分析问题表现为：一些较小的假粪起初被误认为是粪便。
图8：生物排泄物误判对船上试验中贻贝摄食行为数据的影响。 本图展示了来自加利福尼亚的样本数据，显示了在总悬浮颗粒物（TPM）浓度较低的环境中，将小型粪便误判为假粪便的影响。在此情况下，TPM浓度过低，不足以触发假粪便的产生，但粪便颗粒过小，部分被误认为是假粪便。数据通过合并粪便与“假粪便”的重量，并仅计算摄食途径进行校正。CR = 清除率，指水通过贻贝鳃部的流量（L/h）；FR = 滤水率，指在鳃部截留的颗粒物质量（mg/h）；AR = 吸收率，指在贻贝消化系统中被吸收的摄入颗粒物质量（mg/h）。请点击此处查看该图的放大版本。
案例研究展示于 图7 和 图8 在下文中进行了更详细的解释 讨论 部分
讨论
在实验室和野外研究双壳类动物的滤食和摄食行为已有多种方法。使用天然悬浮颗粒物进行测定时，所得摄食率与自然环境中的实际情况最为接近24。目前已有的便携式摄食测量装置25,26依赖于稳定平台，例如陆地或固定码头；因此，迄今为止对双壳类动物滤食和摄食的定量研究仅限于近岸水域。本文介绍的新型装置和方法为定量测定远海环境中双壳类动物的摄食表现提供了可靠工具，而此前在这些海域中双壳类动物与环境之间的相互作用尚缺乏充分描述。
双壳类生物沉积法在离岸应用中的关键步骤包括：（1）对头部水箱进行曝气，并校准所有摄食室的流速，以确保向双壳类均匀输送颗粒物；（2）在收集生物排泄物之前，准确测定实验性肠道通过时间；（3）识别、分离并完全收集双壳类产生的全部粪便和假粪便，包括收集足量的生物排泄物，以超过有机和无机颗粒物检测限。高流速至关重要，可避免摄食室中出现水流再循环，从而防止因重复过滤导致的食物浓度降低现象18,25,27,28。
在 offshore 环境中，准确识别和分离粪便与假粪便可能具有挑战性。在马萨诸塞州水域收集粪便和假粪便的过程中，测量最后阶段的高浪海况可能对样本采集造成了影响。该方法的测量结果将受限于海况，从而影响操作人员清晰分离并准确区分粪便、假粪便及其他颗粒物质的能力。即，或颗粒物）沉积在摄食腔室中。这一实验问题可从结果数据中观察到，马萨诸塞州样品的假粪中有机物含量相较于其他两个地点的结果表现出更大的变异性。图7).
在颗粒物含量极低的地区（如加利福尼亚州），分析将面临挑战，因为本实验中收集到的颗粒物含量接近检测限，即使每个水样已过滤了 2 L 水。用于量化有机和无机成分对总颗粒物贡献的方法基于质量平衡；因此，在接近检测限时的微小分析误差可能导致在生理上不可能的贝类摄食结果，例如出现负的排斥率或清除率。此类误差所导致的数据及其相应的校正方法如图8所示，该图展示了来自加利福尼亚实验的平均清除率、滤水率和吸收率。在该地点，粪便量极小，部分样本甚至被生物沉积物采集者误认为是假粪。所收集到的极少量"假粪"在重量上极其接近检测限，导致多个重复样本的贝类滤水率和摄食率数据为负值，这在生理上是不可能的，因此显然是错误的。接近检测限的颗粒物还导致该测量结果整体变异性较高。这些结果可能由滤膜称重误差引起，但更可能的原因是假粪的错误识别。后一种可能性进一步得到了以下观察结果的支持：水中总颗粒物浓度太低，不足以触发假粪的产生22,23。数据通过剔除错误的假粪数据，并仅计算摄食途径进行了校正（图8）。
用于在船上通过生物沉积法量化双壳类悬浮摄食的装置可针对多种双壳类物种进行修改和适配。摄食室的尺寸可根据双壳类贝壳的宽窄作轻微调整。但需注意，若对本文所述摄食室的尺寸进行更改，则必须在开展任何测量之前确认摄食室内颗粒物分布均匀。过滤水体的体积应根据当地环境条件进行调整。在低浮游生物量环境中（如加利福尼亚），需要过滤更大体积的水样，以确保重量分析的检测值超过检测限。同时，若过滤水量过多，滤膜易发生堵塞，此时需延长烘箱中的干燥时间（而非提高温度）。类似地，在低浮游生物量环境中，可能需要延长生物沉积物的收集时间，以获取足量样品使其超过分析检测限。另一个提示生物沉积物收集存在问题的指标是水体中相对有机质含量 与 假粪与粪便。假粪和粪便中的有机物含量可能并不显著高于水体中的有机物含量；它们是双壳类动物从水中过滤并加工颗粒后产生的产物。在某些情况下，由于双壳类在处理食物颗粒过程中投入了有机物质，生物沉积物中的有机物含量可能略高于水体，但这种投入最多只会导致粪便中有机物含量轻微增加。本文所报告的有机物百分比远高于仅由代谢性粪便损失所能解释的水平。来自马萨诸塞州的假粪样本说明了这一潜在问题。如上所述，假粪中有机物含量变异较大，但部分重复样本显示其有机物含量显著高于相应水样。在生物沉积物采集的最后阶段遭遇大浪，可能导致假粪与外源性有机物混合，从而人为地提高了有机物含量，产生生理上不可能的结果。图7如果未来应用该方法时可能出现较高的海况，建议通过增加更多腔室来增加重复次数。
