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一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

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DOI：

10.3791/58223

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2018年8月18日

 ,  , 
1Dept. of Microbial Sciences, School of Biosciences and Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Surrey

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in vivo）条件下对RNA-蛋白质复合物进行交联，然后利用寡聚(dT)磁珠从提取物中分离带有polyA尾的RNA，再通过修饰的RNA反义寡核苷酸捕获特定的mRNA。与mRNA结合的蛋白质可通过免疫印迹分析进行检测。

摘要

RNA结合蛋白（RBPs）在基因表达的转录后调控中发挥关键作用。因此，对mRNA-蛋白质复合物进行生化表征，对于理解由相互作用蛋白或非编码RNA介导的mRNA调控机制至关重要。本文描述了一种串联RNA分离方法（TRIP），可从细胞提取物中纯化内源形成的mRNA-蛋白质复合物。该两步法首先利用反义寡聚(dT)磁珠分离带多聚腺苷酸尾的mRNA，随后使用3'-生物素标记的2'-O-甲基化反义RNA寡核苷酸特异性捕获目标mRNA，并通过链霉亲和素磁珠进一步富集。TRIP已被用于回收 体内 从酵母、线虫和人类细胞中交联mRNA-核糖核蛋白（mRNP）复合物，以用于后续的RNA和蛋白质分析。因此，TRIP是一种多功能方法，可适用于多种生物体中的所有类型的polyadenylated RNA，用以研究细胞内或环境信号所诱导的mRNP动态重排。

引言

转录后基因调控由RNA结合蛋白（RBPs）、非编码RNA（ncRNAs）与mRNA之间的相互作用驱动，这些相互作用指导细胞内每条转录本的加工、定位、翻译和降解1,2因此，鉴定与特定mRNA相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）和非编码RNA（ncRNA），即形成所谓的核糖核蛋白复合物/颗粒（RNPs），是理解mRNA命运及基因表达调控的关键。为实现对RNP复合物的生化表征，需采用互补的研究方法。3,4：而 "以蛋白质为中心" 该方法基于特定RBP的纯化， "以 RNA 为中心" 该方法涉及分离特定亚群或单个RNA，随后分析与其相互作用的蛋白质或RNA。最近，一种以RNA为中心的方法被用于鉴定与多聚腺苷酸化（poly(A)）RNA相互作用的RNA结合蛋白（RBP）组5 通过在mRNA分离前引入紫外（UV）光交联步骤以稳定蛋白质-RNA相互作用，该方法日益流行，显著扩展了人类细胞中RNA结合蛋白（RBP）的种类目录6,7,8,9,10,11, 秀丽隐杆线虫12, 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）12,13,14及其他生物体15,16,17,18,19,20然而，对组装在特定转录本上的蛋白质和/或非编码RNA进行定位仍是一个巨大的挑战。目前主要有两种方法用于实现这一目标：一方面，将RNA适配体标签与目标RNA融合，以实现亲和纯化。这些RNA适配体可高亲和力地结合氨基糖苷类抗生素，包括妥布霉素和链霉素。21,22,23,24，或蛋白质，例如R17/MS2噬菌体的外壳蛋白或细菌链霉亲和素S125,26,27,28,29尽管该方法已被证明具有相对较强的稳健性和通用性，但它需要通过克隆来设计待研究的RNA，因此无法用于捕获天然的mRNA。另一方面，反义寡核苷酸（ASOs）早在早期就被用于高表达的天然核糖核蛋白复合物（RNPs）的回收与表征30,31 和病毒RNA32最近，ASO被用于捕获长链非编码RNA33,34,35 和 体外 形成的mRNPs36所有以RNA为中心的方法的一个主要限制因素是目标RNA的拷贝数，这使得低表达mRNA的回收更加困难。这一限制可通过放大反应体系来克服，但可能会导致背景信号升高。

本文介绍了我们近期开发的基于反义寡核苷酸的串联RNA分离方法（TRIP），用于高选择性地分离天然的mRNA-蛋白质复合物37 (图1). 该方案包含两个连续的基于反义寡核苷酸（ASO）的纯化步骤，即首先使用商品化的寡聚(dT)偶联磁珠分离poly(A) mRNA，随后利用特异性设计的短链生物素标记2'-甲氧基RNA反义寡核苷酸（ASO）捕获目标mRNA。这一两步法程序有助于去除污染性蛋白质，并为实验条件的调整与优化提供了更多空间。在此案例中，该方法被应用于酵母、线虫及人源细胞中选定的mRNA，以验证其有效性 体内 形成的mRNA-蛋白质复合物。

