单金属纳米粒子的高分辨率物理特性

摘要

在这里,我们提出了一个协议,使用基于生物纳米孔的电子平台,在单分子极限处检测离散金属氧簇、多氧金属酸盐(POM)。该方法为研究这些分子的传统分析化学工具提供了补充方法。

摘要

单个分子可以通过测量它们减少流经单个纳米刻度孔的离子电流的程度来检测和特征。信号是分子的物理化学性质及其与孔隙相互作用的特征。我们证明,由细菌蛋白外毒素金黄色葡萄球菌α溶酶(αHL)形成的纳米孔可以在单分子极限处检测多氧金属酸盐(POM、离子金属氧簇)。此外,同时测量溶液中12磷酸POM(PTA,H₃PW₁₂O₄₀₎的多种降解产物。纳米孔法的单分子灵敏度使POM的显著浓度显著低于核磁共振(NMR)光谱。该技术可作为化学家研究多氧金属酸盐或其他金属簇的分子特性,更好地了解POM合成工艺,并可能提高其产量的新工具。假设,可以使用这种方法研究给定原子的位置或分子中片段的旋转以及金属氧化状态。此外,这项新技术的优点是能够实时监测溶液中的分子。

引言

使用纳米孔和测量离子电流调制,可以在单分子水平上检测生物分子分析物。通常,纳米孢子根据其制造分为两类:生物(由蛋白质或DNA折纸自行组装)1、2、3或固态(例如,由半导体加工工具)^4,5.虽然固态纳米孔被认为具有潜在的物理上更坚固,可用于广泛的溶液条件,但迄今为止,蛋白质纳米孔具有更高的灵敏度、更强的抗结垢性、更大的带宽、更好的化学性选择性,以及更大的信噪比。

各种蛋白质离子通道,如金黄色葡萄球菌α-溶酶(αHL)形成的通道,可用于检测单个分子,包括离子(例如,H⁺和D=2,3,多核苷酸(DNA)和RNA)6,^7,8,损坏的DNA^9,多肽^10,蛋白质 (折叠和展开)^11,聚合物 (聚乙烯乙二醇等)^12,13,14、金纳米粒子15、16、17、18、19等合成分子20。

我们最近证明,αHL纳米孔还可以轻松地在单分子水平上检测和表征金属簇,多氧金属酸盐(POM)。POM 是 1826^年发现的离散纳米级电子金属氧簇,自那时以来,已经合成了更多类型。现在可用的多氧金属酸盐的不同尺寸、结构和元素组合物具有广泛的特性和应用,包括化学 22、23、催化^24、材料科学^{25 ,26}和生物医学研究27,28,29。

POM 合成是一种自组装过程,通常通过混合所需的单体金属盐量来在水中进行。一旦形成,POM 表现出巨大的大小和形状的多样性。例如,Keggin聚苯乙烯结构,XM₁₂O₄₀^q-由一个异构体(X)组成,四氧包围形成四面体(q是电荷)。异构体位于由12个八面体MO₆单位(其中M = 在高氧化状态下过渡金属)形成的保持架内,由相邻的共享氧原子相互连接。虽然钨多氧金属结构在酸性条件下稳定,氢氧化离子导致金属氧(M-O)^键30的水解裂解。这种复杂的过程导致一个或多个MO₆八面体亚单位的损失,导致形成单空和三空物种,并最终完全分解POM。我们在这里的讨论将仅限于pH5.5和7.5的12磷酸的部分分解产物。

该协议的目的是使用基于生物纳米孔的电子平台在单分子极限处检测离散金属氧团。此方法允许检测溶液中的金属簇。溶液中的多个物种可以比传统的分析方法更灵敏地进行^区分33。通过它,可以阐明POM结构的细微差异,其浓度明显低于NMR光谱所需的浓度。重要的是,这种方法甚至允许对Na₈HPW₉O₃₄¹的等同形式进行区分。