该方法的一个局限性在于，此装置旨在量化成体个体的摄食情况。由于双壳类幼体产生的粪便和假粪便颗粒微小，难以准确且完整地收集，因此需要更长时间的实验才能获得足以超过分析检测限的样品量。若使用较小个体，可将多个个体合并置于同一实验腔室中，以提高每个腔室的粪便和假粪便产生速率。或者，也可重新设计装置，采用更小的实验腔室。天气和海况也可能构成重要限制因素，因为它们会影响生物沉积物样品采集的准确性。温度极端值和降雨可能减少摄食的双壳类重复组数量。在不同实验中，可调整水泵部署的水深，以确保实验所用悬浮颗粒物能够代表双壳类养殖实际所处水深的典型悬浮颗粒物状况。尽管存在这些潜在局限性，该方法仍提供了在自然条件下、利用天然悬浮颗粒物研究双壳类滤食行为的独特机会，而非依赖实验室中的人工模拟条件。所获得的数据比实验室实验结果更贴近实际，更能反映双壳类在目标区域的真实表现。这种开展船载测量的新方法极大地拓展了潜在的地理研究范围。
日益增长的离岸贻贝养殖兴趣为该方法的未来应用提供了一个理想的用户群体。希望优化新建离岸养殖作业选址的相关利益方，可利用此方法评估双壳类动物在拟选地点的表现。一项正在规划的应用实例是，检验关于在新英格兰南部沿海水域进行蓝贻贝悬吊式养殖的最佳水深的假设（Mizuta 和 Wikfors，正在审稿中）。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国东北渔业科学中心（NEFSC）以及美国国家海洋和大气管理局（NOAA）渔业局水产养殖办公室提供的资金支持。作者衷心感谢其学术界与产业界合作伙伴：伍兹霍尔海洋研究所研究专家 Scott Lindell 和卡特琳娜海产牧场公司首席执行官 Phil Cruver，他们协助安排并提供了近海贻贝养殖区域的使用权限。本研究的开展离不开以下作业平台的支持；R/V Captain Jack 由中国台湾的卡塔利娜海洋牧场（Catalina Sea Ranch）所有，R/V Gemma 由海洋生物学实验室拥有和管理的 R/V Victor Loosanoff 由美国国家海洋和大气管理局（NOAA）渔业局东北渔业科学中心运营。我们还要感谢船长 Jim Cvitanovich 和 Bill Klim 提供的专业支持。Werner Schreiner 在框架、万向节平台、压载舱、头部水箱及实验舱的设计与制造方面提供了技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GF/C 玻璃微纤维滤膜 | Whatman | 1822-025 | 直径 25 mm 的圆形滤膜 |
| 潜水式通用泵 | Utilitech | PPSU33 | 1/3 马力 |
| 过滤装置多联座 | Sterlitech | 313400 | 三联座，聚氯乙烯材质 |
| 滤膜镊子 | Millipore | XX6200006P | |
| 过滤漏斗 | Ace Glass | D140942 | 300 ml；玻璃材质 |
| 烧结支撑盘 | Fisher Scientific | 09-753-14 | 直径 25 mm；玻璃材质 |
| 真空过滤支架 | Fisher Scientific | 09-753-4 | 适用于 25 mm 过滤漏斗和烧结支撑盘 |
| 干燥烘箱 | Fisher Scientific | 15-103-0503 | 重力对流式 |
| 箱式高温炉 | ThermoFisher Scientific | BF51794C | |
| 甲酸铵 | Fisher Scientific | A666-500 | |
| Tetraselmis sp. | 国家海洋藻类与微生物资源中心（NCMA） | NCMA 提供 119 种 Tetraselmis sp. 菌株销售，应根据计划实验的温度选择特定菌株。因此，此处未推荐具体的目录编号。 | |
| 玻璃培养皿 | Fisher Scientific | 08-747A | 直径 60 mm |
参考文献
- Pauly, D., Zeller, D. Catch reconstructions reveal that global marine fisheries catches are higher than reported and declining. Nature Communications. 7, 10244(2015).