方案

1. 设计反义寡核苷酸（ASOs）

  1. 使用现有的在线工具分析 mRNA 或其片段的二级结构38。在空白框中输入核苷酸（nt）序列。在基本选项框中，选择最小自由能（MFE）和配分函数以及避免孤立的碱基对。在输出选项框中，选择交互式 RNA 二级结构图，然后点击Proceed按钮。将弹出一个新窗口，显示目标 mRNA 的二级结构。
  2. 在目标 mRNA 内选择至少三个不同的长度为 21–24 nt 的序列，优先选择缺乏明显二级结构的区域（例如，无结构的环区）以及 3’非翻译区（UTR）。
    注意：已有观察表明，与 3’非翻译区（UTR）序列结合的反义寡核苷酸（ASO）效果最佳。一种可能的解释是，结合在编码序列（CDS）上的核糖体可能会偶尔阻碍 ASO 的退火。尚未测试与 5’UTR 结合的 ASO。
    1. 选择鸟嘌呤/胞嘧啶比例接近 50% 且不含核苷酸串联重复序列的区域，以避免形成发夹结构或发生自退火。
  3. 手动设计在 3’端带有生物素基团的 2’-甲氧基修饰 RNA 寡核苷酸，该寡核苷酸应与目标 mRNA 中选定的区域（步骤 1.2）完全互补。
    注意：2’-甲氧基修饰可使 RNA 抵抗细胞内 RNase 的降解，并提高双链的熔解温度，从而允许进行严格的洗涤。生物素基团是利用链霉亲和素捕获 ASO 所必需的。
    1. 使用合适的在线工具39调整 RNA 杂交体的熔解温度至约 60–65 °C，并确保其具有较高的语言序列复杂性（>60%）。
    2. 使用基本局部比对搜索工具40搜索 ASO 在转录组中与其他 mRNA 可能发生的交叉杂交。选择Nucleotide BLAST，将序列填入空白框中，并选择目标生物体。其余参数保持默认设置，然后点击BLAST。
      注意：即使连续 8–10 nt 的部分匹配也可能导致交叉杂交并富集到该 mRNA。

2. 细胞培养、紫外线照射与细胞裂解

注意：下文所述步骤适用于酿酒酵母S. cerevisiae、秀丽线虫C. elegans以及人胚胎肾细胞（HEK293）。尽管该方法尚未经过其他生物体的明确验证，但仍可据此进行相应调整以适用于其他生物体系。

  1. S. cerevisiae
    1. 培养酵母细胞（例如，菌株 BY4743 衍生株；MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0 PFK2:TAP/PFK2在500 mL YPD培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2% D-葡萄糖）中，30 °C、220 rpm恒定振荡培养。
    2. 在对数生长中期收集细胞（600 nm 处的光密度（OD）600 ~ 0.6）通过0.45 µm尼龙滤膜过滤或在室温下以3,000 × g离心2分钟。分别弃去滤过液或上清液。
    3. 用25 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞3次，可使用0.45 µm尼龙滤膜过滤，或在室温下以3,000 × g离心2 min收集细胞，并弃去上清液。应尽快收集细胞，因为施加的应力可能影响RNA-蛋白质相互作用。
    4. 将细胞重悬于25 mL PBS中，然后将悬液倒入一个15 cm的培养皿中。将培养皿置于冰上，打开皿盖，用400 mJ/cm²紫外线照射细胞三次-2 在紫外交联仪中用254 nm紫外光照射，每次照射循环之间在冰上孵育2分钟，并轻轻混匀。
    5. 将细胞转移至50 mL离心管中，在4 °C条件下以3,000 × g离心3 min收集细胞。弃去上清液，保留沉淀。
      注意：细胞可用液氮速冻，并于 -80 °C 保存。
    6. 将细胞重悬于 4 mL 冰冷的裂解缓冲液 A（LB-A；100 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM LiCl，10 mM EDTA，1% Triton X-100，5 mM DTT，20 U/ml）中-1 DNase I，100 U/ml-1 RNasin，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物
    7. 将细胞转移至两个2 mL离心管中。加入最多⅔体积的预冷玻璃珠，在4 °C条件下，于组织破碎仪中以30 Hz震荡10分钟，裂解细胞。
    8. 用灼热的针头在管底打孔，通过600 × g离心30秒，将裂解液转移至新的1.5 mL离心管中。
    9. 在4 °C下依次进行三次离心澄清裂解液：3,000 × g离心3分钟，随后分别在5,000 × g和10,000 × g下各离心5分钟。
      注意：提取物可用液氮速冻，并于 -80 °C 保存。
  2. 秀丽隐杆线虫
    1. 在20 °C条件下，将Bristol N2线虫培养于线虫生长培养基（NGM）平板上（含0.3% NaCl、1.7%琼脂、0.25%蛋白胨、1 mM CaCl₂、1 mM MgSO₄、25 mM磷酸缓冲液、5 mg/L胆固醇）。2，5 µg/mL 胆固醇，1 mM MgSO₄4，25 mM KPO4 缓冲液，pH 6.0）接种OP50 大肠杆菌 菌株41.
    2. 加入5 mL M9缓冲液41 (0.3% KH2PO4，0.6% Na2HPO4，0.5% NaCl，1 mM MgSO₄4向每块培养板中加入适量溶液，轻轻振荡培养板以重悬线虫，随后将线虫转移至15 mL离心管中。取2 µL悬液滴加至载玻片上，使用显微镜计数悬液中的线虫数量。然后应用校正因子计算线虫总数 每 平板
    3. 通过离心收集约 120,000 条线虫（400 × g，2 分钟，室温），弃去上清液。
    4. 用M9缓冲液洗涤线虫三次。每次加入10 mL M9缓冲液，通过倒置混匀，然后在室温下以400 × g离心2 min收集线虫。
    5. 向线虫中加入15 mL M9缓冲液，于室温下在旋转摇床上孵育15分钟。
    6. 将线虫转移至NGM平板（约4,000条线虫） 每 平板）并在254 nm紫外光下以300 mJ/cm²照射-2 在紫外交联仪中。
    7. 向平板中直接加入 5 mL M9 缓冲液，轻轻振荡平板以使线虫重悬于缓冲液中。用移液器将悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 400 × g 离心 2 分钟收集线虫。
    8. 将线虫重悬于 2 mL 裂解缓冲液 B（LB-B；100 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，0.75% IGEPAL，1 mM DTT，20 U/mL-1 DNase I，100 U/mL-1 RNasin，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物
    9. 在装有液氮的研钵中研磨线虫。将粉末收集至50 mL离心管中，在室温下解冻。
      注意：液氮必须按照安全规程进行操作（例如， 通风橱和安全手套
    10. 以14,000 × g离心10分钟，去除裂解液中的脂肪层，随后用注射器将澄清的裂解液通过0.45 μm滤膜过滤。
  3. 人源培养细胞
    注意：以下描述基于将表达 CDKN1B/27 3′非翻译区（3′UTR）的 pGL3-CDKN1B-3’UTR 报告质粒瞬时转染 HEK293 细胞的实验 萤火虫 荧光素酶基因42.
    1. 在含有25 mM葡萄糖和1 mM丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞，添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，并补充10%胎牛血清，在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中维持培养。-1 青霉素，100 µg/mL-1 链霉素和10%胎牛血清（FBS），在含5% CO₂的湿润化培养箱中37 °C培养2.
    2. 接种约 3×106 转染前一天，在标准的10 cm组织培养皿中培养HEK293细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    3. 混合2 µg报告基因（例如，pGL3-p27-3’UTR）与20 µL转染试剂混合，在细胞融合度达70%（约7×10⁶）时进行转染6 细胞）
    4. 将细胞置于37 °C培养箱中继续培养48小时，然后收获。
    5. 用移液管吸除培养基，迅速用 10 mL 预热至 37 °C 的 PBS 洗涤细胞两次。用移液管吸除 PBS。
    6. 向培养皿中加入 6 mL PBS，置于冰上，然后用 UV 光（254 nm）以 100 mJ cm⁻² 剂量照射细胞-2 在紫外交联仪中。
      注意：在紫外光照射期间，培养板必须置于冰上。
    7. 刮下细胞（总共约 ~107 细胞）在 PBS 中并转移至 15 mL 离心管中。
    8. 在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟沉淀细胞，然后用移液器吸除上清液。
      注意：细胞沉淀可用液氮速冻，并于 -80 °C 保存至使用。
    9. 将细胞重悬于2 mL预冷的裂解缓冲液（LB-A）中，上下吹打5-6次，期间保持离心管置于冰上。
    10. 用移液器将裂解液转移至置于冰上的5 mL离心管中。
    11. 将裂解液进行三轮超声处理，每轮以10 μm振幅超声20秒，期间在冰上冷却30秒。
      注意：建议进行超声处理，因为这可以彻底裂解细胞并打断DNA。
    12. 将裂解液转移至2 mL离心管中，在4 °C下以15,000 × g离心10分钟。收集上清液（即提取物）并转移至新管中。取分析样品（5–10%）用于后续的蛋白质和RNA分析。
      注意：此步骤对于去除残留的细胞碎片至关重要，可重复进行。

