方法文章

人源化 NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 小鼠模型在 HIV 复制与潜伏研究中的应用

DOI：

10.3791/58255

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2019年1月7日

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1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

本文内容

摘要

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本方案提供了一种通过向经辐射处理的新生NSG小鼠肝内注射人源造血干细胞来建立人源化小鼠（hu-NSG）的方法。hu-NSG小鼠可感染HIV，并对联合抗逆转录病毒治疗（cART）具有响应，是研究HIV复制与潜伏的理想病理生理模型。

摘要

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人类病理学、免疫学及治疗开发研究中的伦理规范和技术挑战使得小型动物模型需求量大增。由于在遗传和行为上与人类高度相似，小鼠等小型动物成为理想的人类疾病模型，可重现类似人类的症状和反应。此外，小鼠的遗传背景可被改造以满足多种研究需求。NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) 小鼠是目前应用最广泛的免疫缺陷小鼠品系之一，能够接受人类造血干细胞和/或人类组织的移植，并进一步发育形成功能性的人类免疫系统。这是理解HIV/AIDS等人类特异性疾病的预后和病理生理机制、并推动治愈研究的关键里程碑。本文中，我们报告了一种通过将造血干细胞移植至经辐射处理的新生NSG小鼠体内，以构建人源化NSG小鼠模型（hu-NSG）的详细实验方案。该hu-NSG小鼠模型表现出移植的人类干细胞的多谱系发育能力，并可感染HIV-1病毒，同时在联合抗逆转录病毒治疗（cART）过程中重现了关键的生物学特征。

引言

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由于建立适合人类疾病的动物模型是找到治疗方法的关键，长期以来人们一直在不断追求并改进合适的动物模型。目前已开发出多种免疫缺陷型小鼠模型，能够接受人类细胞和/或组织的移植，并实现相应的人源化功能1,2。这类人源化小鼠模型对于研究人类特异性疾病至关重要3,4,5。

由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）即为一例。在人源化小鼠模型建立之前，由于伦理和技术上的限制，HIV/AIDS的临床前动物研究仅局限于非人灵长类动物3。然而，这类动物高昂的费用以及对特殊护理的需求，限制了在常规学术环境中开展HIV/AIDS研究。HIV主要感染人类CD4+ T细胞，并影响其他人类免疫细胞（如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的发育和免疫应答6；因此，移植了功能性人类免疫系统的小型动物模型备受迫切需求。

1988年取得了一项突破，当时开发出了携带Prkdcscid 突变的CB17-scid小鼠，并成功实现了人免疫系统的移植1。Prkdcscid 突变导致小鼠T细胞和B细胞功能缺陷，适应性免疫系统被消除，从而能够接受人外周血单个核细胞（PBMCs）、造血干细胞（HSCs）以及胎儿造血组织的移植7,8。然而，该模型中常观察到较低水平的移植效率；可能的原因包括：1）自然杀伤（NK）细胞介导的残余固有免疫活性；2）小鼠T细胞和B细胞的晚期发育（渗漏现象）5。随后开发的非肥胖糖尿病（NOD）-scid小鼠模型显著下调了NK细胞活性，因此能够支持更高水平且更持久的人免疫系统组分的移植9。为进一步抑制或阻断固有免疫系统的发育，研究人员在（NOD）-scid遗传背景下构建了白细胞介素-2受体γ链（Il2rg）截短或完全敲除的小鼠模型。Il2rg也被称为共同细胞因子受体γ链，是多种细胞因子受体中不可或缺的组成部分10,11,12,13。例如NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji （NSG）和NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug （NOG）品系，不仅严重损害了适应性免疫功能，还强烈破坏了小鼠细胞因子信号传导，并完全阻断了NK细胞的发育14,15,16。

在艾滋病（HIV/AIDS）研究中，常使用三种携带scid突变和Il2rg基因敲除的人源化小鼠模型：BLT（骨髓/肝脏/胸腺）模型、PBL（外周血白细胞）模型和SRC（SCID重constitution细胞）模型3。BLT模型通过将人胎儿肝脏和胸腺组织外科移植至小鼠肾包膜下，并同时静脉注射胎儿肝脏来源的造血干细胞（HSCs）而建立3,17,18。BLT小鼠模型具有高嵌合效率，能够支持所有谱系的人源造血细胞发育，并重建较强的人类免疫系统；此外，T细胞在人自体胸腺中经历教育过程，可产生HLA限制性的免疫应答4,5,17,19。然而，该模型的主要缺点在于需要进行外科手术操作。PBL小鼠模型通过静脉注射人外周淋巴细胞建立。该模型操作简便，可实现T细胞的有效嵌合，但由于B细胞和髓系细胞嵌合不足、整体嵌合水平较低，以及易发生严重的移植物抗宿主病（GVHD），其应用受到限制3,20。SRC小鼠模型通过向新生或年轻成年SCID小鼠注射人HSCs建立。该模型的平均嵌合效率超过25%（以外周血CD45阳性细胞比例评估），支持移植HSCs的多谱系分化，并可形成一定功能的人类先天免疫系统。然而，SRC模型的局限性在于T细胞应答受小鼠H2分子限制，而非人类HLA限制14,21。

