可视化培养小鼠神经元中轴突生长锥的塌陷及早期淀粉样蛋白β效应

摘要

本文介绍了一种研究β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑内早期作用的实验方案。该方案表明，Aβ可诱导网格蛋白介导的内吞作用以及轴突生长锥的塌陷。本方案适用于研究Aβ对轴突生长锥的早期影响，可能有助于阿尔茨海默病的预防。

摘要

β-淀粉样蛋白（Aβ）导致阿尔茨海默病（AD）中的记忆障碍。尽管已有治疗手段被证明可降低AD患者脑内的Aβ水平，但这些疗法并不能改善记忆功能。由于Aβ在记忆障碍出现之前便已在脑内聚集，因此对于已经出现记忆缺陷的AD患者而言，靶向Aβ可能疗效有限。因此，应在AD发病之前阻断由Aβ沉积引发的下游信号通路。Aβ可诱导轴突变性，进而导致神经元网络破坏和记忆障碍。尽管已有大量关于Aβ毒性的机制研究，但Aβ毒性的来源仍不清楚。为了帮助确定其来源，我们提出一种新颖的实验方案，结合显微成像、基因转染和活细胞成像技术，以研究Aβ在培养神经元轴突生长锥中引起的早期变化。该方案揭示，Aβ可诱导轴突生长锥中网格蛋白介导的内吞作用，随后导致生长锥塌陷，并证明抑制内吞作用可防止Aβ的毒性效应。该方案将有助于研究Aβ的早期作用，可能为更有效且具有预防性的AD治疗提供新途径。

引言

阿尔茨海默病（AD）患者脑内可发现淀粉样蛋白-β（Aβ）沉积，这种沉积被认为是导致AD的关键原因¹，会破坏神经元网络，进而引起记忆障碍^2,3,4。许多临床药物候选物已被证明可有效抑制淀粉样蛋白-β（Aβ）的生成或清除Aβ沉积。然而，这些药物均未能成功改善AD患者的记忆功能⁵。在记忆障碍出现之前，Aβ已在脑内沉积⁶；因此，在已出现记忆障碍的患者脑中降低Aβ水平可能无效。Aβ沉积存在于AD的临床前期患者中；但这些患者极少表现出神经元变性和记忆缺陷⁶。Aβ沉积与记忆障碍之间存在时间延迟。因此，预防AD的关键策略是在记忆缺陷出现之前的AD早期阶段阻断Aβ毒性信号通路。Aβ沉积可诱导轴突变性^{7,8,9,10,11,12,13}，这可能导致神经网络破坏和记忆功能的永久性损伤。许多研究已探讨了Aβ毒性的机制；例如，AD小鼠脑中变性的轴突已被证实自噬水平升高¹⁴。已有报道指出钙调磷酸酶（calcineurin）的激活可能是Aβ诱导轴突变性的潜在机制¹⁵；然而，轴突变性的直接触发因素仍不明确。

本研究聚焦于轴突末端（称为生长锥）的塌陷现象。轴突生长锥的塌陷可由轴突生长排斥因子引起，例如神经导向因子-3A（semaphorin-3A）和ephrin-A5^{16,17,18,19,20}。类似塌陷样变性的轴突末端已在阿尔茨海默病（AD）患者脑组织中被观察到^21,22。此外，生长锥功能障碍可能引发轴突变性²³。然而，目前尚不清楚Aβ是否可诱导生长锥塌陷。因此，本研究提出了一种新方法，用于观察Aβ在培养神经元中的早期效应，并探究Aβ诱导的生长锥塌陷现象。