3. 第一步：多聚(A) RNA 的分离

  1. 平衡1 mg寡聚(dT)25在500 µL相应的裂解缓冲液中加入偶联磁珠。
  2. 将5 mg、10 mg或4 mg（蛋白质）混合 S. cerevisiae, 秀丽隐杆线虫 或分别与1 mg寡聚(dT)的HEK293提取物25 偶联磁珠。在25 °C下于混匀仪中剧烈混合样品10分钟。
    注意：可使用牛血清白蛋白（BSA）作为参考标准，通过Bradford法测定提取物的蛋白浓度。剧烈振荡样品可防止磁珠沉降。为评估mRNA分离的特异性，可平行进行对照实验，加入过量（20 µg）的多聚腺苷酸（pA）。
  3. 将离心管置于磁力架上静置10秒，移除上清液。将上清液置于冰上，用于后续回收步骤（步骤3.7）。
  4. 向珠子中加入500 µL洗涤缓冲液A（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，600 mM LiCl，1 mM EDTA，0.1% Triton X-100），涡旋振荡5秒。
    注意：洗涤缓冲液中 LiCl 的浓度可以变化。推荐使用 600 mM LiCl，但也测试了较低的浓度（500 mM 秀丽隐杆线虫，HEK293细胞为300 mM。
  5. 使用磁铁收集磁珠，然后用500 µL洗涤缓冲液B（WB；10 mM Tris-HCl，pH 7.5，600 mM LiCl，1 mM EDTA）洗涤磁珠两次。
  6. 在80 °C下，用30 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）在混合仪中持续振荡（1,000 rpm）2分钟，洗脱RNA。立即将离心管置于磁力架上，静置10秒后收集洗脱液。保留磁珠用于后续轮次的纯化。
    注意：应尽快收集洗脱液，以防止mRNA在较低温度下重新结合到磁珠上。
  7. 将上一步的磁珠加入第3.3步收集的上清液中，重复进行mRNA的捕获、洗涤和洗脱两次（步骤3.3–3.6）。将多次洗脱所得的洗脱液合并，可于-80 °C保存。

