Summary
एक microbioreactor प्रणाली में विभिंन स्थितियों के तहत ४८ समानांतर सेल संस्कृतियों के समवर्ती आपरेशन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । सेल कल्चर प्रोसेस, हार्वेस्ट और बाद में एंटीबॉडी titer एनालिसिस बताए गए हैं ।
Abstract
स्वचालित अतिसूक्ष्म (15 मिलीलीटर) सेल संस्कृति इंजीनियरों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है । वे प्रयोगात्मक शर्तों की एक विस्तृत विविधता के एक साथ निष्पादन की सुविधा है, जबकि संभावित प्रक्रिया परिवर्तनशीलता ंयूनतम । इस दृष्टिकोण के अनुप्रयोगों में शामिल हैं: क्लोन स्क्रीनिंग, तापमान और पीएच बदलाव, मीडिया और पूरक अनुकूलन । इसके अलावा, छोटे रिएक्टर संस्करणों के प्रयोगों के बड़े डिजाइन कि स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए अनुकूल हैं । यह ऊपर की प्रक्रियाओं को काफी स्केल-अप से पहले अनुकूलित किया जा करने की अनुमति देता है, जहां प्रयोग समय और आर्थिक बाधाओं के कारण क्षेत्र में अधिक सीमित है । स्वचालित अतिसूक्ष्म के लिए इस तरह के एक शेक कुप्पी या स्पिनर कुप्पी के रूप में पारंपरिक छोटे पैमाने पर सेल संस्कृति इकाइयों, पर विभिन्न लाभ प्रदान करते हैं । हालांकि, के दौरान पायलट स्केल प्रक्रिया विकास महत्वपूर्ण देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि इन लाभों का एहसास कर रहे है लिया जाना चाहिए । जब देखभाल के साथ चलाने के लिए, सिस्टम उच्च स्तर स्वचालन सक्षम कर सकते हैं, चर के एक उच्च संख्या के साथ डो के चलाने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है और जब एक पोषक तत्व विश्लेषक या सेल काउंटर के साथ एकीकृत नमूना समय को कम कर सकते हैं । विशेषज्ञ-व्युत्पंन अनुमानियों के एकीकरण यहां प्रस्तुत वर्तमान स्वचालित अतिसूक्ष्म के साथ, आम नुकसान है कि सार्थक परिणाम बाधा कम कर सकते हैं । चरम में, यहां रखी सिद्धांतों का पालन करने में विफलता उपकरण नुकसान है कि महंगी मरंमत की आवश्यकता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, microbioreactor प्रणालियों छोटे संस्कृति सेल संस्कृति की स्थिति का लक्षण वर्णन करना मुश्किल मात्रा में है । संख्या और नमूनों की मात्रा में लिया-प्रक्रिया बैच मोड संस्कृति में सीमित है के रूप में ऑपरेटिंग वॉल्यूम 10 मिलीलीटर से नीचे गिर नहीं कर सकता । इस विधि अतिसूक्ष्म के लाभ और कमियों पर चर्चा करेंगे ।
Introduction
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) पहले १९७५1में माउस hybridoma कोशिकाओं में उत्पादित किया गया । तब से, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन के विकास में वृद्धि हुई है मानवीयकरण mAbs के लिए जगह ले ली है vivo सुरक्षा और प्रभावकारिता2,3,4में वृद्धि हुई है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन प्रक्रियाओं के अधिकांश आसानी जिसके साथ वे सीरम मुक्त मीडिया के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए चीनी हंसटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं को रोजगार, उनके समान एक सहज मानव की है कि इसी तरह के बाद अनुवाद संशोधनों के साथ प्रोटीन का उत्पादन करने की क्षमता प्रोटीन और मेजबान कोशिकाओं के रूप में उनकी निर्भरता5,6।
मांग तेजी से उत्पाद देने के लिए बढ़ रहा है, और लगातार गुणवत्ता के साथ बड़ा रोगी आबादी के लिए । आर्थिक लाभ के अलावा, mAbs द्वारा इलाज किया रोगों की प्रदर्शनियों की वृद्धि, जो अब स्व-प्रतिरक्षित रोग, बाद प्रत्यारोपण जटिलताओं, गठिया, और7कैंसर भी शामिल है । आधुनिक वाणिज्यिक मॉब उत्पादन लाइनों के लिए औसत पैदावार आम तौर पर 5-6 g/L की सीमा में है और5वृद्धि जारी है । भाग में, यह है चो सेल इंजीनियरिंग के माध्यम से पूरा किया गया है और बेहतर उत्पादन लाइन उच्च प्रवाह का उपयोग कर स्क्रीनिंग8प्रतिक्रिया । हालांकि, प्रोटीन के उत्पादन में सबसे अधिक वृद्धि की प्रक्रिया में सुधार के लिए जिंमेदार ठहराया गया है, मीडिया अनुकूलन, सेल संस्कृति की स्थिति में प्रगति सहित, और बेहतर खिला रणनीतियों7,9,10। पोषक तत्वों की पूरकता न केवल उचित सेल विकास के लिए बल्कि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन के कुशल उत्पादन के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, कोशिकाओं विशिष्ट पोषक तत्वों के stoichiometric अलावा की आवश्यकता होती है, रणनीति अनुकूलन6,11खिलाने के लिए अतिरिक्त समझ की आवश्यकता होती है । पारंपरिक अनुकूलन तरीकों व्यक्तिगत मीडिया घटक अनुमापन और मिश्रण डिजाइन के साथ मीडिया सम्मिश्रण शामिल हैं । हालांकि, इन तरीकों समय लगता है, श्रम गहन, और मानव त्रुटि12,13के साथ जुड़े जोखिम शामिल हैं ।
मीडिया अनुकूलन अध्ययन पहले से हिला कुप्पी और 1-2 एल प्रतिक्रियाएं जो कच्चे माल और मानव पूंजी के मामले में महंगा हो सकता है नकारात्मक स्तर तक पर भरोसा किया । Microplates भी इस्तेमाल किया गया है लेकिन इन तरीकों सीमित दरिद्रता प्रदान करते हैं । इसके अलावा, यह अभी भी एक से अधिक समय लेने वाली रन की आवश्यकता हो सकती है कि बैच-से-बैच परिवर्तनशीलता जो CQA मीडिया संरचना और खिला रणनीति14,15,16के कारण परिवर्तनशीलता अस्पष्टता परिचय । इस प्रकार, उच्च प्रवाह और अति सुसंगत समानांतर प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए की जरूरत17,18,19,20उभरा ।