SRC小鼠模型被认为是临床前HIV/AIDS小型动物研究中一种简便且可靠的模型，其特点在于能够稳定地重建人类免疫系统并成功实现造血发育。我们此前已报道了NSG人源化SRC-SCID（hu-NSG）小鼠模型的建立，并描述了其在HIV复制与潜伏研究中的应用22,23,24该hu-NSG小鼠模型表现出高水平的骨髓归巢能力、对HIV感染的易感性，以及对HIV感染过程和致病机制的良好模拟。此外，该模型对联合抗逆转录病毒治疗（cART）具有适当的治疗反应，并在停用cART后重现血浆病毒反弹现象，证实了HIV潜伏储存库的建立。25,26,27该HIV潜伏储库进一步得到了可产生具有复制能力的HIV病毒的证实 离体 由感染并经cART治疗的hu-NSG小鼠中分离的人静息CD4+ T细胞诱导产生。

本文中，我们描述了从新生NSG小鼠建立人源化NSG（hu-NSG）小鼠模型的详细实验方案，包括与HIV感染及抗逆转录病毒治疗（cART）诱导潜伏感染相关的操作步骤。我们期望该方案能为HIV病毒学、潜伏机制及治疗研究中的动物实验提供一套新的技术方法。

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方案

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所有动物护理和操作均按照本研究主要研究者（John Rossi 博士，IACUC #12034）提交并经希望之城机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查批准的方案进行。人胎肝组织由位于加利福尼亚州阿拉米达的非营利组织 Advanced Bioscience Resources 提供，获取过程符合联邦和州的相关法规。该供应商设有独立的机构审查委员会（IRB），并遵守人类受试者保护要求。人外周血单个核细胞（PBMCs）来自希望之城血液捐献中心（加利福尼亚州杜阿尔特）匿名健康捐献者的废弃外周血标本，不包含有关年龄、种族、性别或民族的任何身份信息。IRB#/REF#: 97071/075546

1. 一般无菌操作规范

  1. 在指定的超净工作台中进行组织培养实验。
  2. 保持组织培养基和添加剂处于无菌条件下，并在使用前用0.22 µm滤器过滤。
  3. 将制备好的人源HSCs保存在无菌管中，并置于冰上直至注射。
  4. 由于NSG小鼠存在严重免疫缺陷，操作时须采取无菌措施。穿戴一次性手术服、头帽、口罩、鞋套和手套，以防止污染。实验前后使用基于二氧化氯的消毒剂（例如，Clidox）对实验台面、辐照固定装置以及麻醉诱导室进行消毒。
  5. 经眶后静脉丛采血后涂抹石油基眼膏，以防止眼睛干涩。
  6. 更换为含抗生素的饮食，以预防因眶后静脉丛采血引起的感染。

2. 处理HIV病毒、感染的啮齿类动物及含病毒的血液/组织样本

警告：HIV 属于三级人类病原体；必须严格遵守操作规范。

  1. 在指定的BSL2+/3级实验室区域内操作含有HIV病毒的样本。运输过程中，将含有病毒的试剂安全锁在次级容器中。运输前，用10%次氯酸钠溶液和异丙醇彻底擦拭所有容器的外表面进行消毒。
  2. 所有含有病毒的废弃物应存放于指定的废物容器中，并使用2-3层生物危害废物袋包裹。在处理废弃物前，需充分喷洒碘/乙氧基化壬基酚溶液（例如，Wescodyne）进行消毒，随后进行高压灭菌。
  3. 穿戴个人防护装备：头帽、面部遮盖物、防溅面罩、鞋套、一次性手术服以及双层手套。
  4. 极其谨慎地操作感染的啮齿类动物。在小鼠处于麻醉状态下进行注射和采血操作（步骤5.1-5.2、6.3-6.5、7.3以及8.1-8.2）。