4. 第二步：利用3’-生物素标记的2’-甲氧基修饰的反义RNA寡核苷酸捕获特异性mRNA

注意：为了检测反义寡核苷酸（ASOs）的适用性，可使用从细胞中分离的总RNA进行以下实验步骤。

  1. 将30 µL链霉亲和素偶联磁珠用1 mL结合与洗涤缓冲液（B&W缓冲液；含0.1 mg/mL的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA（pH 8.0）-1 大肠杆菌 在室温下将转运RNA（tRNA）置于旋转仪中孵育1小时。
    1. 用 750 µL 的 B 缓冲液洗涤磁珠三次&W缓冲液
    2. 将珠子重悬于 30 µL 的 B 中&W缓冲液中，置于冰上保存直至使用。
  2. 将上一步聚(A)分离得到的约35 µg总蛋白（见步骤3）用100 µL B缓冲液稀释&W缓冲液加入1.5 mL离心管中。
    注意：为了使用总RNA检测ASO的特异性，将600 ng纯化的总RNA加入到100 µL的B中&W 缓冲液
  3. 加入200 pmol的相应ASO，在70 °C下孵育5分钟。
    注意：升高的温度有助于解开RNA中的二级结构，从而促进ASO的退火。
  4. 将整个加热块从设备上取下，置于室温环境中静置10分钟，使其缓慢冷却。
  5. 加入30 µL步骤4.1中平衡好的链霉亲和素偶联磁珠至样品中。
  6. 在25 °C下，以950 rpm持续振荡孵育混合物30分钟。
    注意：建议每隔 10 分钟轻轻振荡试管，以防止磁珠沉降。
  7. 将试管置于磁力架上，移除上清液，再用750 µL预热的B缓冲液洗涤磁珠三次&W缓冲液，55 °C。
    注意：不同反义寡核苷酸（ASOs）之间的最佳洗涤温度可能略有差异。建议在使用细胞提取物进行实验之前，先用非交联的总RNA优化此条件。
  8. 在90 °C下，使用混合器以950 rpm持续振荡10分钟，用20 µL 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）洗脱RNA. 将试管置于磁力架上，并立即收集洗脱液。
    注意：进行蛋白质分析时，向珠子中加入20 µL 1× Laemmli缓冲液，在95 °C孵育5分钟。随后按照标准实验室方案通过免疫印迹分析检测蛋白质。

结果

我们开发了一种基于反义寡核苷酸（ASO）的RNA分离策略，称为TRIP，用于从三种不同生物体中捕获特定mRNA及其结合蛋白37本质上，RNA-蛋白质复合物发生了交联 体内 通过254 nm紫外线照射细胞，并使用市售的寡聚(dT)磁珠回收poly(A) RNA，然后利用3'-生物素标记的2'-O-甲氧基修饰的反义RNA寡核苷酸分离目标mRNA（图1）。因此，我们设计了若干条长度为21-24个核苷酸、与酵母中选定mRNA区域完全互补的修饰ASO。 秀丽隐杆线虫 以及人类，并测试了它们对目标mRNA的回收适用性（引物和ASO的列表见于 表1）。首先利用从相应生物体分离的非交联总RNA评估各ASO的效率和特异性。在这些实验中，将RNA ASO与链霉亲和素偶联的顺磁性磁珠结合，然后与来自相应生物体的非交联总RNA共同孵育。在从磁珠上释放捕获的mRNA后，通过逆转录（RT）-聚合酶链式反应（PCR）检测目标mRNA以及无关的对照mRNA的存在情况。37我们注意到，两种变量，即洗涤缓冲液的盐浓度和温度，对捕获效率起着关键作用 PFK2 酵母中经三种不同ASO处理后提取的mRNA（图2A）。将盐（NaCl）浓度降低至 25 mM 后，阴性对照 mRNA 的回收率降低PFK1降至所有ASO均无法检测的水平，但也降低了目标mRNA的回收率 PFK2 （输入的10-15%）。相反，将盐浓度提高至生理水平（150 mM NaCl）可提高回收率 PFK2 mRNAs 上调至对照组的 75%，超过对照组水平，使用 ASO PFK2-2 PFK1 mRNA 至少增加 5 倍（图2A值得注意的是，不同的ASO在生理盐浓度下对mRNA靶标的捕获效率表现出显著差异，这凸显了对ASO进行实验验证的必要性. mRNA 回收率对洗涤缓冲液温度的依赖性示例如下 C. elegans cep-1 和酵母 RPS20 mRNAs，使用相应的ASOs（表1）。我们观察到最佳洗涤温度介于 50 °C 和 55 °C，这从非相关mRNA的低背景信号以及靶标mRNA的有效回收率中可见一斑图 2B）。此时，我们希望强调反义寡核苷酸（ASOs）与其他mRNA发生交叉杂交的可能性。例如，DNM1 ASO 与另一mRNA内的某段序列完全互补 DNM1 编码序列，但也部分退火与 ACT1 mRNA。无论洗涤温度如何，DNM1 ASO 均能回收这两种 mRNA，显示出强烈的交叉杂交倾向。图 2C最后，我们利用上述测试与优化方法，筛选出三种反义寡核苷酸（ASOs），可用于从分离的总RNA中恢复各自的目标mRNA S. cerevisiae, 秀丽隐杆线虫 和人类细胞（图 2D).

