本文介绍了一种高效建立西瓜与葫芦属植物间同种及异种嫁接的详细实验方案，并提供了用于研究冷响应微小RNA（miRNA）的组织取样、数据生成及数据分析方法。
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利用西瓜与葫芦的同种及异种嫁接研究冷响应微小RNA
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摘要
摘要
microRNA（miRNA）是一类内源性的小分子非编码RNA，长度约为20–24 nt，在植物的发育和适应过程中发挥重要作用。越来越多的证据表明，在嫁接这一农业实践中，某些miRNA的表达会发生改变；嫁接常被农民用于提高作物对生物和非生物胁迫的耐受性。与其他多数葫芦科作物（如西瓜）相比，葫芦具有更强的气候适应能力，因此成为西瓜最广泛使用的砧木之一。近年来高通量测序技术的进步为研究响应低温的miRNA及其在异源嫁接优势中的作用提供了重要机遇；然而，这需要以完善的实验流程为前提。本文提供了一套详细的实验方案，用于高效构建对低温敏感的西瓜与耐低温的葫芦之间的同源嫁接和异源嫁接体系，并包括组织取样、数据生成及数据分析的方法。本方案也可适用于其他植物嫁接系统，用于探究miRNA在热胁迫、干旱和盐胁迫等多种环境胁迫条件下的调控机制。
引言
嫁接作为一种农业技术已被长期应用，以提高作物产量及对生物和非生物胁迫的耐受性1,2,3。在异源嫁接体系中，优良的砧木可增强植物对水分和养分的吸收能力，提高对土传病原菌的抗性，并减轻金属毒性的不利影响4,5，从而赋予嫁接植株更强的生长势和更高的环境胁迫耐受性。在许多情况下，异源嫁接还可影响园艺植物的果实品质，改善果实风味并增加与健康相关化合物的含量6,7。研究发现，砧木与接穗之间植物激素、RNA、多肽和蛋白质的长距离运输是调控接穗植株生长发育重编程的基本机制8,9,10。嫁接技术已广泛应用于与环境适应相关的长距离信号传递和物质运输研究11。嫁接实验在明确检测受体组织或维管汁液中传递的分子，以及因信号传导引起的分子靶点的激活或抑制方面具有显著优势12。
非编码RNA是一类在细胞中发挥重要调控功能的RNA，已被报道在促进植物对非生物胁迫的适应过程中起作用13。miRNA是一类内源性的小分子非编码RNA，长度约为20–24 nt。研究表明，miRNA在植物多种生命活动过程中具有调控作用，例如茎的生长、侧根形成14,15,16、养分吸收、硫酸盐代谢与稳态17，以及对生物和非生物胁迫的响应18。最近研究发现，miRNA及其靶基因的表达与异源嫁接黄瓜幼苗的耐盐性相关19。在葡萄的品种间嫁接中，miRNA表达对干旱胁迫的响应表现出基因型依赖性20。
高通量测序技术的快速发展及其成本的不断降低，为农艺植物中miRNA调控的研究提供了重要机遇。西瓜（Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.）是一种在全球广泛种植的重要葫芦科作物，但对低温较为敏感。葫芦（Lagenaria siceraria [Molina] Standl.）是一种气候适应性更强的葫芦科植物，常被农民用于与西瓜进行嫁接。本研究的主要目标是建立一种在西瓜（Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.）与葫芦（Lagenaria siceraria [Molina] Standl.）之间进行异源嫁接的标准、高效且便捷的方法。该方案还提供了嫁接后miRNA表达调控研究的详细实验设计与分析流程，有助于揭示异源嫁接优势的潜在机制。
本研究使用的植物材料包括西瓜栽培品种和葫芦地方品种。该西瓜栽培品种为高产的商业品种，但对低温敏感。葫芦地方品种由于对低温具有优异的耐受性，常被用作西瓜、黄瓜和葫芦嫁接的流行砧木21。
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方案
1. 种子灭菌与萌发
- 进行表面灭菌时，将葫芦种子放入盛有58 °C水的500 mL烧杯中浸泡，并不时搅拌，直至水温降至40 °C。
- 同时，将3 kg泥炭土装入尼龙袋中，并在120 °C/0.5 MPa条件下高压灭菌20分钟以进行灭菌。
- 继续浸泡葫芦种子4 - 5小时，期间不再搅拌。
- 当水温降至室温后，用蒸馏水冲洗种子2 - 3次。