方案

所有实验均按照富山大学杉谷校区实验动物管理和使用指南进行，并经富山大学杉谷校区实验动物管理和使用委员会批准（A2014INM-1，A2017INM-1）。

1. 塌陷实验

1. 多聚-D-赖氨酸包被
   1. 用 400 μL 含 5 μg/mL 多聚-D-赖氨酸（PDL）的磷酸盐缓冲液（PBS）包被 8 孔培养板，于 37 °C 孵育过夜。
   2. 移除 PDL 溶液，用蒸馏水洗涤各孔 3 次。
2. 神经元培养²⁴
   1. 用显微剪刀将胚胎第 14 天（E14）ddY 小鼠新鲜分离的大脑皮层在含 12% 马血清、0.6% 葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺（培养基 A）的神经元培养基中剪碎。不要添加抗生素。
      注意：本方案使用 ddY 小鼠。这是一种在日本常用的远交系小鼠。该神经元培养方案也可用于大鼠皮层神经元^7,25。
   2. 以 87 × g 离心组织 3 分钟。
   3. 移除上清液，向沉淀中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 15 分钟。每 5 分钟轻敲混匀一次。
   4. 加入 4 mL 培养基 A，轻敲混匀。
   5. 以 178 × g 离心组织 3 分钟。
   6. 移除上清液，将组织与 600 U/mL DNase I 和 0.3 mg/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂（溶于 PBS）在 37 °C 孵育 15 分钟。每 5 分钟轻敲混匀一次。
   7. 孵育后，加入 4 mL 培养基 A，轻敲混匀。
   8. 以 178 × g 离心组织 3 分钟。
   9. 移除上清液后，加入 4 mL 培养基 A，用抛光的巴斯德移液管吹打组织进行分散。
   10. 用孔径为 70 µm 的滤网过滤吹打后的组织。过滤后，用血细胞计数板计算细胞密度。
   11. 将细胞以每孔 0.8 × 10⁴ 个细胞的密度接种于 8 孔培养板中，使用培养基 A 培养，并置于 37 °C、10% CO₂ 湿润环境的 CO₂ 培养箱中维持培养。
   12. 培养 4 小时后，更换为含 2% 神经元培养添加剂、0.6% 葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺（培养基 B）的新鲜培养基。
       注意：神经元纯度约为 75%，如先前所述²⁶。
3. 塌陷实验²⁷
   1. 将市售的全长淀粉样蛋白 β1-42（Aβ1-42）溶于蒸馏水中，配制成 0.5 mM 溶液，于 37 °C 孵育 7 天。孵育结束后，将聚集态 Aβ1-42 溶液储存于 -30 °C 冰箱中备用。
      注意：此孵育步骤对 Aβ 的聚集和毒性至关重要^27,28,29,30。
   2. 神经元培养 4 天后，向各孔加入含 0.5 μM 聚集态 Aβ1-42 或溶剂对照（蒸馏水）的新鲜培养基 B 100 μL，处理 1 小时。
      注意：Aβ1-42 的效应在 0.1 至 5 μM 范围内呈剂量依赖性增强，并在 0.5 μM 时达到峰值，如先前所述²⁷。在神经元培养 3 天后进行 Aβ1-42 处理 1 小时，也可观察到类似结果³¹。
   3. 移除培养基，立即在加热板上用含 4% 蔗糖的 4% 多聚甲醛 PBS 溶液于 37 °C 固定神经元 1 小时。
   4. 固定后，用 PBS 洗涤神经元 3 次，然后用水溶性封片剂封片。于 4 °C 干燥封片剂 2–4 天。
   5. 使用倒置显微镜配备的 20X 干镜物镜，采集每个孔的完整区域（7.8 × 9 mm²）图像。
   6. 根据先前描述的方法^32,33，将处于第 3 或第 4 阶段的每个神经元中最长的神经突判定为轴突。
   7. 根据以下标准对生长锥进行分类：1）缺乏片状伪足的轴突生长锥，或 2）具有少于三条丝状伪足的生长锥，均视为塌陷的生长锥，如先前所述¹⁷。
      注意：健康的生长锥记为 0 分；塌陷的生长锥记为 1 分。每种处理组计算平均塌陷评分。

2. 淀粉样蛋白 β 免疫染色

1. 按照步骤1.2所述方法培养小鼠皮层神经元3天。
2. 在CO₂培养箱中，于37 °C条件下，用聚集态Aβ1-42（5 μM）或溶剂处理4小时。
3. 不更换培养基，向每孔中加入等体积含4%蔗糖的4%多聚甲醛PBS溶液，并将培养板置于加热板上于37 °C维持5分钟。
4. 将溶液替换为400 μL含4%蔗糖的4%多聚甲醛PBS溶液，继续在加热板上37 °C固定1小时。该固定方案经前人报道的方法修改而来³⁴。
5. 用PBS洗涤神经元3次。
6. 用含5%正常山羊血清的PBS进行封闭。
7. 在4 °C条件下，用小鼠抗淀粉样β免疫球蛋白G（IgG）（1:50）及含1%牛血清白蛋白的PBS溶液孵育神经元，过夜。
8. 用PBS洗涤神经元3次。
9. 在室温下，用荧光标记的二抗（1:400）及含1%牛血清白蛋白的PBS溶液孵育神经元2小时。
10. 用PBS洗涤神经元3次，然后使用水溶性封片剂封片。
11. 利用倒置显微镜B配备的40X干镜，采集荧光图像及斜照明下的明场图像。