在体外初步筛选出合适的 ASO 后，我们利用从经紫外线交联的生物体/细胞中提取的细胞裂解液进行了 TRIP 实验（图 1）。具体而言，我们检测了来自三种不同生物体的三种不同 mRNA 的富集情况：来自酵母 S. cerevisiae 的 PFK2 mRNA、来自线虫 C. elegans 的 cep-1 mRNA，以及一种携带人 CDKN1B/p27 mRNA 的 3'UTR 序列并融合荧光素酶（luc）报告基因的报告 mRNA（pGL3-CDKN1B-3'UTR），该报告 mRNA 在人 HEK293 细胞中进行瞬时表达。为控制 RNA 分离的特异性，我们监测了多个无关 mRNA 的回收情况，并通过向细胞裂解液中加入过量聚腺苷酸（pA）进行竞争实验，以在第一步纯化过程中与细胞 mRNA 竞争结合寡聚(dT)25 磁珠。与此前在非交联总 RNA 样本中观察到的结果一致（图 2），RT-PCR 结果证实，在 TRIP 过程中，目标 mRNA 得到了有效富集，而多个无关的对照 mRNA 则未被富集（图 3A）。此外，在未添加 ASO 的磁珠上未检测到任何 mRNA，表明阻断步骤适当，避免了非特异性结合。在此基础上，也可使用无关序列或随机序列的 ASO 作为对照，但需注意其可能与某些 mRNA 发生交叉杂交，从而导致结合蛋白的非特异性捕获。由于最终洗脱液中的蛋白质在银染聚丙烯酰胺凝胶上难以观察（数据未显示），我们进一步通过免疫印迹分析检测了已知与目标 mRNA 相互作用的蛋白质。这些蛋白包括来自 S. cerevisiae 的 Pfk2p，它以核糖体非依赖的方式特异性结合 PFK2 mRNA12；来自 C. elegans 的 GLD-1，一种经典的 RNA 结合蛋白（RBP），可结合 cep-1 mRNA 的 3'UTR 序列以调控其翻译43；以及 HuR，一种调控 p27/CDKN1B mRNA 稳定性与翻译的 RNA 结合蛋白44。正如预期，Western 印迹分析在各自 mRNA 的 TRIP 洗脱液中均检测到了上述蛋白（图 3B）。

mRNA分离过程；紫外线照射、细胞裂解、寡聚(dT)磁珠、选择性mRNA捕获示意图。
图1. TRIP技术的示意图。 通过紫外线照射在活体（in vivo）条件下将蛋白质与RNA交联。第一步（浅绿色框），在严格洗涤条件下，使用寡聚(dT)25磁珠回收多聚(A) RNA-蛋白质复合物，以去除未结合的蛋白质。第二步（粉红色框），利用生物素标记的反义RNA寡核苷酸和链霉亲和素磁珠将目标mRNP（信使核糖核蛋白复合物）特异性拉出。纯化后的mRNP随后通过逆转录PCR（RT-PCR）和免疫印迹/质谱分析（MS）进行检测，分别用于鉴定与目标mRNA相互作用的RNA和蛋白质。该图经许可改编自先前发表的研究37。请点击此处查看此图的放大版本。

mRNA 捕获实验结果；盐浓度效应、洗涤温度影响、RT-PCR 分析。
图 2. 利用修饰的反义 RNA 捕获探针从非交联细胞/生物的总 RNA 中分离特定 mRNA。 （A）盐浓度对酵母 PFK2 mRNA 使用 ASO 捕获效率的影响。将酵母细胞的总 RNA 与指定的 ASO 混合，并在 55 °C 下用含有指定盐（NaCl）浓度的缓冲液洗涤。绿色、蓝色和橙色线条代表通过 RT-PCR37 测定的不同 ASO 对 PFK2 mRNA 的回收率：PFK2-1 和 PFK2-2 结合于 3'UTR 区域，PFK2-4 结合于 CDS 区域。PFK1 为阴性对照 mRNA。PCR 扩增进行 32 个循环，定量方法如前所述37。（B）不同洗涤温度下 C. elegans cep-1 和酵母 RPS20 ASO 结合 mRNA 的比例，分别以黑色和红色线条表示。C. elegans pgk-1 和酵母 ACT1 为非靶标（对照）mRNA。酵母和 C. elegans mRNA 的检测分别采用 30 和 32 个 PCR 循环。（C）左侧示意图显示 DNM1 ASO（红色）与 DNM1 mRNA 序列的杂交情况，以及可能与 ACT1 mRNA 发生的交叉杂交。右侧为琼脂糖凝胶电泳图，显示从磁珠洗脱的酵母 DNM1 和 ACT1 mRNA 的 RT-PCR 产物（30 个循环）。Input：总 RNA；Sn：与 ASO 孵育后的上清液；E：在指定温度（40 °C、50 °C 和 60 °C）洗涤并洗脱前从磁珠中收集的洗脱液。平行进行了未添加 ASO 的对照实验（Ctrl）。（D）琼脂糖凝胶电泳图显示从酵母 S. cerevisiae、C. elegans 和人源 HEK293 细胞（H. sapiens）的总 RNA 中捕获的 mRNA 的 RT-PCR 产物（右侧）。Input：总 RNA；Sn：上清液；E：磁珠洗脱液。酵母 mRNA 的 PCR 扩增进行 30 个循环，C. elegans mRNA 进行 32 个循环，人源 tubulin 和 p27 mRNA 分别进行 28 和 30 个循环。该图经许可改编自先前发表的文章37。请点击此处查看此图的放大版本。