3. 造血干细胞的分离

  1. 制备用于组织消化的胶原酶/分散酶溶液。
    1. 将胶原酶/分散酶粉末溶解，配制成浓度为100 mg/mL的母液，并将胶原酶/分散酶母液以150 µL分装，于-20 °C保存。
    2. 配制工作用胶原酶溶液：将150 µL胶原酶/分散酶储备液与15 mL添加了10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基混合稀释。
      注意：胶原酶/分散酶用于组织消化的终浓度为 1 mg/mL。
  2. 使用无菌剃须刀片将胎儿肝脏组织（妊娠16-24周）切成小块（约2-3 mm）3 大小）后，加入胶原酶/分散酶溶液（1 mg/mL），室温下消化30分钟。调整消化液体积，确保所有组织块完全浸没。用注射器活塞尾端轻轻研磨组织样本，以促进消化。
  3. 将消化混合物通过70 µm无菌尼龙滤网过滤，以获得单细胞悬液。
  4. 使用 MACS 系统，按照制造商说明书富集 CD34+ 造血干细胞。
  5. 使用血细胞计数板计数富集的CD34+造血干细胞的活细胞百分比28 并进行新生NSG小鼠的肝内注射。
  6. 将剩余的富集CD34+造血干细胞（HSCs）置于冻存液中冷冻保存（例如，CryoStor CS2）并在液氮罐中保存细胞。后续使用时，在注射前重新计数解冻后CD34+造血干细胞的活细胞百分比。使用冻存培养基后，解冻细胞的活力可达80%至90%。

4. 在新生NSG小鼠中进行人CD34+造血干细胞的肝内注射

注意：出生后2-3天的新生NSG小鼠最适合本实验操作，因其已具备足够强的体质以耐受半致死剂量的照射，同时免疫系统仍处于完全缺陷的幼年状态。造血干细胞注射无需麻醉。

  1. 将一整窝新生NSG小鼠（通常为5-10只，包含两种性别）放入无菌的扇形辐照笼中，并使用铯-137辐射源进行总剂量为200-250 cGy的γ射线照射。确保辐射剂量在此范围内，因为当NSG小鼠暴露于高剂量辐射时，可能出现显著的体重下降甚至死亡。12
    注意：辐射具有健康危害，应采取个人辐射防护措施。
  2. 辐照后，使用注射器/针头装置（图1）向每只新生NSG小鼠注射5 × 105个有活力的人源CD34+ HSCs。将细胞直接注射至肝脏中。

5. 通过眶后取血和流式细胞术分析验证移植效果

  1. 在造血干细胞（HSC）注射后10-12周，使用异氟烷/氧气吸入装置对小鼠进行麻醉。调节氧气流速，使异氟烷浓度维持在4-5%。麻醉过程需3-5分钟，具体时间因个体小鼠而异。充分麻醉的小鼠表现为呼吸缓慢而深沉，且对脚趾夹捏刺激无反应。
  2. 通过眶后取样法从小鼠中采集50-100 µL外周血28。将血液样本储存于含K2EDTA或肝素涂层的采血管中，以防止凝固。
    注意：采血管必须具有抗凝剂涂层，以便从全血中分离小鼠外周血单个核细胞（PBMCs）用于流式细胞术分析。EDTA已知会抑制PCR和qRT-PCR等酶促反应；因此，若后续需进行酶促反应，请使用肝素化采血装置。
  3. 在4 °C条件下，以2,000 × g离心血液样本20分钟，使血细胞沉淀。
    1. 离心后，将血浆上清转移至新的微量离心管中，如需进行细胞因子分析，则储存于-80 °C。
    2. 在室温下使用红细胞裂解缓冲液（材料表）裂解血细胞沉淀中的红细胞（RBCs），作用10分钟。
      注意：若无需血浆样本，可直接使用裂解液裂解全血，无需预先离心。
  4. 红细胞裂解后，在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，沉淀剩余血细胞；吸除上清。用含0.01% BSA的DPBS洗涤细胞沉淀，于4 °C以300 × g离心5分钟，吸除上清。重复洗涤一次。
  5. 在4 °C条件下，用100 µL 1×封闭缓冲液（配方见表3）封闭细胞20分钟。
  6. 封闭后，直接将每种抗体溶液以2 µL/106细胞的浓度加入细胞悬液中，在4 °C孵育30分钟。用于移植验证的抗体包括：抗人CD45（白细胞，RRID: AB_2732068）、抗人CD3（T细胞，RRID: AB_396896）、抗人CD4（辅助性T细胞，RRID: AB_397037）、抗人CD8（细胞毒性T细胞，RRID: AB_2722501）、抗人CD14（单核细胞，RRID: AB_10373536）和抗人CD19（B细胞，RRID: AB_10373382）。有关推荐的流式抗体组合，请参见表4及材料表中的货号、RRID和批号。
    注意：在封闭液中进行抗体染色可消除抗人抗体与小鼠表面标志物之间的非特异性结合，因为部分表面标志物在人与小鼠之间具有同源性。
  7. 从健康供体分离人外周血单个核细胞（PBMCs），并使用纯化的人PBMCs制备单染流式细胞术补偿对照。或者，可使用荧光标记的微球作为补偿对照29。
  8. 使用流式细胞仪分析外周血样本，并定量计算总外周血细胞中人CD45+细胞、人CD3+细胞、人CD14+细胞和人CD19+细胞的比例。
    1. 对于后续的HIV感染与潜伏研究，需计算CD3+细胞中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比例。
      注意：通常在HIV感染前可观察到CD4:CD8比值介于1.5至2.5之间30。