3. 轴突免疫染色²⁷

1. 按照步骤 1.3.3 中所述，在培养的神经元固定后，用 PBS 洗涤神经元 3 次。
2. 将神经元与小鼠抗 tau-1 IgG（1:500）、兔抗微管相关蛋白 2（MAP2）IgG（1:500）在含 5% 正常山羊血清和 0.3% t-辛基苯基聚乙二醇的 PBS 中，于 4 °C 过夜孵育。
3. 用 PBS 洗涤神经元 3 次。
4. 将神经元与荧光标记的二抗（1:400）及 0.3% t-辛基苯基聚乙二醇在 PBS 中室温孵育 2 小时。
5. 用 PBS 洗涤神经元 3 次，然后使用水溶性封片剂封片。
6. 在倒置显微镜 A 上使用 20× 干镜采集荧光和微分干涉差（DIC）图像。

4. 活细胞成像²⁷

1. 按照步骤 1.1.1 所述，用 500 μL 多聚赖氨酸（PDL，5 μg/mL）包被玻璃培养皿。
   注意：本实验方案中使用的是自制玻璃培养皿。也可使用市售的玻璃培养皿进行活细胞成像。自制玻璃培养皿的制备方法如下：1）使用手动手动打孔器在 35 mm 培养皿底部中央打一个直径约 1.4 mm 的孔；2）用硅胶将盖玻片（直径 22 mm）粘附在培养皿底部。
2. 按照步骤 1.1.2 所述，用蒸馏水洗涤培养板，并在玻璃培养皿中以每皿 3 × 10⁴ 个细胞的密度，使用培养基 A 培养皮层神经元，具体操作见步骤 1.2。
3. 细胞培养 4 天后，更换为 2 mL 新鲜的培养基 B，并将培养皿转移至倒置显微镜 A 上。在 37 °C、含 10% CO₂ 的湿润环境中继续培养。

5. 胞吞作用实验

1. 按照步骤 1.2 所述培养小鼠皮层神经元。
2. 四天后，将培养基更换为 100 μL 含 20 μM 荧光膜探针的新培养基 B，孵育 1 分钟。
3. 加入 1 μL 0.05 mM 的聚集态 Aβ1-42（终浓度 0.5 μM）或溶剂对照（蒸馏水）溶液，并用移液器轻轻混匀，孵育 20 分钟。
4. 移除培养基，并用预热至 37 °C 的培养基 B 洗涤孔板两次。
5. 按照步骤 1.3.3 和 1.3.4 所述对神经元进行固定、洗涤和封片。
6. 使用倒置显微镜 A 配备 63X 油镜采集荧光和微分干涉差（DIC）图像。
7. 使用图像分析软件定量每个健康生长锥中荧光膜探针阳性区域的密度。

6. 基因转染

1. 按照步骤1.2所述方法制备皮层神经元。完成步骤1.2.1至1.2.10后，以178 × g离心3分钟。
2. 弃去上清液，加入4 mL无Ca²⁺和无Mg²⁺的Hanks平衡盐溶液（CMF-HBSS），并通过移液混匀。
3. 以178 × g离心细胞3分钟。
4. 弃去上清液，加入4 mL CMF-HBSS，并通过移液混匀。接着，按照步骤1.2.10所述方法计算细胞密度。
5. 将5 × 10⁶个细胞转移至1.5 mL离心管中，以1,677 × g离心1分钟。
6. 弃去上清液，加入100 μL含补充剂的转染溶液和3 μg编码EGFP或EGFP-AP180 C末端的DNA质粒，通过移液混匀。
7. 将上述溶液（步骤6.6）转移至认证过的电穿孔比色皿中，并根据制造商说明书使用电穿孔仪进行转染。
8. 转染后立即向比色皿中加入500 μL培养基A，然后使用认证过的移液器将溶液转移至1.5 mL离心管中。接着，按照步骤1.2.10所述方法计算细胞密度。
9. 按照步骤1.2.11和1.2.12所述方法，在8孔培养板中以每孔0.8 × 10⁴个细胞的密度培养细胞。
10. 细胞培养4天后，按照步骤1.3所述方法进行塌陷实验。