方案

注意:以下协议特定于电子生物科学 (EBS) 纳米片直流系统。然而,它可以很容易地适应其他电生理学仪器,用于测量电流通过平面脂双层膜(标准脂质双层膜室,U管几何,拉微毛细血管等)。给出了商业材料及其来源的鉴定,以描述实验结果。在任何情况下,这种鉴定都并不意味着国家标准与技术研究所的建议,也不意味着材料是最好的。

1. 溶液和分析剂制备

1. 从 1 型净水系统中制备 18 MΩ-cm 水的所有电解质溶液,去除微量有机物,然后在电离通道记录前通过 0.22 μm 真空过滤器过滤所有电解质溶液。
   注意:水质是影响膜纳米孔系统稳定性和寿命的关键因素。
2. 野生类型 =HL。
   1. 处理 βHL 毒素蛋白时,请遵循 MSDS 预防措施。
   2. 将冻干野生型单体S. aureus +-溶血辛 (αHL) 粉末与 18 MΩ-cm 水混合,以 1mg/mL 表示。将样品的10至30μL等分分分配到冷冻安全离心管中,在液氮中快速闪烁冻结,然后储存在-80°C。或者,使用纯化的预制半球+ HL³¹。
3. 将脂质 1,2-二苯基-sn-Glycero-3-磷胆碱 (DPhyPC) 溶解至 0.2 mg/mL n-脱胶,在 4 mL 玻璃闪烁小瓶中,带聚四氟乙烯氯联涂层盖。将溶液储存在 4°C,重复使用长达一个月。
4. 准备磷酸溶液。
   1. 在处理磷钨酸粉时,请遵循 MSDS 预防措施,并通过溶解 57.6 mg H₃PW₁₂O₄₀到 10 mL 的 1 M NaCl 和 10 mM NaH₂PO₄来制备 2 mM 磷酸库存溶液解决方案,构成库存解决方案。
   2. 取此溶液的 5 mL,用 3 M NaOH 将 pHH 调整为 5.5。使用 3 M NaOH 将库存溶液的其他 5 mL 的 pH 量调整为 7.5。
      注意:在pH 5.5时,12磷酸(PTA,H₃PW₁₂O₄₀₎主要分解成单空的太阳神[PW₁₁O₃₉]^7-。

2. 测试单元组件

1. 根据制造商的说明组装测试单元。
2. 用600砂纸磨砂后,将一根Ag/AgCl线浸入漂白剂(次氯酸钠)10分钟。将电极放置在石英纳米孔膜 (QNM) 内。
3. 将圆柱形 AgCl 颗粒电极嵌入 QNM 外的银线中。
4. 设置测试单元后,打开电源和数据采集程序。在测试单元中没有溶液的情况下,确保直流电流读数为 0 pA。
5. 使用通过流体管路连接到测试单元的注射器在 QNM 表面上方添加缓冲电解质溶液,并确保离子电流使放大器饱和。如果没有,QNM 可能会堵塞。施加爆裂电压 (± 1 V) 和/或大于 300 mm Hg 的压力以清除它。如果可行,请降低电压和压力。

3. 脂质双层形成

1. 在测试单元中填充溶液,使溶液水平远高于 QNM 的面。然后通过注射器将溶液水平降低到面部以下,使电流降至零。
2. 将 10 μL 移液器尖端浸入脂质小瓶中。按下移液器尖端的后端,在小瓶的侧面点击,以去除所有可见的脂质。
3. 当溶液水平高于QNM表面时,将移液器尖端触摸到测试单元中溶液的空气-水接口上,等待两到五分钟,使脂质均匀扩散。
4. 缓慢地将溶液水平降低到QNM表面以下,直到电流饱和,然后缓慢地将溶液水平提升到QNM表面,形成脂质双层膜。
   1. 一旦双层结构出现(即,当电流达到零时),尝试通过增加压力并确保 QNM 不堵塞来弹出它几次。要改革脂质双层膜,将溶液水平降低到QNM表面以下,然后慢慢升高。
5. 如果脂质双层膜没有在第一次形成,将溶液降低到面部下方,然后再次升高。如果在3次试验后没有形成,如3.2和3.3所述,添加更多脂质。
6. 形成膜后,当应用的电位为零时,将电流偏移设置为零。