6. 使用qRT-PCR分析人源化NSG小鼠的HIV感染情况及血浆病毒载量

  1. 使用健康供体的人外周血单个核细胞（PBMC）扩增 HIV BaL 病毒储备液，在感染后第 10 天收获，并使用 p24 ELISA 试剂盒进行滴度测定31。
  2. 选择外周血中人源 CD45+ 细胞比例超过 20% 的 hu-NSG 小鼠用于 HIV 感染实验。
  3. 使用异氟烷/氧气吸入麻醉装置对 hu-NSG 小鼠进行麻醉（步骤 5.1）。
  4. 确认动物完全麻醉后，通过腹腔注射途径每只小鼠接种 200 ng p24 当量的 HIV BaL 病毒。
    注意：操作针头时需格外小心，禁止重复使用针头，使用后应立即丢弃至指定的锐器容器中。病毒接种后应对注射部位进行消毒。
  5. 感染后三周，对 hu-NSG 小鼠实施麻醉，并使用肝素化毛细管和收集管通过眶后静脉丛采血获取外周血样本。
  6. 以 2,000 × g 离心 20 分钟，分离血浆与血细胞。
  7. 裂解红细胞。对剩余血细胞进行封闭并用抗体标记，用于流式细胞术分析（第 5.3–5.8 节）。
    注意：流式细胞术分析应重点比较感染前后 CD4:CD8 比值的变化。由于 CD4 抗原是病毒进入细胞的共受体，预期可见 CD4+ 细胞数量显著下降。
  8. 利用血浆样本通过 qRT-PCR 检测 HIV 病毒载量。使用病毒 RNA 小量提取试剂盒从血浆样本中提取病毒 RNA。按照制造商说明书，采用针对 HIV-1 LTR 的特异性引物和探针组合（序列详情见 表 5）进行 qRT-PCR 检测。

7. 口服cART给药及病毒抑制效果验证（可选）

注意：此步骤对于研究急性感染阶段的 HIV 预后、病毒学或感染相关病理生理学而言是可选的。对感染 HIV 的人源化 hu-NSG 小鼠进行 cART 治疗，旨在模拟接受 cART 治疗的人类患者体内的 HIV 潜伏状态。成功感染 HIV 的 hu-NSG 小鼠接受为期 4 周的 cART 治疗。cART 治疗方案包括富马酸替诺福韦酯（TDF；300 mg/胶囊）、恩曲他滨（FTC；200 mg/胶囊）和拉替拉韦（RAL；400 mg/胶囊）。用于治疗感染 HIV 的 hu-NSG 小鼠的 cART 剂量根据体表面积进行调整（表 1、公式 1、表 2）32。

  1. 根据每个笼子在一周治疗期间所需的每种药物量进行计算，需考虑水瓶的容量、每个笼子中的小鼠数量，以及每只小鼠平均每日饮水量为 4 mL 的因素。
    注意：此步骤的关键是确保每只小鼠在 4 mL 饮用水内摄入其每日剂量。
  2. 将三种药物按调整后的剂量研磨成细粉，并将混合药粉溶解于甜味水中（例如，Medidrop Suralose）。每周更换一次水瓶，提供用甜味水新近溶解的 cART 药物混合物。
    注意：药物粉末可能不会立即溶解，需剧烈震荡以形成均匀的混悬液，然后再将水瓶放回动物饲养笼中。
  3. 每两周通过眶后静脉采血收集外周血样本，并使用流式细胞术（第 5.3–5.8 节）分析 CD4:CD8 比值，同时使用 qRT-PCR（第 6.6 节）检测血浆病毒载量。
    注意：通常在治疗 4 周后，血浆病毒载量会降至检测限以下，且典型的 CD4:CD8 比值得以恢复。