- 倒掉多余的水分，将种子置于纱布袋中，在培养室黑暗条件下28 °C环境中催芽。
- 种子萌发后，将种子播种于装有灭菌泥炭土的塑料盆（直径6 cm）中。
- 当葫芦幼苗长出两片平展的子叶时，对西瓜种子重复步骤1.1 - 1.3。
注意：这种时间管理可确保接穗与砧木大小匹配良好，从而提高嫁接成功率。
2. 幼苗生长与嫁接
- 将幼苗置于生长室中培养，设置16小时光照/8小时黑暗的光周期，白天（光照期间）温度保持在28 °C，夜间（黑暗期间）温度保持在22 °C。每天傍晚添加一次水，对幼苗进行灌溉。
- 当葫芦幼苗（砧木）处于一叶期、西瓜幼苗（接穗）子叶已出土但尚未展平时，采用断茎嫁接法22进行异源嫁接。
- 在西瓜幼苗子叶下方2–3 cm处切断下胚轴，同时在葫芦幼苗真叶上方位置切除植株顶部。
- 用牙签在修剪后的葫芦幼苗顶端插出小孔，将修剪后的西瓜幼苗插入孔中，完成异源嫁接。
- 采用与步骤2.2类似的方法进行同源嫁接。
注意：同源与异源嫁接组合应始终同时进行（图1），本实验中形成以下嫁接组合：西瓜/葫芦（WB，异源嫁接）、西瓜/西瓜（WW，同源嫁接）和葫芦/葫芦（BB，同源嫁接）。
图1：嫁接组合及嫁接植株结构示意图。 WB = 西瓜/葫芦异源嫁接；WW = 西瓜/西瓜同源嫁接；BB = 葫芦/葫芦同源嫁接；WB-S = 采样的西瓜/葫芦异源嫁接植株的接穗叶片；WB-R = 采样的西瓜/葫芦异源嫁接植株的砧木叶片。 请点击此处查看此图的放大版本。
3. 移植后管理、低温处理与取样
- 用透明聚乙烯袋包裹嫁接后的幼苗，以保持相对较高的湿度，并在16小时光照/8小时黑暗的环境条件下培养7天，白天（光照期间）温度维持在28 °C，夜间（黑暗期间）温度维持在22 °C。
- 在第7天时揭开透明聚乙烯袋，将植株在相同条件下继续生长7至10天。
- 将生长健康且一致的幼苗分为两组，一组用于低温处理（胁迫组），另一组作为对照（非胁迫组）。对照组幼苗保留在原有生长箱中（28 °C）继续培养48小时；胁迫组幼苗则转移至温度恒定为6 °C的生长箱中，光照/黑暗条件同步骤2.1所述。
- 采集嫁接植株接穗和砧木的叶片样品（图1）。立即将样品置于液氮中速冻，并在-70 °C保存备用。
4. 文库构建与高通量测序
- 将冷冻样品转移至液氮中的 2 mL 微离心管中。
- 向每个含有组织的离心管中加入一颗不锈钢珠（直径 5 mm）。
- 使用珠磨均质仪以 30 秒时间将组织研磨成细粉。
- 针对每种嫁接组合，从十株幼苗中取等量（0.1 g）研磨后的样品，混合至一个 10 mL 离心管中。根据生产商建议，按照组织重量加入适量的盐酸胍试剂（材料表）。
- 加入无 RNA 酶的 DNase I 至终浓度 150 U/mL，在 37 °C 下孵育 1 小时，以去除基因组 DNA 污染。
- 使用微毛细管电泳系统测定总 RNA 含量，确保 RNA 完整性数值（RIN）> 7.0。
注意：RIN > 7.0 表明 RNA 样品具有高完整性。 - 根据生产商说明书，使用商用试剂盒（材料表）制备小 RNA 文库。每份样品起始使用 1 µg 总 RNA。
- 按照生产商指南解冻文库标准化试剂和接头，将小 RNA 与 5′ 和 3′ 接头连接，并进行洗脱和纯化。随后，按照生产商指南对已连接 5′ 和 3′ 接头的小 RNA 进行逆转录。
- 根据生产商方案进行 PCR 扩增。使用微毛细管电泳系统评估 cDNA 文库的质量和数量。
- 在微毛细管电泳系统上加载 1 µL RNA 文库，以确保 RIN > 7.0。
- 在高通量测序仪上对小 RNA 文库进行测序，具体操作见其他文献描述23。
5. miRNA 及靶基因预测
- 针对每种嫁接组合，使用开源的UEA sRNA Workbench 2.4-植物版本24去除低质量序列，并从原始测序读段中截除接头序列。丢弃长度小于18 nt或大于32 nt的序列。
- 将高质量的“干净”序列与开源Rfam 11.0数据库进行比对，以识别并去除rRNA、tRNA、snoRNA及其他snRNA的读段。
- 使用短读段序列比对工具25将剩余读段比对至参考基因组。此步骤中不允许任何错配。
注意：接穗来源的读段使用西瓜“97103”基因组组装版本V126进行比对，砧木来源的读段使用葫芦“HZ”基因组组装版本V127进行比对。 - 将剩余读段与开源miRBase 22.0数据库28中的已知成熟miRNA进行比对。与已知miRNA具有同源性的读段被归类为保守miRNA。
