本文介绍了一种在猪舍内直接记录自由活动仔猪遥测脑电图（EEG）的实验方案，无需使用镇静剂，从而能够记录非快速眼动睡眠期间典型的脑电活动模式，如纺锤波簇。
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本文内容
摘要
摘要
该方法可在猪舍内直接对自由活动的仔猪进行高质量脑电图（EEG）记录。我们采用单通道遥测脑电图系统，结合标准的自粘式水凝胶电极。仔猪在未使用镇静剂的情况下即可保持安静。释放回猪舍后，仔猪行为正常，饮水和睡眠周期与其同胞一致。其睡眠阶段被用于脑电图记录。
引言
仔猪正逐渐成为神经科学领域的一种新兴模型系统1。为了加强转化医学研究，我们开发了一种可在未束缚的仔猪中记录非侵入性临床脑电图（EEG）的方法2（图1 和 图2）。在将脑电图记录用于转化研究时，若要研究与大脑皮层成熟相关的脑电活动模式，需满足两个前提条件：一是采用与临床环境相似的非侵入性方法；二是避免使用镇静剂或麻醉剂。该单通道遥测系统3结合自粘电极，约5分钟内即可固定完成。此后，仔猪可迅速从操作过程中恢复，并将其进食和睡眠行为与同窝其他仔猪及母猪同步。
尽管已有尝试对镇静状态下的动物进行非侵入性脑电图（EEG）记录4，但大多数动物脑电图研究仍采用侵入性方法。这些方法会引发电极植入部位周围的炎症反应5,6，且在大多数情况下，由于植入式脑电系统具有外部组件，需要将动物进行社交隔离。因此，这些数据向临床情境的转化十分困难。目前尚不清楚在早期皮层发育过程中，临床非侵入性脑电图如何反映大脑的"正常"成熟过程7，这一事实凸显了对转化研究方法的需求。这一知识空白源于对早产儿进行脑电图记录所面临的技术挑战8。在动物模型系统中，早期皮层发育的模式更容易被研究，因为与人类皮层发育相比，大多数动物出生时具有"早产儿大脑"的特点9。除了跨物种保守的皮层发育模式2外，最近的研究还表明，对早产儿的脑电图记录也可用于预测个体在后期生命中的临床结局10,11。本文所述方法在发育神经科学的转化研究方面具有特别重要的意义。
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方案
所有操作均经当地伦理委员会批准（#23177-07/G10-1-010/G 15-15-011），并遵循欧洲及德国国家相关法规（欧洲共同体理事会指令 86/609/ECC；动物保护法）。
所有动物实验均按照美因茨约翰内斯·古腾堡大学医学中心动物护理委员会的规定进行。
1. 设置
- 实验前，检查是否存在线路噪声，并为设备和天线选择合适的位置。线路噪声在信号中表现为 60 Hz 或 50 Hz 的正弦波。
注意：天线的放置位置，尤其是发射器与接收器之间的距离，取决于系统的发射强度。此处使用的系统具有可调节性，已调整为相对较低的功率，传输距离约为 3 m。此外，猪舍中的金属围栏可能会衰减信号并引起干扰。在此情况下，必须将天线置于金属笼内。 - 使用电缆卷盘为设备提供交流电源。将笔记本电脑、接收单元以及模数转换器（如所使用的遥测系统需要）连接至电源。
注意：此处使用的遥测系统将数字数据发送至接收器，其他系统可能有所不同。 - 将电极、粘合剂、棉签、擦拭巾以及混合块放置在另一张独立的桌面上。
- 准备带短电缆的电极。具体操作为：根据动物体型，将电极剪短，并重新焊接成尽可能短的长度。电缆长度必须足以连接头部所需记录位置与遥测 EEG 装置，以传输数据。过长的电缆需盘绕起来，并用皮肤粘合用硅胶弹性体覆盖。需要盘绕的较长电缆会使硅胶贴片体积更大、重量更重。
2. 仔猪
- 通过抓住仔猪的腿部或胸部来捕捉它。抓住后注意观察是否有排便或排尿情况。
- 如有必要，用编号标记该仔猪。
- 用毛巾将仔猪包裹起来，使其安静下来。注意避免仔猪过热。
- 用一只手握住仔猪的身体或前肢，另一只手固定其口鼻部。注意避免仔猪过热，并确保其呼吸通畅。
3. 电极
- 由另一人负责安装电极。
- 使用水或乙醇清洁皮肤上的污垢。如有必要，剃除头部毛发。
- 使用研磨性脑电凝胶和棉签去除死皮细胞，随后清除残留的研磨凝胶。也可选择使用砂纸替代。
- 将自粘式电极固定在目标位置。接地电极置于小脑上方（两耳之间），参考电极置于鼻部，记录电极置于所需记录位置。
注：本实验采用单极记录方式，因为参考电极位于中性位置（鼻部）。目前尚无针对仔猪的标准化电极放置系统。本实验在右侧大脑半球顶叶区域（眼与耳之间）进行记录。 - 将导线连接至遥测装置，并开启设备。根据所使用的遥测系统不同，启动方式可能为磁性开关或射频唤醒信号。
- 使用双组分皮肤粘合硅橡胶（见材料表）覆盖遥测装置、所有导线及电极。将等量的两种组分混合后，固化时间约为1分钟。注意避免将硅橡胶覆盖到眼睛及睫毛部位。