Poly(A) 分析；凝胶与印迹结果；S. cerevisiae, C. elegans, H. sapiens；RNA 加工研究。
图 3. 利用 TRIP 从经紫外线交联细胞的提取物中捕获特异性的 mRNA-蛋白质复合物。 （A）通过寡聚(dT)及指定的反义寡核苷酸（ASO）从 S. cerevisiae、C. elegans 和人（H. sapiens）细胞提取物中捕获 mRNA 后，采用 RT-PCR 检测 mRNA 的琼脂糖凝胶电泳图（右侧）。Input：交联细胞/生物体的总 RNA；Ctrl：无 ASO 的对照；Poly(A)：加入 poly(A) 进行竞争实验。RT-PCR 操作按文献37所述进行，LUC 基因扩增 35 个循环，p27 基因 32 个循环，tubulin 基因 29 个循环。（B）利用指定抗体（右侧）对结合 mRNA 的蛋白质进行免疫印迹分析。上样比例分别为：酵母、线虫和人源 Input 样品分别为 0.1%、2.5% 和 1%；酵母、线虫和人源寡聚(dT) 条带分别为 10%、10% 和 5%；所有 ASO 条带均为 66%。分子量（MW）以千道尔顿（kDa）为单位标示。本图经许可转载37。请点击此处查看此图的放大版本。

引物名称序列靶标大小
Pfk2_FwdGTGTTAAGGGTTCACATGTCGPFK2 S. cerevisiae133 bp
Pfk2_RevCTTCCAACCAAATGGTCAGCPFK2 S. cerevisiae133 bp
Pfk1_FwdGGTGATTCTCCAGGTATGAATGPFK1 S. cerevisiae97 bp
Pfk1_RevCTTCGTAACCTTCGTAAACAGCPFK1 S. cerevisiae97 bp
Act1_FwdGTCTGGATTGGTGGTTCTATCACT1 S. cerevisiae85 bp
Act1_RevGGACCACTTTCGTCGTATTCACT1 S. cerevisiae85 bp
Dnm1_FwdCTGTGTTCGATGCATCAGACDNM1 S. cerevisiae156 bp
Dnm1_RevCGCACTCCAATTCTTCTCTCDNM1 S. cerevisiae156 bp
Rps20_FwdCGCTGAACAACACAACTTGGRPS20 S. cerevisiae228 bp
Rps20_RevGGAAGCAACAACAACTTCGACRPS20 S. cerevisiae228 bp
Cep1_FwdCGATGAAGAGAAGTCGCTGTcep-1 C. elegans110 bp
Cep1_RevATCTGGGAACTTTTGCTTCGcep-1 C. elegans110 bp
Pgk1_FwdGCGATATTTATGTCAATGATGCTTTCpgk-1 C. elegans74 bp
Pgk1_RevTGAGTGCTCGACTCCAACCApgk-1 C. elegans74 bp
Mpk1_FwdTGCTCAGTAATCGGCCATTGmpk-1 C. elegans74 bp
Mpk1_RevTCCAACAACTGCCAAAATCAAAmpk-1 C. elegans74 bp
p27_FwdTTTAAAAATACATATCGCTGACTTCATGGp27 H. sapiens212 bp
p27_RevCAAAGTTTATGTGCTACATAAAAGGTAAAAAp27 H. sapiens212 bp
Luc_FwdAATGGCTCATATCGCTCCTGGAT荧光素酶 P. pγralis117 bp
Luc_RevTGGACGATGGCCTTGATCTTGTCT荧光素酶 P. pγralis117 bp
β-TUBULIN_FwdCTGAACCACCTTGTCTCAGCβ-TUBULIN H. sapiens136 bp
β-TUBULIN_RevAGCCAGGCATAAAGAAATGGβ-TUBULIN H. sapiens136 bp
PFK2-1 ASOAAUAGAAAGUGUAAUAAAAGGUCAU3' 非翻译区 PFK2 S. cerevisiae-
PFK2-2 ASOGUUUCAUGGGGUAGUACUUGU3' 非翻译区 PFK2 S. cerevisiae-
PFK2-4 ASOCUUGAAGAGGAGCGUUCAUA开放阅读框 PFK2 S. cerevisiae-
DNM1 ASOUCGGUCAGUGGAGGUUCAGCGUUU开放阅读框 DNM1 S. cerevisiae-
RPS20 ASOGUCGGUAAUAGCCUUCUCAUUCUUG开放阅读框 RPS20 S. cerevisiae-
cep-1 ASOGUGAGAAAUGCGGUGCUUUGAAA3' 非翻译区 cep-1 C. elegans-
p27 ASOUCAUACCCCGCUCCACGUCAGUU3' 非翻译区 p27 H. sapiens-