पारंपरिक पीठ पैमाने पर जैव प्रतिक्रिया (0.5-5 एल) के संचालन के साथ जुड़े महत्वपूर्ण खर्च के साथ, microbioreactors जैविक रूप से प्राप्त दवाओं के उत्पादन का आकलन करने के लिए एक लागत को कम करने के विकल्प प्रदान करते हैं । 21 बेंच स्केल उभारा-टैंक प्रतिक्रिया भरोसेमंद और संवेदी arrays के माध्यम से घने डेटा प्रदान कर रहे हैं । प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणालियों आपरेशन के आसान निरीक्षण के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, विधानसभा, अंशांकन, सफाई, श्रम लागत, सब्सट्रेट लागत, और नसबंदी आवश्यकताओं को बेंच-स्केल उभारा-टैंक विरोधी प्रतिक्रियाएँ महँगी और परिश्रम करने के लिए गहन श्रम करते हैं. हिला कुप्पी और microtiter प्लेटें बड़े पैमाने पर प्रतिक्रिया के साथ जुड़े लागत और श्रम समस्याओं में से कुछ को हटा दें, लेकिन इन विकल्पों प्रसंस्करण शर्तों पर कमजोर नियंत्रण प्रदान करते हैं और कम घनत्व डेटा का उत्पादन, अक्सर ही अंत बिंदु माप. 22
वैकल्पिक रूप से, microbioreactors सेल लाइन और ऊपर की प्रक्रिया के विकास के लिए एक स्केल-डाउन दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए एक छोटे से काम की मात्रा का उपयोग । microbioreactor प्रयोगों के पैमाने पर काफी बिजली, सब्सट्रेट, श्रम, अंतरिक्ष, और उपयोगिताओं के कम उपयोग के माध्यम से लागत चल कम कर सकते हैं. 23 Microbioreactors कि वे अपने आकार के कारण संभाल करने के लिए आसान कर रहे है में हिला कुप्पी की तरह हैं, लेकिन वे अपने पीएच, तापमान, भंग ऑक्सीजन के ऑनलाइन प्रतिक्रिया नियंत्रण के माध्यम से पारंपरिक बेंच पैमाने पर प्रतिक्रिया के लाभ बनाए रखने, और एसिड/ खपत के रूप में अच्छी तरह से उनकी वास्तविक समय बंद गैस संरचना सहित गुणवत्ता मानकों के डेटा उत्पादन । Microbioreactor स्केल उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग क्षमता है, जो क्लोन चयन और प्रक्रिया के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है के लिए अनुमति देता है । 24
उंनत अतिसूक्ष्म प्रतिक्रिया चो सेल संस्कृति प्रक्रिया लक्षण वर्णन और18विकास के लिए एक प्रभावी उपकरण हो दिखाया गया है । इस के साथ साथ, एक स्वचालित ambr15 प्रणाली, समानांतर में ४८ microbioreactors से मिलकर, कि अध्ययन के ऊपर पैमाने में शास्त्रीय उभार टैंक रिएक्टरों के तुलनीय होना दिखाया गया है,25 एक पूर्व काम है कि मीडिया को अनुकूलित के अनुरूप तरीके से इस्तेमाल किया गया था एक चो-DG44 सेल लाइन के लिए संरचना एक मॉडल chimeric IgG16उत्पादन । विकास और titer पर बदलती मीडिया स्थितियों के प्रभाव की तुलना की गई, और विश्लेषण किया गया । इस पत्र में microbioreactor प्रणाली चलाने के लिए एक सामान्य दिशानिर्देश और क्रूड मीडिया के नमूनों का विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है.
Protocol
1. सीड ट्रेन का विस्तार
नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है 1 मिलीलीटर रिकॉमबिनेंट DG44 चो सेल स्टॉक्स कि ~ 3 x 107 कोशिकाओं/एमएल के एक घनत्व पर संग्रहित किया गया है । कमजोर पड़ने और व्यक्तिगत चो सेल लाइनों के लिए समय सीमा भिंन होगा । पहले से इस्तेमाल किया और तदनुसार समायोजित करने के लिए सेल लाइन के विकास घटता उपाय । कोशिकाओं को शुरू में पिघला हुआ कुप्पी में और बाद में एक स्पिनर कुप्पी में स्थानांतरित कर रहे हैं । शेक कुप्पी और स्पिनर microbioreactors की संख्या है कि चलाने के लिए और लक्ष्य बीज घनत्व के आधार पर प्रयोग के लिए आवश्यक कुप्पी की संख्या का निर्धारण ।
- एक ३७ ° c पानी स्नान में डुबोकर चो कोशिकाओं की तेजी से गल स्टॉक शीशी (ओं) केवल बर्फ का एक छोटा सा अभिजात्य रहता है । ७०% इथेनॉल समाधान और एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक का उपयोग कर शीशी के बाहर दूषित । एक सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण ।
- फिर से कोशिकाओं को निलंबित धीरे ऊपर और नीचे pipetting और 1 मिलीलीटर हस्तांतरण करने के लिए एक बाँझ १२५ मिलीलीटर वेंट हिला कुप्पी युक्त 29 मिलीलीटर पूर्व गर्म मीडिया 8 मिमी L-glutamine और 1x पेनिसिलिन/Streptomycin के साथ पूरक ।
नोट: जब तक अंयथा इंगित, इस प्रोटोकॉल में शब्द "मीडिया" इसके बाद OptiCHO मीडिया के रूप में परिभाषित किया जाएगा । - प्लेस एक मशीन में शेक कुप्पी (ओं) ३७ डिग्री सेल्सियस और 8% सह2पर बनाए रखा । १३० rpm की गति से कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक कक्षीय शेखर का प्रयोग करें ।
- निगरानी व्यवहार्य सेल घनत्व (वीसीडी) हर दिन एक स्वचालित कोशिका गिनती डिवाइस का उपयोग कर या एक hemocytometer और trypan नीले रंग के साथ मैंयुअल रूप से । उपसंस्कृति (पतला) ७२ घंटे ताजा मीडिया में टीका के बाद (पूर्व-मीडिया गर्म करने के लिए ३७ ° c हर बार यह कोशिकाओं को जोड़ा जाना चाहिए) ऐसे कि अंतिम मात्रा १२५ मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी में १०० मिलीलीटर है । एक ही शर्तों पर मशीन स्पिनर संस्कृतियों ७० rpm की गति पर कुप्पी संस्कृतियों शेक के लिए इस्तेमाल किया ।
नोट: उपसंस्कृति के बाद, कोशिकाओं 0.7 की एक घनत्व पर होना चाहिए-1 x 106 कोशिकाओं/ सुनिश्चित करें कि अंतिम घनत्व नीचे नहीं है ०.५ x 106 कोशिकाओं/ ९६ ज के बाद उपसंस्कृति यदि स्पिनरों में टीका के लिए लक्ष्य कोशिका घनत्व तक नहीं पहुँचा जा सकता. - तीन दिन (इनोक्युलम तैयारी करने के लिए एक दिन पहले), ≥ ९०% व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए स्पिनर-कुप्पी (एस) के लिए ताजा, पूर्व गर्म मीडिया जोड़ें । १२५ मिलीलीटर कुल मात्रा से अधिक नहीं है । 6
