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在无细胞微乳液中重建细胞周期振荡 非洲爪蟾 卵母细胞提取物

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DOI：

10.3791/58240

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2018年9月27日

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1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

本文内容

摘要

我们提出了一种用于生成 体外 通过包封卵母细胞提取物在单细胞水平实现自我维持的有丝分裂振荡 非洲爪蟾 在油包水微乳液中。

摘要

在单细胞水平上实时测量振荡对于揭示生物钟的机制至关重要。尽管由大量细胞制备的提取物 Xenopus laevis 卵子在解析细胞周期进程背后的生化网络方面具有重要作用，尽管每个独立振荡器均可持续振荡，但其总体平均测量结果通常表现为阻尼振荡。这是由于在存在噪声的生物系统中，难以实现各个振荡器之间的完全同步。为了重建单个细胞中振荡器的动力学行为，我们开发了一种基于液滴的人工细胞系统，该系统能够在类似细胞的区室中包裹具有周期性活性的胞质提取物，从而重构有丝分裂周期。 Xenopus laevis 卵细胞。这些仅含细胞质的简单细胞可维持超过30个周期的持续振荡。为了构建含有细胞核的更复杂人工细胞，我们在体系中加入去膜精子染色质，以触发细胞核的自组装。我们观察到染色体周期性的凝缩/去凝缩以及核膜周期性的破裂/重建，类似于真实细胞中的行为。这表明有丝分裂振荡器能够准确地驱动多个下游有丝分裂事件。我们利用多通道延时荧光显微镜，在单个液滴中同时追踪了有丝分裂振荡器与下游过程的动力学变化。该人工细胞周期系统为定量操控和分析具有单细胞分辨率的有丝分裂振荡提供了一个高通量的研究框架，有望为细胞周期时钟的调控机制与功能提供重要见解。

引言

从……制备的细胞质提取物 Xenopus laevis 卵子因其卵母细胞体积大、细胞周期进程迅速，以及能够重建有丝分裂事件的能力，成为细胞周期生物化学研究中最主要的模型之一 体外1,2该系统已助力首次发现并从机制上表征了细胞周期调控中的关键因子，如促进成熟因子（MPF），以及下游有丝分裂过程，包括纺锤体组装和染色体分离。1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。该 非洲爪蟾 卵提取物还被用于深入解析细胞周期时钟的调控网络<....

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方案

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 细胞周期重建与检测所需材料的准备

  1. 利用Gibson组装克隆法构建securin-mCherry质粒DNA及mRNA纯化
    1. 通过聚合酶链式反应（PCR）和凝胶纯化制备三个DNA片段，包括pMTB2载体骨架、securin和mCherry21,22。
    2. 使用荧光分光光度计测定各片段浓度。将100 ng的载体骨架与securin和mCherry插入片段按1:1:1的分子比例混合，并加入去离子水使反应总体积调整至5 µL。
    3. 配制6 mL的5×等温组装反应缓冲液，包含3 mL的1 M Tris-HCl（pH 7.5）、300 µL的1 M MgCl2、600 µL的10 mM dNTP、300 µL的1 M DTT、1.5 g PEG-8000和20 mg NAD23。
    4. 将混合后的DNA片段加入15 µL的1×等温组装反应缓冲液中。在PCR反应管中于50 °C孵育15分钟。
    5. 制备0.8%琼脂糖凝胶，以10 V/cm的电压电泳，验证这些片段的退火效率。<....

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结果

在图2中，我们展示了该方案可在简单的无核细胞以及含有细胞核的复杂细胞中均产生有丝分裂振荡，其中振荡器驱动细胞核周期性地形成与变形。无核液滴在92小时的时间范围内可产生多达30个未衰减的有丝分裂振荡周期，这通过荧光报告蛋白securin-mCherry的周期性合成与降解得以体现（图2A）。Securin是后期促进复合物APC/C的底物。因此，securin-mCherry在后期的降解表明了APC/C的活性。

为了检测有丝分裂振荡器驱动下游有丝分裂事件的能力，我们向细胞质提取物中额外添加了去膜精子染色质、纯化的绿色荧光蛋白-核定位信号（GFP-NLS）以及Hoechst 33342染料。 图2B 显示了在自持性有丝分裂振荡器驱动下，细胞周期不同阶段——间期（蓝色条）和有丝分裂期（.......

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讨论

我们介绍了一种用于构建高通量人工细胞系统的新方法，该系统能够 体外 在单细胞水平上重建并长期追踪自持性细胞周期振荡。该方法的成功依赖于几个关键步骤。首先，需使用新鲜榨取的 非洲爪蟾 与已产出的卵相比，高质量的卵倾向于产生振荡活性维持时间更长的提取物。其次，将提取物封装于表面活性剂稳定的微环境中，对维持其振荡活性至关重要。第三，将油滴孵育于细管中，可使油滴限制为单层分布，便于图像处理和长期追踪。第四，在管内壁涂覆三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷作为抗黏附涂层以降低表面能，有助于保持提取物的活性。第五，用油密封管口可防止液滴流动，该封油方法还能防止蒸发，进一步保护提取物活性。上述措施共同提高了实验的成功率。 体外 液滴中稳健振荡的重建以及长期实验中对这些液滴的分割与追踪的准确性

为了制备微乳液液滴，我们采用了简单的涡旋法，该方法与一些其他研究中使用的方法类似29,30,

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

感谢Madeleine Lu构建securin-mCherry质粒，感谢Lap Man Lee 、Kenneth Ho和Allen P Liu 在液滴生成方面的讨论，感谢Jeremy B. Chang和James E. Ferrell Jr提供GFP-NLS质粒。本研究得到美国国家科学基金会（早期职业奖#1553031）、美国国立卫生研究院（MIRA #GM119688）以及斯隆研究奖学金的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Xenopus laevis 蛙Xenopus-I 公司
QIAprep 自旋微量制备试剂盒QIAGEN27104
QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250)QIAGEN28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒AmbionAM1340
BL21 (DE3)-T-1 感受态细胞Sigma-AldrichB2935
钙离子载体Sigma-AldrichA23187
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261有毒
三氯甲烷Sigma-Aldrich448931有毒
(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷
PFPE-PEG 表面活性剂Ran 生物技术公司008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare 谷胱甘肽 Sepharose 4B 微珠Sigma-AldrichGE17-0756-01
PD-10 柱Sigma-AldrichGE17-0851-01
VitroCom 微型中空玻璃毛细管VitroCom5012
Olympus SZ61 体视显微镜Olympus
Olympus IX83 显微镜Olympus
Olympus FV1200 共聚焦显微镜Olympus
NanoDrop 分光光度计ThermofisherND-2000
0.4 mL 扣盖微量离心管E&K Scientific485050-B
PureLink RNA 微量提取试剂盒ThermoFisher (Ambion)12183018A
Fisherbrand 模拟涡旋混合器Fisher Scientific2215365
ImarisBitplaneVersion 7.3图像分析软件

参考文献

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W.

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