- 等待硅橡胶完全固化。
- 将仔猪放回猪栏。
- 观察仔猪是否在较长时间内（数分钟）表现出不适迹象。
4. 测量
- 等待仔猪恢复，并开始与其兄弟姐妹同步行为（进食、玩耍、睡眠），通常在30秒后即可观察到（图1）。
- 如需记录睡眠阶段，请等待睡眠期开始。记录时长取决于具体科学问题。本实验采用10分钟的记录时段。
- 若遥测装置被两只以上的其他仔猪覆盖，接收器接收到的信号可能过弱。若仔猪压在装置上睡觉，可轻轻将其拨开。操作时需注意母猪，其可能表现出攻击性反应。
- 使用数据采集软件开始记录（参见材料表）。
5. 完成
- 记录结束后（通常为数小时），按照步骤2所述方法再次捕捉仔猪。注意母猪可能产生攻击性反应。
- 轻轻抬起硅橡胶的一侧边缘，然后整体取下包含电极和遥测装置的硅橡胶贴片。操作时注意避免损伤仔猪的眼睛。
- 将仔猪放回猪栏中。
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结果
我们能够从自由活动的仔猪中记录到与非快速眼动睡眠相关的典型脑电图模式，例如纺锤波簇或δ刷（图1 和 图2）。我们主要关注非快速眼动睡眠期间的代表性脑电模式，但也记录到了类似快速眼动睡眠的阶段12，其波幅极低（图3）。不同物种之间的快速眼动睡眠生理特征及其持续时间存在差异13。持续数分钟的短暂快速眼动睡眠阶段在猪中较为典型14。在哺乳（摄食）期间，脑电记录质量也保持良好（图4）。在动物玩耍行为期间，强烈的肌肉活动会导致肌电伪迹；然而，可通过滤波方法提取脑电频带信号。其他可能的分析工具包括功率谱密度计算，或专注于神经网络活动的分析方法，例如相位-振幅耦合。这些分析方法同样适用于单通道脑电图记录。
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讨论
该方案中的一个关键步骤是确保电极与皮肤充分接触，特别是接地电极，以获得低噪声的稳定记录。此外，由于仔猪活动性很强，必须用硅橡胶完全覆盖整个系统，以保护电极和遥测单元。另外，如果实验在带有缝隙地板的猪舍中进行，需小心小型设备或连接器掉落缝隙中。
如果自粘性水凝胶电极粘附不牢，应尽量彻底清除研磨膏。另一种去除皮肤外层死皮的方法是使用砂纸。预处理时使用酒精并非必需步骤。脏污的皮肤也可用水清洗。切勿使用胶带条代替体用双面硅胶来固定遥测系统，因为胶带条可能引起皮肤刺激和明显的不适反应。在这种情况下，仔猪会很快将系统摆脱。
该方法的一个局限性在于水凝胶电极的稳定性。它们可能在数小时后变干，导致记录质量下降。此外，与其他所有脑电图（EEG）技术一样，剧烈运动通常会在记录轨迹上产生肌电伪迹（如图4所示）。另外，天线的合理放置对于减少因接收信号不良而产生的伪迹也十分重要。金属围栏还可能引起高频干扰，导致数据序列丢失。解决此问题的一种方法是将天线置于金属围栏内部的最优位置。天线的最优位置...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Helmut Scheu 提供机会，使我们能够在 Hofgut Neumühle 的猪舍中开展研究工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 一次性粘性 表面银/氯化银电极 | Spes Medica S.r.l.，意大利热那亚 | 自粘性水凝胶电极 | |
| Abralyt HiCl | Easycap GmbH | 研磨膏 | |
| Body Double fast | Smooth On Inc. | 皮肤粘合硅胶 | |
| 遥测系统 | 自主开发 | ||
| Picolog 1216 | Pico Technology | 模数转换器 | |
| 笔记本电脑 | Panasonic | 加固型笔记本电脑 | |
| 接收器 | 自主开发 |
参考文献
- Conrad, M. S., Sutton, B. P., Dilger, R. N., Johnson, R. W. An in vivo three-dimensional magnetic resonance imaging-based averaged brain collection of the neonatal piglet (Sus scrofa). PLoS ONE. 9 (9), e107650(2014).
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重印与许可