2. स्वचालित microbioreactor प्रणाली रनिंग
आवश्यकताएँ: उपयोगकर्ता के निर्माता से उचित प्रशिक्षण प्राप्त होना चाहिए और सुरक्षा और ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए शर्तों के साथ परिचित होना चाहिए ।
- कक्ष काउंटर से प्रारंभ करना और कनेक्ट करना
- सिस्टम ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर को प्रारंभ । सॉफ्टवेयर खोलने से पहले, सुनिश्चित करें कि सेल काउंटर ( सामग्री की तालिकादेखें) संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ चल रहा है । सेल काउंटर प्रणाली के साथ एकीकृत है ।
- सॉफ़्टवेयर खोलने से पहले सेल काउंटर दूरस्थ कनेक्शन से कनेक्ट करें । दूरस्थ डेस्कटॉप आइकन पर क्लिक करें और पर क्लिक करें "कनेक्ट." एक बार जब दूरस्थ डेस्कटॉप कनेक्टेड है, तो सेल काउंटर सॉफ़्टवेयर खोलें । एक नया एजेंट पैक स्थापित करें, trypan नीले अपशिष्ट खाली और प्रणाली प्राइम ।
- दूरस् थ कनेक् शन को छोटा करें और नया प्रयोग बनाने के लिए टें पलेट के रूप में मौजूदा प्रयोग का उपयोग करते हुए सूक्ष् म वाला प्रतिक्रिया सॉफ़्टवेयर खोलें । नाम और सहेजें प्रयोग । सुनिश्चित करें कि स्वचालित सेल काउंटर सॉफ़्टवेयर में स्थिति टैब के अंतर्गत कनेक्टेड है । स्थिति भी सेल काउंटर सॉफ्टवेयर पर जांच की जा सकती है ।
- प्लेटें और लोडिंग जहाजों को परिभाषित करना
नोट: संस्कृति स्टेशनों और डेक पर उपभोग्य सामग्रियों और रिएजेंट की ओरिएंट लोडिंग के लिए 1 चित्रा को देखें । दबाना प्लेटों का उपयोग करने से पहले (ठोस सामग्री के लिए इस्तेमाल किया) एक गुरुत्वाकर्षण चक्र पर autoclaved किया जाना चाहिए ।- एक रन शुरू करने से पहले, सॉफ्टवेयर के नकल अनुभाग में चलाने के दौरान इस्तेमाल प्लेटें परिभाषित करें । नाम प्रत्येक थाली इस्तेमाल किया और microbioreactor संस्कृति स्टेशन पर एक डेक के लिए प्रत्येक थाली नामित ।
- मीडिया चार्ज और संस्कृति स्टेशन के नामित डेक पर जगह के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें । 1 मिलीलीटर और 4 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप बक्सों को अनुभाग में चित्र 1में दर्शाई गई के रूप में रखें ।
- कल्चरल स्टेशन के संबंधित डेक पर 24-वेल टीका प्लेट लगाएं । 1 डेक पर एक अच्छी तरह 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) प्लेट प्लेस । 2 डेक पर एक अच्छी तरह से 1 मीटर NaOH प्लेट प्लेस और 24 डेक पर अच्छी तरह से antifoam प्लेट 7 (पदों के रूप में चित्रा 1में संकेत दिया) । डेक नंबर सॉफ्टवेयर में "नकल" टैब के तहत दिखाए diagrammatically हैं ।
- (sparger से सुसज्जित) सुरक्षा कैबिनेट हुड के अंदर संस्कृति जहाजों खोलना । संस्कृति स्टेशन के प्रति जगह बारह बाँझ संस्कृति वाहिकाओं । जहाजों के शीर्ष पर autoclaved दबाना प्लेट रखें । सुनिश्चित करें कि आवेषण में छेद सरगर्मियों के लिए प्रदान की सभी आसान स्थान के लिए एक ही दिशा का सामना ।
नोट: एक स्थायी मार्कर का उपयोग करना, संस्कृति स्टेशन में उन्हें रखने के लिए समय बचाने के लिए और फसल के समय भ्रम से बचने के लिए पहले कल्चर जहाजों को वर्गीकृत । - क्लैंप प्लेट ओ-रिंगों पहले भाग के लिए नीचे दोहराया autoclaving के बाद पहनते हैं, इसलिए ध्यान से उंहें जांच से पहले autoclaving करने के लिए प्रत्येक प्रयोग । पीठ के रूप में एक बाँझ दबाना थाली रखने के मामले में ओ-अंगूठी विफलता की सिफारिश की है ।
- प्रत्येक पिन सुनिश्चित सुरक्षित रूप से डाला जाता है, दबाना प्लेटों के शीर्ष पर हलचल प्लेट रखें । प्रदान की शिकंजा और knobs के साथ दबाना प्लेटें सुरक्षित । knobs कस जब तक वे हाथ तंग कर रहे हैं । क्लैंप प्लेट की भी नियुक्ति के लिए वैकल्पिक रूप से बाएँ और दाएँ knobs कस.
नोट: यदि दबाना सतह के खिलाफ फ्लश नहीं है या अगर क्लैंप प्लेट के अंत में शिकंजा असमान रूप से कड़ा कर रहे हैं, जहाजों ऑक्सीजन भंग अनुभव होगा (क्या) नियंत्रण समस्याओं । यदि ये समायोजन करना समस्या को दूर नहीं करते हैं, तो प्लेटों की अपूर्ण सीलिंग के रूप में ओ-रिंग्स की जांच करना संस्कृति की अकुशल बक को जन्म दे सकता है ।
- स्वचालित कुटीर प्रतिक्रिया सॉफ्टवेयर रनिंग
नोट: संपादित करें या नया चरण बनाने के लिए "प्रक्रिया चरण" टैब का उपयोग करें । कदम व्यक्तिगत रूप से शुरू करने और किसी भी प्रक्रिया को रोकने के लिए क्रमादेशित होना चाहिए । नया चरण बनाने के लिए प्रक्रिया चरण टैब के अंतर्गत "कदम डालें" बटन पर क्लिक करें या उस चरण को संपादित करने के लिए किसी मौजूदा चरण पर डबल क्लिक करें. कार्यक्रम कदम दस प्रमुख वर्गों में विभाजित हैं: स्टार्टअप, मीडिया चार्ज, Antifoam इसके अलावा, DO/पीएच नियंत्रण, पृष्ठभूमि आधार परिवर्धन, रुका हुआ पीएच, टीका, 5x सेल गणना, 10x सेल गणना, पोषक तत्व विश्लेषक नमूना और संस्कृति स्टेशन बंद । रन अवधि आमतौर पर 7-9 दिनों के बीच है जब बैच मोड में चलाते हैं ।- सिस्टम initializes और उचित जहाजों की उपस्थिति के लिए जाँच करता है । संस्कृति वाहिकाओं के साथ प्रदान की बारकोड स्कैन । एक ही बारकोड खाली वाहिकाओं या उपयोग नहीं किया जा रहा वाहिकाओं के साथ संस्कृति स्टेशनों के लिए लागू किया जा सकता है ।