结果

在本实验方案中，Aβ1-42 在使用前于 37 °C 孵育 7 天，因为 Aβ1-42 的孵育是产生毒性形式所必需的^27,28,30,35。经过此孵育后，观察到 Aβ 的聚集形式（图 1A）。已有报道表明，类似的 Aβ1-42 孵育可产生 Aβ 的纤维化形式³⁶。在用这种聚集态的 Aβ1-42 处理后，使用针对 Aβ 毒性寡聚体的抗体进行免疫染色^35,37，并在培养的神经元上检测到阳性染色信号（图 1B）。综合上述结果，该孵育方案可生成 ...

讨论

本研究中描述的实验方案使得在Aβ1-42处理后对轴突生长锥中的早期现象进行观察成为可能。Aβ1-42在处理20分钟内即诱导轴突生长锥发生内吞作用，并在1小时内观察到生长锥塌陷。这种内吞作用可能由网格蛋白介导。通过使用该实验方案，已证实抑制网格蛋白介导的内吞作用可防止原代培养神经元中由Aβ1-42诱导的生长锥塌陷和轴突变性²⁷。此外，抑制网格蛋白介导的内吞作用也能减轻体内由Aβ1-42诱导的轴突变性及记忆功能障碍in vivo²⁷。这些结果表明，网格蛋白介导的内吞作用是预防阿尔茨海默病（AD）的一个有前景的治疗方向。

该方案源自用于轴突生长排斥因子（如神经导向蛋白3A和ephrin-A5）的塌陷实验^16,17,18,19

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ddY 小鼠	SLC
八孔培养板	Falcon	354108
聚-D-赖氨酸	Wako	168-19041
培养基，Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
马血清	Gibco	26050-088
葡萄糖	Wako	049-31165
L-谷氨酰胺	Wako	074-00522
0.05% 胰蛋白酶	Gibco	25300-054
DNase I	Worthington	DP
大豆胰蛋白酶抑制剂	Gibco	17075-029
孔径为 70 µm 的滤器，细胞筛	Falcon	352350
B-27 添加剂	Gibco	17504-044
CO2 培养箱	Astec	SCA-165DS
淀粉样蛋白 β1-42	Sigma-Aldrich	A9810
多聚甲醛	Wako	162-16065
蔗糖	Wako	196-00015
水性封片剂，Aqua-Poly/Mount	polysciences	18606-20
倒置显微镜 A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	连接 AxioCam MRm、加热单元 XL S、CO2 模块 S1 和温控模块 S1
Plan-Apochromat 20x 物镜	Carl Zeiss	420650-9901
Plan-Apochromat 63x 物镜	Carl Zeiss	440762-9904
物镜，CFI Plan Apo Lambda 40X	Nikon
抗 MAP2 IgG 抗体	Abcam	ab32454
抗 tau-1 IgG 抗体	Chemicon	MAB3420
抗淀粉样蛋白 β 抗体	IBL	10379	克隆号 11A1
正常山羊血清	Wako	143-06561
牛血清白蛋白	Wako	010-25783
辛基苯基聚氧乙烯醚	Wako	169-21105
与 AlexaFluor 594 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体	Invitrogen	A11032
与 AlexaFluor 488 标记的山羊抗兔 IgG 抗体	Invitrogen	A11029
加热板	NISSIN	NHP-M30N
盖玻片	Fisher Scientific	12-545-85
35 mm 培养皿	IWAKI	1000-035
硅酮 RTV	信越	KE42T
手动打孔器	Roper Whitney	编号 XX
荧光膜探针 FM1-43FX	Invitrogen	F35355
无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hanks 平衡盐溶液	Gibco	14175-095
转染溶液，Nucleofector 溶液	Lonza	VPG-1001
电穿孔仪，Nucleofector I	Amaxa
倒置显微镜 B	Keyence	BZ-X710
图像分析软件，ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/