8. 验证停用cART后病毒反弹（可选）

注意：此步骤对于验证潜伏模型至关重要，因为在停止cART治疗后出现病毒反弹可直接证明潜伏储存库的存在。该步骤也建议作为针对抑制HIV反弹疗法研究的对照实验。

  1. 在采集的外周血样本中血浆病毒载量低于检测限且CD4:CD8比值恢复至1.5至2.5范围内后，计划停止cART治疗。
  2. cART停药后每2周通过眶后静脉采血收集外周血样本。密切监测血浆病毒载量的变化（第6.6节）以及CD4:CD8比值（第5.3–5.8节）。

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结果

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流式细胞术分析常用于验证分离得到的造血干细胞（HSCs）的纯度、评估移植水平、分析对病毒感染的免疫应答以及监测联合抗逆转录病毒治疗（cART）的效果。典型的抗体组合包含4至6种不同的荧光标记抗体；因此，配备多激光器和多种滤光片选择的流式细胞仪对于获得准确结果至关重要。

在进行初始移植效果验证时，人源CD45+细胞的比例可介于20%至80%之间，人源白细胞亚群应在流式点图中呈现为清晰可辨的细胞群体（图2）。健康个体的CD4:CD8比值通常维持在1.5至2.5之间；病毒感染后通常会出现明显的CD4+细胞减少，导致CD4:CD8比值降低；而经cART治疗后，该比值可恢复至健康水平（图3）。

qRT-PCR 的检测下限为每...

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讨论

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移植了人类细胞/组织的免疫缺陷小鼠具有类似人类的生理特征，在针对人类特异性疾病的病理学、病理生理学和免疫学研究中具有重要价值。在多种免疫缺陷小鼠品系中，NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji （NSG）模型由于缺乏先天性和适应性免疫功能，以及小鼠特异性细胞因子信号通路被消除，是目前免疫缺陷程度最高的模型3,12,19。因此，NSG小鼠已被广泛应用于人源化研究，已有充分证据表明人类细胞可在小鼠的外周血、淋巴组织和髓系组织中成功重建，并且这些小鼠能够对HIV等感染性刺激产生适当的人类免疫应答27,33。

由于HIV具有宿主限制性，以往针对HIV病毒学和感染预后的临床前动物研究仅限于感染猴免疫缺陷病毒（SIV，...

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披露

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作者声明不存在利益冲突。

致谢

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本研究由美国国立卫生研究院资助［资助编号：R01AI29329、R01AI42552 和 R01HL07470，授予 J.J.R.］以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所［资助编号：P30CA033572，用于支持希望之城整合基因组学、分析药理学和分析细胞计量学核心设施］。以下试剂通过美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂计划、艾滋病研究部、NIAID、NIH 获得：HIV BaL 病毒。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CD34 微珠试剂盒，人MiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji 杰克逊实验室005557订购饲养员而不是实验小鼠
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204通过动物设施订购，限制物品
Clidox消毒剂Fisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 注射器/针头Hamilton80508定制
采血管 （K2EDTA）BD Bioscience367843
采血管（肝素）BD Bioscience365965
毛细管（肝素化）Fisher Sicentific22-362574
红细胞裂解缓冲液SigmaAldrich11814389001
QIAamp 病毒 RNA 小量试剂盒Qiagen52906
TaqMan Fast VIrus 一步法预混Thermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA（5 板试剂盒）金埃尔默NEK050B001KT
IgG，来自人
IgGI5381-10MG
BB515小鼠抗人CD45（克隆HI30）BD Biosciences564586RRID： AB_2732068， LOT 6347696
PE-Cy7 小鼠抗人CD3（克隆SK7）BD Biosciences557851RRID： AB_396896， LOT 6021877
Pacific Blue 小鼠抗人CD4（克隆RPA-T4）BD Biosciences558116RRID： AB_397037， LOT 6224744
BUV395 小鼠抗人CD8（克隆）RPA-T8）BD Biosciences563795RRID：AB_2722501，LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 小鼠抗人 CD14 （TuK4）ThermoFisherMHCD1427RRID：AB_10373536，LOT 1684947A
PE 小鼠抗人 CD19 （SJ25-C1）ThermoFisherMHCD1904RRID：AB_10373382，LOT 1725304B
液 帕血清 Sigma Aldrich I4506-100MG

参考文献

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