- व्यवस्था नियंत्रण, बक और अंय कनेक्शन की जांच के बाद डिजाइन कार्यक्रम के साथ शुरू होगा ।
नोट: उपयोगकर्ता प्रोग्राम के साथ आगे बढ़ सकता है भले ही कोई त्रुटि उत्पन्न होती है, लेकिन उपयोगकर्ता के जोखिम पर ऐसा करते हैं और यदि आगे बढ़ने से सिस्टम को नुकसान नहीं पहुंचेगा और प्रयोग में रुकावट नहीं आएगी । उदाहरण के लिए, बक प्रयोग जो एक त्रुटि के रूप में दिखाई देगा, लेकिन दरकिनार किया जा सकता है में इस्तेमाल नहीं कुछ जहाजों के लिए बंद कर दिया जा सकता है ।
- स्टार्टअप और मीडिया चार्ज
- पहले दिन प्रणाली या मीडिया चार्ज स्थापना दिन संस्कृति समय के 0 दिन के रूप में नामित है ।
- स्टार्टअप अनुभाग के अंतर्गत, पहले लोड प्लास्टिक युक्तियाँ, दोनों 1 मिलीलीटर और 4 मिलीलीटर युक्तियाँ, के रूप में क्रमादेशित. यदि पहले से ही रखा, पर क्लिक करें जारी है । निर्दिष्ट डेक में मीडिया प्लेट, 1x पंजाबियों, 1 एम NaOH, antifoam प्लेट, मीडिया चार्ज प्लेट और टीका प्लेट प्लेस या, अगर पहले से ही रखा, प्रेस को अगले कदम के लिए कदम जारी रखें ।
- स्टार्टअप प्रोटोकॉल के भाग के रूप में, तापमान नियंत्रण शुरू और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित किया है । १००० rpm और DO/पीएच मॉनिटर पर सरगर्मी पर स्विच करें ।
- अगला, मीडिया चार्ज कार्यक्रम निष्पादित । स्वचालित microbioreactor प्रणाली के तरल हेंडलर मीडिया थाली से संस्कृति जहाजों के लिए कार्यक्रम में मैप के रूप में वितरण होगा । मीडिया जोड़ा गया अलग प्रक्रिया शर्तों के साथ OptiCHO है ।
नोट: एक 24 अच्छी तरह से प्लेट से दो कुओं की क्षमता के लिए एक संस्कृति पोत को भरने के लिए आवश्यक है (13 मिलीलीटर), के रूप में प्रत्येक अच्छी तरह से केवल मीडिया के 8 मिलीलीटर को समायोजित कर सकते हैं । एक अच्छी तरह से जब मीडिया तरल हेंडलर द्वारा चार्ज करने से पहले मिलाया जा रहा है ड्राइंग हवा को रोकने में 7-8 मिलीलीटर का उपयोग करें । - एक बार मीडिया चार्ज किया जाता है, पूर्व सेल antifoam के ३५ µ एल संस्कृति पोत को antifoam प्लेट से जोड़ा जाएगा । संस्कृति माध्यम के लिए 30 मिनट की अनुमति के लिए अच्छी तरह से मिलाया और ऑप्टिकल DO/पीएच सेंसर हाइड्रेटेड किया जा करने के लिए ।
नोट: antifoam की एक ही मात्रा में संस्कृति समय जब फोम का पता चला है भर में आवर्तक रूप से जोड़ा जाता है । 6 फोम नेत्रहीन का पता लगाया है, और रिएक्टर जहाजों फोम के लिए हर दिन की जांच कर रहे हैं । Antifoam का पता लगाने पर तुरंत जोड़ा जाता है । - क्या/पीएच नियंत्रण तो निगरानी शुरू करने के लिए और संस्कृति माध्यम के मत और पीएच रिकॉर्डिंग पर बंद है । ५०% के सेट बिंदु तक पहुंचने के लिए क्या करने की अनुमति दें, जो कम से 2 एच लेता है ।
- equilibration करने के बाद, पृष्ठभूमि आधार परिवर्धन पर बारी सभी संस्कृति जहाजों के लिए ७.१ का एक पीएच सेट बिंदु प्राप्त करने के लिए । अनुमति देते है और रात भर equilibrate और पूरी तरह से हाइड्रेटेड करने के लिए पीएच ।
- रुका हुआ पीएच-दिन 1 पीएच ऑफ़सेट
- अगले दिन (1 दिन के रूप में चिह्नित), रुका हुआ पीएच कदम जिससे चयन संस्कृति जहाजों का विश्लेषण कर रहे है और एक पीएच सुधार ऑफसेट निर्धारित है निष्पादित ।
नोट: पीएच जहाजों की संख्या offsetting के लिए नमूना लिया जा करने के लिए पीएच उपयोगकर्ता निर्धारित है । हर रिएक्टर पोत से एक नमूना आवश्यक नहीं हो सकता है अगर आप के लिए एक अच्छा प्रतिनिधित्व है प्रतिक्रियाकर्ता जनसंख्या । - नामित डेक पर नमूना ट्यूब धारक प्लेट प्लेस और खुला टोपियां के साथ माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूबों लोड और उन्हें बगल में tucked । तरल हेंडलर इस कार्यक्रम में मैप के रूप में ट्यूब में सेल संस्कृति द्रव के ६०० µ एल बांटना होगा ।
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तुरंत नमूना और उपाय है कि ठीक से नपेed किया गया है और जिसके लिए QCs चलाया गया है एक पोषक तत्व पर पीएच को हटाने (नीचे देखें, "दैनिक पोषक तत्व और Metabolite विश्लेषण") ।
नोट: नमूने को व्यक्तिगत रूप से चला रहे हैं, तुरंत ड्राइंग के बाद, पीएच परिवर्तन से बचने के लिए हवा के लिए जोखिम के कारण, के रूप में degassing2 के नमूने से पीएच परिवर्तन पैदा कर सकता है । - प्रत्येक नमूने के बाद "जारी रखें" दबाएं, अंयथा अगले चरण को निष्पादित नहीं किया जाएगा ।
- सॉफ्टवेयर में बाहरी, फ्लेक्स व्युत्पंन पीएच मूल्यों दर्ज करें, "संकलन" नमूना जहाजों के लिए स्वचालित रूप से ऑफसेट । मैंयुअल रूप से औसत ऑफसेट नमूना वाहिकाओं के लिए प्राप्त की है और टैब "पोत डेटा" के तहत उपयोगकर्ता पीएच ऑफसेट कॉलम के तहत संख्या दर्ज करें । औसत ऑफसेट तो सभी जहाजों के लिए लागू किया जाएगा । equilibrate के लिए पीएच को कम से 2-3 घंटे के लिए अनुमति दें, जिसके बाद संस्कृति वाहिकाओं inoculated जा सकता है ।
- अगले दिन (1 दिन के रूप में चिह्नित), रुका हुआ पीएच कदम जिससे चयन संस्कृति जहाजों का विश्लेषण कर रहे है और एक पीएच सुधार ऑफसेट निर्धारित है निष्पादित ।
- टीका
- वीसीडी को मापने के बाद, स्पिनर की पूरी सामग्री-कुप्पी (एस) एक बाँझ में स्थानांतरण, २५० मिलीलीटर शंकु के केंद्रापसारक ट्यूब और गोली कोशिकाओं के लिए केंद्रापसारक द्वारा 10 मिनट में कमरे के तापमान पर १४० x g । पुराने मीडिया और फिर से पर्याप्त ताजा मीडिया में इस तरह की है कि अंतिम घनत्व 1x10 होना चाहिए इनोक्युलम संस्कृति पोत को जोड़ने के बाद6 कोशिकाओं/