- 将未能匹配已知miRNA前体的序列与基因组序列进行比对。在默认参数下使用MIREAP29算法检测潜在的新miRNA。
6. 差异表达与基因本体分析
- 根据读数数量比较miRNA的表达水平。具有 P 值（Fisher精确检验）< 0.05 且绝对log2值 > 2的miRNA被视为差异表达。
- 使用反义寡核苷酸靶位点选择工具（TargetFinder）30，在默认参数下预测差异表达miRNA的潜在互补mRNA（miRNA靶基因）。
- 使用基因本体（GO）富集分析工具31，在统计学显著性 P 值阈值为0.05的条件下，揭示miRNA靶基因的基因本体（GO）富集模式。
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结果
图2：不同嫁接植株在室温和低温胁迫条件下的表型。（a）该图显示在室温条件下作为对照的同源和异源嫁接幼苗。（b）该图显示经过48小时低温处理后的同源和异源嫁接幼苗。请点击此处查看该图的放大版本。
采用所述方法，嫁接的成活率高达98%。在常温和低温胁迫条件下，不同嫁接组合的表型如...
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讨论
在本实验方案中，我们详细描述了一种高效且可重复的西瓜与葫芦属植物间同种及异种嫁接的方法。该方法无需特殊设备，操作简便，嫁接成活率通常很高。此方法也可用于其他葫芦科植物之间的嫁接，例如西瓜、黄瓜与南瓜之间的嫁接。
值得注意的是，砧木和接穗的相对大小（年龄）对于成功嫁接至关重要（步骤2.2）。 实验方案）。我们观察到，如果砧木相对于接穗过大，嫁接部位更难愈合，因为接穗的茎秆部分略显中空。根据我们先前的蛋白质组学数据31，强烈建议将自嫁接的接穗和自嫁接的砧木作为对照（步骤2.3） 实验方案因为这样可以大幅消除嫁接损伤的影响。
该方案还提供了用于研究异源嫁接系统中miRNA丰度的详细实验设计和具体实验步骤。该方法还可用于其他植物嫁接系统的研究，以揭示局部和长距离miRNA调控的机制。在 代表性结果，我们仅报告接穗或砧木中局部miRNA在低温下的表达变化。越来越多的研究强调了长距离小RNA...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。小RNA测序数据已存入GenBank，登录号为SRP136842。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（31772291）、浙江省公益性研究项目（2017C32027）、浙江省植物育种重点科技项目（2016C02051）以及国家高层次人才特殊支持计划（授予P.X.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TRIzol 试剂 | Invitrogen | 15596026 | |
| 无RNA酶的DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq 小RNA样本制备试剂盒 | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 生物分析仪 | Agilent | 5067 | |
| DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-植物版 （软件） | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 数据库 （网站） | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 （网站） | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP（软件） | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder （软件） | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
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