- Diana, J. S. Aquaculture production and biodiversity conservation. BioScience. 59 (1), 27-38 (2009).
- Gallardi, D. Effects of bivalve aquaculture on the environment and their possible mitigation: a review. Fisheries and Aquaculture Journal. 5, 105(2014).
- Newell, R. I. E. Ecosystem influences on natural and cultivated populations of suspension-feeding bivalve molluscs: A review. Journal of Shellfish Research. 23 (1), 51-61 (2004).
- Lindahl, O., Kollberg, S. Can the EU agri-environmental aid program be extended into the coastal zone to combat eutrophication. Hydrobiologia. 629 (1), 59-64 (2009).
- Rose, J. M., Bricker, S. B., Tedesco, M. A., Wikfors, G. H. A role for shellfish aquaculture in coastal nitrogen management. Environmental Science & Technology. 48 (5), 2519-2525 (2014).
- McKindsey, C. W., Thetmeyer, H., Landry, T., Silvert, W. Review of recent carrying capacity models for bivalve culture and recommendations for research and management. Aquaculture. 261 (2), 451-462 (2006).
- Cheney, D., Langan, R., Heasman, K., Friedman, B., Davis, J. Shellfish culture in the open ocean: lessons learned for offshore expansion. Marine Technology Society Journal. 44 (3), 55-67 (2010).
- Shumway, S. E. Shellfish aquaculture and the environment. , Wiley-Blackwell. Chichester, UK. (2011).
- Dame, R. F. Ecology of marine bivalves: An ecosystem approach. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2011).
- Bayne, B. L., et al. Feeding behaviour of the mussel, Mytilus edulis: responses to variations in quantity and organic content of the seston quantity and organic content of the seston. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 73 (4), 813-829 (1993).
- Ward, J. E., Shumway, S. E. Separating the grain from the chaff: particle selection in suspension- and deposit-feeding bivalves. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 300 (1-2), 83-130 (2004).
- Heck, K. L. Jr, Valentine, J. F. The primacy of top-down effects in shallow benthic ecosystems. Estuaries and Coasts. 30 (3), 371-381 (2007).
- Prins, T. C., Smaal, A. C., Dame, R. F. A review of the feedbacks between bivalve grazing and ecosystem processes. Aquatic Ecology. 31 (4), 349-359 (1998).
- Ferreira, J. G., Saurel, C., Lencarte e Silva, J. D., Nunes, J. P., Vazquez, F. Modelling of interactions between inshore and offshore aquaculture. Aquaculture. 426, 154-164 (2014).
- Stevens, C., Plew, D., Hartstein, N., Fredriksson, D. The physics of open-water shellfish aquaculture. Aquacultural Engineering. 38 (3), 145-160 (2008).
- Iglesias, J. I. P., Urrutia, M. B., Navarro, E., Ibarrola, I. Measuring feeding and absorption in suspension-feeding bivalves: an appraisal of the biodeposition method. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 219 (1-2), 71-86 (1998).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Marine Ecology Progress Series. 211, 275-291 (2001).
- Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17, 239-246 (1978).
- Shumway, S. E., Cucci, T. L., Newell, R. C., Yentsch, C. M. Particle selection, ingestion, and absorption in filter-feeding bivalves. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 91 (1-2), 77-92 (1985).
- Velasco, L. A., Navarro, J. M. Feeding physiology of two bivalves under laboratory and field conditions in response to variable food concentrations. Marine Ecology Progress Series. 291, 115-124 (2005).
- Galimany, E., Ramón, M., Ibarrola, I. Feeding behavior of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in a Mediterranean estuary: A field study. Aquaculture. 314 (1-4), 236-243 (2011).
- Wilcox, R. R. Understanding and applying basic statistical methods using R. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2017).
- Velasco, L. A., Navarro, J. M. Feeding physiology of two bivalves under laboratory and field conditions in response to variable food concentrations. Marine Ecology Progress Series. 291, 115-124 (2005).
- Filgueira, R., Labarta, U., Fernández-Reiriz, M. J. Flow-through chamber method for clearance rate measurements in bivalves: design and validation of individual chambers and mesocosm. Limnology and Oceanography Methods. 4, 284-292 (2006).
- Grizzle, R. E., Greene, J. K., Luckenbach, M. W., Coen, L. D. A new in situ method for measuring seston uptake by suspension-feeding bivalve molluscs. Journal of Shellfish Research. 25 (2), 643-649 (2006).
- Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Marine Ecology Progress Series. 211, 275-291 (2001).
- Newell, C. R., Wildish, D. J., MacDonald, B. A. The effects of velocity and seston concentration on the exhalant siphon area, valve gape and filtration rate of the mussel Mytilus edulis. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 262 (1), 91-111 (2001).
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