表1. 寡核苷酸序列。 本研究中使用的PCR引物和反义寡核苷酸（ASO）列表，包括引物序列、靶向基因及扩增后预期的片段大小。

讨论

TRIP 可用于分析与特定 mRNA 结合的蛋白质 体内 通过生化手段进行验证。尽管我们已使用该方法验证了特定RNA结合蛋白（RBPs）与来自不同生物体/细胞的mRNA靶标之间的相互作用，但TRIP方法也可适用于研究其他类型的poly(A) RNA，例如细胞质长链非编码RNA（ncRNA）。此外，通过扩大实验规模，可对结合的蛋白质和/或RNA进行系统的质谱（MS）或RNA测序分析。在这方面，我们的初步数据显示，1 L酵母培养物以及至少1亿个人源HEK293细胞可提供足够的起始材料，用于获得高表达mRNA的可靠质谱数据（未发表结果）。

所述的 TRIP 协议包括使用 254 nm 的紫外光照射细胞，以交联 RNA-蛋白质相互作用。这使得在纯化过程中能够实施严格的洗涤条件。然而，尽管尚未明确验证，我们需指出交联步骤是可选的，使用生理缓冲液也可能回收有活性的核糖核蛋白复合物（RNP）。但在这种情况下，应考虑在裂解液中蛋白质和/或 RNA 在靶 RNA 上可能发生重新排列。相反，如果应用了紫外光或其他交联方法（例如，甲醛交联），则应评估 RNA 的完整性，因为 RNA 降解可能导致 mRNP 的回收率降低。此外，紫外交联效率相对较低（约 5%），对于与双链 RNA 相互作用的蛋白质而言效率甚至更低，这可能在检测某些类别的 RNA 结合蛋白（RBP）时引入偏差12。最后，紫外照射还可能诱导蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA 交联，在数据分析解释时应考虑这些因素45,46。因此，其他交联方法（例如甲醛交联）可能特别适用于捕获结合在 mRNA 上的较大蛋白质复合物。

TRIP 的一个关键特征是采用基于反义寡核苷酸（ASO）的两步纯化流程来回收特定 RNA，从而提高选择性并降低共纯化污染物的可能性。例如，直接将生物素标记的 ASO 加入细胞裂解液可能带来共纯化生物素结合蛋白的风险。TRIP 通过使用共价偶联的寡聚(dT)25磁珠对 poly(A) RNA 进行第一轮纯化，规避了这一问题，该步骤允许采用严格的纯化条件，类似于 RNA-蛋白质相互作用组捕获实验中的操作。此外，poly(A) RNA 的富集可去除高丰度的非编码 RNA（如核糖体 RNA 和 tRNA），从而降低样本复杂性，并减少交叉杂交和污染的潜在来源。在第二步中，使用生物素标记并经过修饰的 ASO 与目标 mRNA 上的特定区域退火，以回收特定的 mRNA。另一种方法是将修饰后的 ASO 通过氨基连接臂直接共价连接到磁珠上，以减少捕获生物素结合蛋白的倾向。然而，根据我们的经验，在加入链霉亲和素磁珠之前，先将 poly(A) RNA 组分与 ASO 孵育，比直接使用 ASO 偶联磁珠更高效地回收了 mRNA-蛋白质复合物（mRNPs）。可能的原因是，游离寡核苷酸在动力学上更具优势，相较于固定化的寡核苷酸，能更有效地接触结构化 RNA 中的靶序列。因此，在与样本孵育前将 ASO 共价偶联至磁珠可能不利于目标 RNA 的回收，需通过实验进行验证。

基于ASO的方法存在一个缺点，即某些靶标mRNA的回收效率较低。因此，我们建议评估多个与转录本不同区域结合的ASO。具体而言，我们推荐设计2-3个与目标mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）或编码区（CDS）序列结合的ASO。每个ASO在回收相应mRNA靶标时可能表现出不同的效率，应通过实验进行验证（图2A，B，数据未显示）。最终我们发现，与结合CDS的ASO相比，结合3'UTR的ASO表现更优。这可能是由于UTR区域缺乏正在翻译的核糖体，使得结合位点更易接近；而在CDS区域，核糖体可能阻碍ASO与靶序列的有效杂交。我们还发现，多个ASO的联合使用可能导致来自高丰度非靶标mRNA的污染增加，并降低下拉效率。无论如何，所选寡核苷酸的选择性可通过竞争实验进行控制（例如，加入竞争性寡核苷酸）。

另一个问题是可能与无关的RNA发生交叉杂交，因为我们观察到即使与其他mRNA发生部分杂交，也可能导致该mRNA被回收图2C）。因此，为了评估所设计的ASOs的适用性，我们建议首先进行初步实验 体外 使用总RNA进行测试，以优化缓冲液的盐浓度和洗涤温度。在我们的实验中，使用含有150 mM NaCl的缓冲液在55 °C下洗涤链霉亲和素偶联磁珠的效果最佳，但我们建议针对每种设计的ASO独立测试相关条件。值得注意的是，我们发现所有选定的ASO 体外 实验（图 2D）适用于从交联的细胞提取物中捕获相应的 mRNA 靶标（图3），进一步证实了其有效性 体外 检测。除了设计适用于mRNA捕获的合适ASO外，其他因素也可能影响选择性。因此，根据磁珠类型的说明书，采用BSA和/或tRNA进行充分的封闭处理，可防止非特异性结合至磁珠。为进一步降低蛋白质的非特异性吸附，我们还推荐使用低吸附管（Lo-bind tubes），尤其是在处理微量样品时。