- एक बाँझ lidded 24 अच्छी तरह से थाली के नामित अच्छी तरह से निलंबित कोशिकाओं में जोड़ें. प्रत्येक अच्छी तरह से इनोक्युलम के 3 मिलीलीटर जोड़ें, जिसमें से 2 मिलीलीटर प्रत्येक संस्कृति पोत के लिए इनोक्युलम के रूप में निकाल दिया जाएगा ।
- हुड के अंदर नामित डेक पर इनोक्युलम प्लेट रखें । यह हुड के अंदर रखने से पहले ७०% शराब के साथ lidded इनोक्युलम प्लेट के बाहर स्प्रे करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- सेल स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर गिनती
- टीका के बाद, संस्कृति जहाजों के लिए कम से equilibrate एक घंटे के लिए चलो । एक घंटे के बाद, कार्यक्रम में 5x सेल गणना कदम पर अमल । 5x सेल गिनती पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने कारक इंगित करता है ।
नोट: 5x सेल गिनती शुरू में प्रयोग किया जाता है जब कोशिकाओं अंतराल चरण में हैं । कोशिकाओं को उनके घातीय चरण तक पहुंचने के बाद 10x सेल गिनती इस्तेमाल किया जाएगा । नमूना और मंदक संस्करणों के आधार पर साधन स्वतः कमजोर पड़ने कारक के लिए खातों और अंतिम मूल्य तदनुसार समायोजित कर देता है । - तरल हेंडलर पहले सेल काउंटर करने के लिए ४८० µ एल का कहना है कि कोशिका के अलावा कप से सेल संस्कृति तरल पदार्थ के µ एल के बाद प्याला । सेल गिनती तो स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर पढ़ा है । यह कदम सभी जहाजों के लिए दोहराया जाता है ।
- सेल गिनती संस्कृति समय के दिन 1 के लिए अंतिम कदम है । क्या करना है और पीएच डेटा के साथ सेल गणना डेटा (व्यवहार्य कोशिका घनत्व और व्यवहार्यता) भी सॉफ्टवेयर द्वारा दैनिक दर्ज की गई है ।
नोट: लाइनों के कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए ७०% आइपीएस के साथ चलाने की अवधि के दौरान कम से कम दो बार सेल काउंटर कप साफ । प्रत्येक कक्ष संख्या के बाद रेखाएं और प्रवाह-कक्ष स्वचालित रूप से साफ़ हो जाते हैं ।
- टीका के बाद, संस्कृति जहाजों के लिए कम से equilibrate एक घंटे के लिए चलो । एक घंटे के बाद, कार्यक्रम में 5x सेल गणना कदम पर अमल । 5x सेल गिनती पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने कारक इंगित करता है ।
- रुका पीएच-दिन 2 पीएच ऑफसेट
- संस्कृति समय के 2 दिवस पर, दोहराने "रोका पीएच" जो प्रारंभिक रुका हुआ पीएच कदम के दौरान से नमूने थे के अलावा अंय संस्कृति वाहिकाओं का उपयोग कर कदम ।
नोट: रूकी हुई पीएच के लिए पोत आबादी की अधिक नमूना पीएच सुधार के लिए एक बेहतर ऑफसेट प्रदान करेगा । इसलिए, पिछले दिन से रुका हुआ पीएच के लिए इस्तेमाल एक ही जहाजों का नमूना नहीं है ।
- संस्कृति समय के 2 दिवस पर, दोहराने "रोका पीएच" जो प्रारंभिक रुका हुआ पीएच कदम के दौरान से नमूने थे के अलावा अंय संस्कृति वाहिकाओं का उपयोग कर कदम ।
- दैनिक पोषक तत्व तथा Metabolite विश्लेषण
- नमूनों के प्रयोग के अंत तक संस्कृति के 2 दिन से पोषक तत्वों के विश्लेषण के लिए लिया जाएगा और पोषक तत्वों का उपयोग कर विश्लेषक का विश्लेषण किया ।
- नामित डेक पर नमूना ट्यूब धारक प्लेट प्लेस और खुला टोपियां के साथ माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूबों लोड और उन्हें बगल में tucked । तरल हेंडलर कार्यक्रम में मैप के रूप में ट्यूब में सेल संस्कृति द्रव बांटना होगा ।
नोट: प्रारंभिक कुछ दिनों के लिए (दिन 2-4) संस्कृतिक पोत से लिए गए सैंपल की राशि ३०० µ एल. यह 1x पंजाबियों के तरल हेंडलर द्वारा तिरस्कृत के ३०० µ एल के साथ पतला है । यह संस्कृति की मात्रा के संरक्षण और 10 मिलीलीटर से नीचे छोड़ने के स्तर को रोकने के लिए किया जाता है । इसके अतिरिक्त, पहले कुछ दिनों के लिए पोषक तत्वों मूल्यों कमजोर पड़ने के बाद साधन पहचान रेंज के भीतर गिर जाते हैं । - पोषक तत्वों विश्लेषण करने के लिए विश्लेषक ट्रे में नमूने रखें ।
नोट: किसी भी नमूने है कि एक ही दिन पर विश्लेषण नहीं किया जाएगा फ्रीज ।
- सिस्टम शट डाउन
- रन समाप्त करने के लिए, पहले आंदोलन के बाद तापमान नियंत्रण बंद कर दें । दूसरा, बंद करो/पीएच नियंत्रण और पृष्ठभूमि आधार परिवर्धन । तीसरा, अंय सभी नियंत्रणों को रोकें । अंत में, सिस्टम मॉनीटर को रोकें ।
- दबाना और प्लेटें हलचल और संस्कृति जहाजों को हटाने । एक एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछ के साथ संस्कृति स्टेशन के अंदर साफ । संस्कृति स्टेशन पर सुखाने प्लेटों प्लेस और उन में पेंच ।
नोट: सुखाने चक्र प्रणाली के ठंडा संस्करण के लिए आवश्यक है और सिस्टम के मानक संस्करण के लिए आवश्यक नहीं है । - कार्यक्रम पर 2 घंटे सुखाने चक्र को अंजाम । साफ क्लैंप प्लेटें ७०% Isopropyl शराब (आइपीए) के बाद ultrapure पानी का उपयोग कर लाइनों में संभव गाढ़ा तरल को दूर करने के लिए । हवा के साथ फ्लश करने के लिए किसी भी अवशिष्ट तरल निकालें ।
- एक बार सुखाने चक्र समाप्त हो गया है "बंद" पर प्रतिक्रियाकर्ता सॉफ्टवेयर में क्लिक करें ।
3. सेल कल्चर हार्वेस्ट
- कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए रिएक्टर जहाजों और गोली कोशिकाओं से १,९६२ x g पर सेल संस्कृति द्रव स्थानांतरण ।
- supernatant को नहीं । का उपयोग कर एक ०.२२ µm PVDF फिल्टर बाँझ कोशिका संस्कृति द्रव.
- Aliquot 1 titer विश्लेषण के लिए १.५ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में बाँझ कोशिका संस्कृति द्रव की मिलीलीटर । -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर ट्यूबों की दुकान । फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर काटा सेल संस्कृति द्रव के बाकी शुद्ध । 6
4. मापने आईजीजी Titers
नोट: यह चल रहा है और proteinA का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण का एक सरसरी सिंहावलोकन है । सभी परख पैरामीटर ( जैसे तापमान, पढ़ने के समय, rpm, आदि ) प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए ।
- प्रणाली को चालू करें और दीपक को गर्म करने के लिए अनुमति दें कम से 1 ज. नमूनों को फ्रीजर से गल और equilibrate को कमरे के तापमान पर निकालें.
- सिस्टम सॉफ्टवेयर में, 26 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेट तापमान निर्धारित किया है । प्रोटीन की संख्या को पहले से सोख लें नमूना मैट्रिक्स में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक युक्तियां (उदा. सेल मीडिया) कम से 30 मिनट के लिए ।
नोट: इष्टतम तापमान empirically निर्धारित करने की जरूरत है । 26 ° c का तापमान अब विश्लेषण समय के दौरान नमूना वाष्पीकरण को कम करने और साधन एक सुसंगत तापमान पकड़ करने के लिए (परिवेश के तापमान से ऊपर कई डिग्री जा रहा है) की अनुमति के लिए यहाँ प्रयोग किया जाता है । नमूने ≥ 10 मिनट के लिए नमूना मंच पर नमूना प्लेट की मशीन द्वारा माप करने से पहले चुना परख तापमान करने के लिए पूर्व equilibrated होना चाहिए । - एक प्रोटीन मानक वक्र एक ही एंटीबॉडी का उपयोग कर 10 मिलीग्राम/एमएल और प्रश्नपत्र में पतला नमूना मैट्रिक्स (यानी मीडिया) रेंज में है कि पता लगाया जा करने की जरूरत है का निर्माण ।
नोट: यह कमजोर पड़ने के कारण मैट्रिक्स प्रभाव को कम करने के लिए एंटीबॉडी के एक उच्च एकाग्रता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी एंटीबॉडी और प्रेरित एकत्रीकरण ध्यान केंद्रित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रत्येक नमूना प्लेट के लिए एक में थाली मानक वक्र चल बेहतर है । न्यूनतम, एक सकारात्मक नियंत्रण टिप-टू-टिप और प्लेट-टू-प्लेट परिवर्तनशीलता के लिए खाते में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक नए मानक वक्र प्रोटीन के प्रत्येक नए बहुत एक युक्तियां इस्तेमाल के लिए उत्पंन किया जाना चाहिए । - नमूना प्लेट डिजाइन (एक उदाहरण के लिए, कृपया चित्रा 2देखें) । एक प्रोटीन में एक परख है कि पुनर्जनन का उपयोग करता है, अप करने के लिए ८० नमूनों विश्लेषण किया जा सकता है, जो अज्ञात संस्कृति के नमूनों, मानकों, और नियंत्रण भी शामिल है । प्रत्येक थाली विश्लेषण के लिए, एक एकल प्रोटीन एक टिप प्लेट (कॉलम 1-10) भर में 10 नमूनों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, में एक पुनर्जनन चक्र के साथ एक नमूने के बीच ।
नोट: यह अनुशंसित है कि प्लेट (पंक्ति A) की संपूर्ण प्रथम पंक्ति को नकारात्मक नियंत्रण और संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाए. यहां पर चर्चा की परख में, पंक्तियां बी और सी दो सकारात्मक नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है; एक निचले और रैखिक प्रतिक्रिया की ऊपरी सीमा पर एक पर । यह नमूने का विश्लेषण करने से पहले प्रत्येक टिप नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के उपाय सुनिश्चित करता है । यह सेट अप भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर में संदर्भ घटाव सरल । शेष कुओं का प्रयोग तो अज्ञात नमूनों के लिए किया जाता है. यदि पंक्तियों में से एक में एक नमूना अंतर है, वहां एक मैट्रिक्स में है कि अच्छी तरह से टिप के सुखाने को रोकने के लिए होना चाहिए (यानी वेल्स A2 G2 के माध्यम से है, जबकि H2 नहीं है । सुनिश्चित करें कि H2 नमूना H3 करने के लिए आगे बढ़ने से पहले टिप सूखी नहीं है सुनिश्चित करने के लिए नमूने मैट्रिक्स शामिल हैं) । अंत में, कई प्लेटों का विश्लेषण करने के लिए एक सेट का उपयोग करके युक्तियाँ निकास नहीं है. हर थाली के लिए एक नया, गैर पुनर्जीवित सेट का उपयोग करने की सिफारिश की है । - धीरे से मिश्रण द्वारा विश्लेषण के लिए नमूने तैयार, या तो उलटा या pipetting द्वारा, ट्यूब के तल पर नमूना इकट्ठा करने के लिए एक पल्स स्पिन द्वारा पीछा किया. केंद्रित नमूनों के लिए, उपयुक्त कमजोर पड़ने का नमूना मैट्रिक्स में कमजोर द्वारा प्रतिकृति बनाएं ।
नोट: प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी के लिए बाध्यकारी के रेखीय रेंज एक जैव परत interferometry (BLI) माप दोनों एंटीबॉडी, परख शर्तों, और मैट्रिक्स द्वारा भिंन होगा । यह निर्धारित किया जाना चाहिए empirically पहले से सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त नमूना कमजोर पड़ने का उपयोग किया जाता है । - ९६-अच्छी तरह से संभव के रूप में परख समय करीब के रूप में नमूना प्लेटें तैयार करें । सुनिश्चित करें कि कुओं में से किसी में हवाई बुलबुले नहीं हैं । एक साफ पिपेट टिप के साथ या केंद्रापसारक द्वारा एयर बुलबुले निकालें ।
- प्रणाली में लोड प्लेट और डिफ़ॉल्ट "उत्थान के साथ उच्च संवेदनशीलता परख" डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में उपयोग कर परख चलाते हैं । एचटी डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण करें.
नोट: अगर प्लेटों बाधाओं के कारण समय से आगे तैयार किया जा रहे हैं, वाष्पीकरण को रोकने के लिए फिल्म के साथ सुरक्षित रूप से सील. अपेक्षित titers के आधार पर, अधिग्रहण दरों और समय को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । मार्गदर्शन के लिए मैनुअल का संदर्भ लें । - डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, संदर्भ घटाना और मानक वक्र का उपयोग कर अज्ञात नमूनों की एकाग्रता की गणना और प्रारंभिक ढलान (है) एक रैखिक बिंदु से बिंदु फिट के साथ समारोह.