通常情况下，TRIP 可以补充先前已建立的方法，利用 ASO 捕获 RNA。例如，非编码 RNA Xist 使用覆盖全长转录本的一系列长链（90-mer）生物素标记DNA寡核苷酸，从2亿至8亿UV交联细胞的核提取物中分离出与蛋白质结合的复合物34,35然而，所选择的平铺策略在存在与无关RNA发生交叉杂交的高风险时可能存在问题，且无法用于特异性选择特定转录本。 例如，选择性剪接形式。最近，将特异性设计的锁核酸（LNA）或DNA反义寡核苷酸混合体共价连接至磁性树脂，用于富集 体外 来自无细胞提取物的转录本或高表达的核糖体RNA；然而，尚未针对其回收效果进行测试 体内 形成的mRNA-蛋白质复合物36鉴于人们对RNA结合蛋白（RBPs）和非编码RNA（ncRNA）在转录后基因调控中的作用日益重视，我们认为TRIP是一种有效的方法，可用于研究细胞在细胞内和环境信号刺激下核糖核蛋白（RNP）复合物的组成与动态变化，及其在健康与疾病中的影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）的 Jonathan Hall 博士和 Mauro Zimmermann 博士为 PFK2 和 cep-1 反义寡核苷酸（ASOs）的合成工作，感谢 Maikel Wouters 博士设计 p27/CDKN1B 反义寡核苷酸，以及感谢巴塞尔弗里德里希·米歇尔生物医学研究所（Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel）的 Rafal Ciosk 博士提供抗 GLD-1 抗体。本研究得到了英国生物技术和生物科学研究所（Biotechnology and Biological Sciences Research Council，资助号 BB/K009303/1）以及英国皇家学会沃尔夫森研究成就奖（Royal Society Wolfson Research Merit Award，编号 WM170036）对 A.P.G. 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MaxQ 5000 大容量恒温与制冷振荡培养摇床Thermo Fisher ScientificSHKE5000-8CE用于培养酵母细胞的落地式摇床
BBD 6220Thermo Fisher ScientificCO2 培养箱，用于培养人源细胞
Sonicator Soniprep150MSEMSS150.CX4.5超声破碎仪/细胞破碎装置，用于剪切人细胞裂解液中的DNA
Stratalinker 1800StratageneStratalinker，用于以254 nm紫外光照射细胞
Tissue LyserQiagenRETSCH MM200用于机械破碎酵母细胞的装置
冷冻离心机Eppendorf5810R用于离心沉淀细胞及裂解液
振荡培养仪，ThrillerPeqlab适用于1.5 mL离心管的恒温振荡器
玻璃珠，0.5 mmStratech Scientific Limited11079105用于酵母细胞裂解
尼龙滤膜，0.41 μmMilliporeNY4104700用于收集酵母细胞
Millex-HA 滤器，0.45 µmEMD MilliporeSLHA02510用于澄清线虫裂解液的滤器
Eppendorf LoBind 蛋白低吸附微量离心管，1.5 mLSigma-Aldrich22431081最大限度减少蛋白损失
2 mL 微量离心管AmbionAM12425用于酵母提取物制备及其他应用
5 mL 离心管Thermo Fisher Scientific129A用于收集HEK293细胞裂解液
15 mL 离心管Sarstedt62.547.254用于收集 C. elegans
50 mL 塑料离心管Sarstedt62.554.502用于收集酵母细胞
DMEM，高糖，含丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific41966用于培养HEK293细胞的培养基
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333用于补充细胞培养基，以控制细菌污染
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF7524用于补充细胞培养基
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027转染试剂
RQ1 无RNase DNasePromegaM6101DNase I，用于降解细胞裂解液中的DNA
RNasin Plus RNase抑制剂PromegaN2611RNase抑制剂，用于防止RNA降解
cOmplete Mini 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Roche11836170001蛋白酶抑制剂混合物，用于防止蛋白降解
Dynabeads Oligo (dT)25Thermo Fisher Scientific61011mRNA-蛋白复合物纯化的第一步所需磁珠
Dynabeads M-280 链霉亲和素Thermo Fisher Scientific11205DmRNA-蛋白复合物纯化的第二步所需磁珠
E. coli tRNASigma-Aldrich10109550001来自 E. coli 的转运RNA，用于封闭链霉亲和素磁珠，避免非特异性结合
Quick Start Bradford 1× 染料试剂BioRad5000205用于测定裂解液中的蛋白浓度，以BSA作为参照
牛血清白蛋白SigmaA7906-100G用于制作标准曲线，作为蛋白浓度测定的参照
小鼠抗Act1抗体MP Biomedicals869100用于Western blot检测酵母肌动蛋白（1:2,500）
小鼠抗Act1抗体SigmaA1978用于Western blot检测人源肌动蛋白（1:2,000）
小鼠抗HuR抗体Santa Cruzsc-5261用于Western blot检测HuR蛋白（1:500）
小鼠抗–CYC-1抗体Invitrogen456100用于Western blot检测Cyc-1蛋白（1:1,000）
过氧化物酶-抗过氧化物酶可溶性复合物SigmaP1291用于Western blot检测Pfk2:TAP（1:5,000）
HRP偶联的羊抗小鼠IgGAmershamNXA931HRP标记的二抗

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