Representative Results
महत्वपूर्ण प्रक्रिया मानकों और सेल ' संस्कृतियों आपरेशन भर में अन्य सेल संस्कृति मापदंडों की निगरानी, प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण पहलू है. सेल काउंटर और पोषक तत्व विश्लेषक के लिए पांच विशेषताएं है कि सेल विकास, पोषक तत्वों की खपत और शोधकार्य गठन की विशेषता का इस्तेमाल किया गया । सेल की गिनती सभी संस्कृति की स्थिति के लिए दैनिक प्राप्त किया गया । औसत व्यवहार्य सेल घनत्व और viabilities के रूप में उनके ± 1 एसडी अंतराल के साथ चित्रा 3 में देखा जाता है । पोषक तत्व और शोधकार्य प्रोफाइल भी एक ± 1 एसडी अंतराल के साथ संस्कृतियों के स्थिर चरण के माध्यम से दिखाया जाता है । इस प्रोफ़ाइल की ढलान औसत ग्लूकोज और glutamine खपत का प्रतिनिधित्व करता है, और स्तनपान कराने के उत्पादन, दरों । कुल मिलाकर, इन परिणामों microbioreactor प्रणाली में इन विशेषताओं की निगरानी की व्यवहार्यता प्रदर्शित; साथ ही microbioreactor प्रणाली की क्षमता एक तंग सीमा के भीतर इन मापदंडों को बनाए रखने के लिए ।
सेल संस्कृतियों की कुल उत्पादकता एक proteinA के बाद एक सेंसर प्रणाली का उपयोग कर quantified था कटाई सेल संस्कृति मीडिया एक ०.२२ माइक्रोन PVDF फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया था । सेल के प्रति विशिष्ट उत्पादकता ०.८७ pg/सेल-डी से १.१५ pg/सेल-डी से लेकर चित्रा 4में देखी गई । इन परिणामों के आधार पर स्थितियों की एक विस्तृत सरणी के लिए मीडिया संरचना और खिला रणनीति है कि प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में एक ंयूनतम निवेश के लिए उत्पादित प्रोटीन की मात्रा को अधिकतम का चयन करने के लिए जांच की जा सकती है ।
चित्रा 1 : 4 संस्कृति स्टेशनों के साथ microbioreactor प्रणाली के लेआउट (सीएस) 12 रिएक्टर जहाजों प्रत्येक होने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : उदाहरण नमूना प्लेट सेट-अप proteinA पर पुनर्जनन प्रयोग के साथ एक बुनियादी quantitation के लिए-संवेदी प्रणाली । पंक्ति 1 (लाल "R") संदर्भ नमूना (यानी मैट्रिक्स अनुपस्थित analyte) के लिए आरक्षित है; पंक्ति 2 (aquamarine) मानकों का एक सेट है (सांद्रता µ g/एमएल में हैं); पंक्तियाँ 3 और 4 (नारंगी) निम्न और उच्च धनात्मक नियंत्रण ("PL" और "PH," क्रमशः) के सेट हैं; पंक्तियां 5 से 10 (जामुनी) में अज्ञात नमूने होते हैं; पंक्तियां 11 और 12 (धूसर) पुनर्जनन ("R") और बेअसर ("N") बफ़र्स के लिए प्रोग्राम-डिफ़ॉल्ट स्थितियां हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : एक) औसत व्यवहार्य सेल घनत्व और एक बैच की उंर से अधिक व्यवहार्यता प्रोफाइल । ± 1 एसडी भी microbioreactor प्रणालियों में सेल विकास के तंग नियंत्रण का संकेत करने के लिए दिखाया गया है । ख) ग्लूकोज और glutamine के लिए औसत पोषक तत्व प्रोफ़ाइल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्तनपान के लिए औसत शोधकार्य प्रोफ़ाइल । ± 1 एसडी भी microbioreactor सिस्टम में मीडिया संरचना पर तंग नियंत्रण का संकेत दिखाया है । (N = 3, तपसिल में सभी शर्तें चलाई गई थीं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : प्रतिनिधि बॉक्स-विभिंन मीडिया की स्थिति का औसत विशिष्ट उत्पादकता के भूखंड । (N = 3, तपसिल में सभी शर्तें चलाई गई थीं) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
स्वचालित सूक्ष्म प्रतिक्रिया प्रणाली चलाने के ठीक से और कुशलता से कई स्वचालित चरणों के समय पर निष्पादन शामिल है । सिस्टम चलाने का सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक सॉफ्टवेयर प्रोग्रामिंग है । यदि प्रोग्राम लिखते समय कोई त्रुटि हो, तो इस प्रयोग में गंभीर त्रुटियां हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रक्रिया में अप्रत्याशित परिवर्तन हो सकते हैं, खिलाने की रणनीति, नमूना रणनीति, या अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता जो अध्ययन के निष्कर्षों को अमान्य कर सकती है । प्रणाली चलाने का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू को जगह है और सही ढंग से दबाना प्लेट को मजबूत करने के लिए उचित नियंत्रण सुनिश्चित करना है । दबाना प्लेट असमान किया गया है कि सबसे आम संकेत 1, 6, 7 और 12 (कोने रिएक्टर जहाजों) जहाजों के लिए माप में अप्रत्याशित भिन्नता है । कुल मिलाकर अस्थिरता दबाना प्लेटों में गैस प्रवेश लाइनों में गैसकेट की एक ढीला इंगित करता है । इस परिदृश्य में कर सेट बिंदु तक पहुंचने में बाधा हो सकती है । एक अंय आम ख़तरा से बचने के लिए जब एक प्रयोग शुरू करने दे रहा है कोशिकाओं टीका कदम के दौरान भी लंबे समय बैठते हैं, उंहें बसने के कारण । कम समय कोशिकाओं बैठे खर्च करते हैं, कम मौका है कि उत्तरोत्तर कम इनोक्युलम कोशिका गिनती रिएक्टर जहाजों जो महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह है कि अनजाने में अध्ययन के परिणाम को नुकसान पहुंचा सकते है के लिए क्रमिक रूप से जोड़ रहे हैं । यह कई चरणों में inoculate करने के लिए बेहतर है, यानी inoculate प्रत्येक संस्कृति स्टेशन के बीच में ठहराव चरणों के साथ एक के बाद एक तो कोशिकाओं टीका थाली में 15 मिनट से अधिक समय के लिए नहीं बैठे हैं ।
दिन के लिए दिन के उपयोग के विषय में, बाँझ बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि प्रणाली एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में है, बाँझ में और हुड के बाहर अक्सर आंदोलन के कारण की गारंटी नहीं है । नतीजतन, डाकू में चला जाता है कि सब कुछ ७०% आइपीएल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए । दूसरे, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि न्यूनतम फोम संस्कृति के दौरान होता है; मीडिया बक और निकास लाइनों को रोकना, क्लैंप प्लेट के नुकसान के लिए अग्रणी और यहां तक कि कोर घटक नीचे कर सकते हैं । निवारक विरोधी फोम इसके अलावा कदम किसी भी सूक्ष्म प्रतिक्रिया कार्यक्रम डिजाइन में महत्वपूर्ण हैं । एक "बाहर फोम" यह प्रोटोकॉल सफाई निर्माताओं का पालन करें और दबाना प्लेटों की स्थाई क्षति को रोका जा सकता है लाभप्रद होगा की स्थिति में । वैकल्पिक रूप से, गैर sparged वाहिकाओं का उपयोग कम सेल घनत्व के लिए फायदेमंद हो सकता है या मात्रा अनुपात के लिए उच्च सतह के रूप में बैच मोड में चल रहा है जब भी एक sparger की कमी के साथ कुशल ऑक्सीजन सक्षम बनाता है. हालांकि, गैर sparged जहाजों के लिए उच्च कोशिका घनत्व या छिड़काव संस्कृतियों के लिए उपयोगी नहीं हो सकता है के रूप में सिर अंतरिक्ष ऑक्सीजन की बढ़ती खपत संस्कृतियों के साथ रखने के लिए अपर्याप्त है ।
वहां कई microbioreactor प्रणाली द्वारा प्रदान की लाभ कर रहे हैं, क्योंकि यह कई नियंत्रित संस्कृतियों के समानांतर में एक छोटे पैमाने पर हिला कुप्पी से अधिक नियंत्रण के साथ चलाने के लिए सक्षम बनाता है । 17 इसलिए, सिस्टम स्क्रीनिंग अध्ययन के निष्पादन की सुविधा, करता है, उच्च प्रवाह क्लोन अध्ययन और अभिकर्मक अध्ययन । स्वचालित तरल हैंडलिंग भी विश्लेषक के लिए विश्लेषक परिवर्तनशीलता कम कर देता है, जबकि एक साथ थकाऊ और समय से कम करने के लिए प्रशिक्षित कर्मियों के लिए गहन परिश्रम । जबकि वहां प्रणाली के लिए कई फायदे हैं, वहां कई महत्वपूर्ण नुकसान है कि विचार किया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, 15 मिलीलीटर की एक संस्कृति मात्रा में काफी सीमा-प्रक्रिया नमूना और अंतिम फसल सामग्री, और कई वैकल्पिक छोटे पैमाने पर (५०० एमएल तक) प्रतिक्रिया हाल ही में उपलब्ध हो गया है । प्रणाली के लिए एक हाल ही में प्रगति है जैव प्रोफ़ाइल नोवा बायोमेडिकल से 2 विश्लेषक, जो प्रक्रिया में सेल घनत्व और पोषक तत्व विश्लेषण के लिए नमूना मात्रा को कम करने के मुद्दे के नमूने के साथ स्वचालित अतिसूक्ष्म के एकीकरण के साथ प्रतिक्रिया . लाभ जल्दी सेटअप और लगभग कोई परिचालन बचत के लिए अग्रणी सफाई शामिल कर सकते हैं, लेकिन प्रयोज्य इकाइयों की लागत दीर्घकालिक परियोजनाओं के लिए विचार किया जाना चाहिए क्योंकि यह महंगा हो सकता है के लिए पुन: प्रयोज्य पारंपरिक प्रणालियों से इकाइयों की खरीद ।
इस पत्र में चर्चा की विधि बैच मोड सेल संस्कृति के लिए मुख्य रूप से उपयुक्त है, लेकिन उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । प्रत्येक संस्कृति स्टेशन तापमान के स्वतंत्र नियंत्रण है, जबकि करते हैं और पीएच व्यक्तिगत रिएक्टर जहाजों के स्तर पर विविध किया जा सकता है । Sartorius भी डो योजना सॉफ्टवेयर विशेष रूप से डिजाइन करने के लिए प्रयोग की अनुमति प्रदान करता है सूक्ष्म प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए सिलवाया सकता है । बड़े पैमाने पर डो नए निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अध्ययन मीडिया और पूरक अनुकूलन में मदद कर सकते हैं । हालांकि यहां इस्तेमाल नहीं, microbioreactor प्रणाली भी फेड बैच अध्ययन सक्षम बनाता है । सिस्टम अभी तक छिड़काव सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है । हालांकि, वहां सीमित अध्ययन और परीक्षण के लिए वर्तमान सूक्ष्म प्रतिक्रिया प्रणाली में छिड़काव सेल संस्कृति आपरेशन नकल गया है । 26 इस विधि सेल बसने के द्वारा उच्च घनत्व छिड़काव संस्कृतियों की नकल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । ऊंचाई जो करने के लिए प्लास्टिक रिएक्टर में डाला जाता है और निपटाने के समय को अनुकूलित द्वारा बदलती द्वारा, मीडिया और हटाया जा सकता है के लिए संस्कृति की फले मोड दर्पण मंगाया । इस विकासशील क्षेत्र में नए उत्पादों रहे है कि यहां प्रस्तुत प्रणाली अगर संस्कृति के छिड़काव मोड वांछित है से बेहतर काम कर सकते हैं ।
सारांश में, इस अध्ययन स्वचालित सूक्ष्म-प्रतिक्रिया और चो सेल संस्कृति के संचालन के लिए विश्लेषणात्मक जुड़े का उपयोग करने के लिए उत्पादन और एक मॉडल IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशेषताएं दर्शाता है । यह भूमिका पर जोर देती है छोटे पैमाने पर सूक्ष्म-प्रतिक्रिया के लिए उत्पादन में खेल विनिर्माण और सेल संस्कृति विकास और मीडिया स्क्रीनिंग पर उनके प्रभाव । जबकि वहां एक स्वचालित छोटे पैमाने प्रणाली का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं, पूरी तरह से अपने लाभ को समझने की प्रक्रिया और विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन आवश्यक है एहसास । यह अध्ययन एक स्वचालित अतिसूक्ष्म रिएक्टर प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक दिशानिर्देश के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करता है, कि विकसित और व्यक्तिगत अनुसंधान की जरूरत के अनुसार सुधार किया जा सकता है ।
Disclosures
अस्वीकरण: यह प्रकाशन लेखक के विचारों को दर्शाता है और एफडीए के विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए ।
Acknowledgments
लेखकों को विश्लेषणात्मक समर्थन वे प्रदान के लिए स्कॉट लुटे शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । आंशिक आंतरिक धन और इस काम के लिए समर्थन CDER महत्वपूर्ण पथ कार्यक्रम (सीए #1-13) द्वारा प्रदान किया गया था । इस परियोजना के भाग में इंटर्नशिप के लिए एक नियुक्ति द्वारा समर्थित किया गया/जैव प्रौद्योगिकी उत्पादों, अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन, ओक रिज विज्ञान और शिक्षा के लिए एक के माध्यम से संस्थान द्वारा प्रशासित के कार्यालय में अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम ऊर्जा और एफडीए के अमेरिकी विभाग के बीच समझौता एजेंसी ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
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