4. •HL 孔隙形成

1. 在测试细胞中加入2.5 ng的纯化预制β HL半球蛋白样品(或250 ng的单体βHL),以启用通道形成。
2. 形成双层后,用气密注射器(图1)增加双层结构的压力,以扩大QNM的膜,促进纳米孔插入。根据每个 QNM,升高施加的背压通常在 40 到 200 mmHg 之间。
   注意:EBS 软件具有自动插入功能,该功能应用更高的偏置(通常为 200 到 400 mV)来诱导孔隙形成,然后在单个通道形成后自动将所需电压降至测量偏置。
3. 形成纳米孔后,将背压降低到插入压力的1⁄2左右。如果观察到多个通道,则通过显著降低压力来去除它们。

5. 纳米孔中的金属簇分区

1. 为了考虑电极不平衡,设置直流偏移电压,这样当施加的电位设置为零时,没有测量电流。
2. 在添加 POM 样品之前,执行控制实验,以确保储液罐中没有污染物(例如,从以前的实验中跟踪 POM)。具体来说,在没有任何POM的情况下,在应用电位+120 mV至-120 mV下采集离子电流轨迹,以验证不存在自发电流封锁。
   注意:由于αHL通道的不对称结构(图1),离子电流的放大作用因正极和负效应而不同。测量电流比高于此施加电压表示膜中αHL 纳米孔的方向。
3. 以 1 至 5 mM 浓度的金属聚类溶液冲洗储液罐,加入 POM 样品。或者,在细胞组装之前将样品加载到毛细管中,以研究 POM 分区到 αHL 通道的另一端。
4. 使用制造商的软件记录离子电流,以检测将单个 POM 分区到纳米孔中引起的瞬态电流封锁。从离子电流封锁深度、事件频率和封锁的停留时间分布估计分子的物理和化学性质。

6. Ion 通道记录和数据分析

1. 使用高阻抗、低噪声放大器和数据采集系统获取离子电流时间序列测量。在每个 pH 的应用电压 -120 mV(相对于通道cis侧)下执行测量。
2. 对信号应用低通 100 kHz 8 极贝塞尔滤波器,该滤波器随后在 500 kHz(即2 ms/点)下进行数字化。从时间序列中提取事件,并使用MOSAIC软件包^32、33中的 ADEPT 算法分析事件。

结果

在过去的二十年中,膜结合蛋白纳米级孔被证明为多功能的单分子传感器。基于纳米孔的测量相对简单。 两个充满电解质溶液的腔室由嵌入在电绝缘脂质膜中的纳米孔隔开。修补夹放大器或外部电源通过浸入电解质储液罐中的 Ag/AgCl电极,在整个纳米孔中提供静电电位。电场将单个带电粒子驱动到孔隙中,从而根据粒子的大小、形状和电荷,产生离子电流的瞬态减小。计算机程序控制施加的电压,并实时监控分子逆向分割到孔隙中产生的离子电流封锁。电流通过低噪声、高阻抗场效应晶体管进行放大并转换为电压,并使用数据采集卡进行数字化。

在这里,我们提供用生物纳米孔检测多氧金属酸盐的一般程序。如图2所示,在添加 POM 之前,无阻碍通道的平均开路电流为 ± 100 pA,应用电位为 -120 mV。增加 POM 会产生瞬态封锁,并将离子电流降低约 80%。正如所料,由于这些粒子是负电荷,当应用电位极性反转时,不会观察到...

讨论

由于其离子电荷,POM 可能通过静电相互作用与有机计数器阳离子相关联。因此,确定适当的溶液条件和正确的电解质环境(尤其是溶液中的阳离子)以避免与 POM 形成复杂情况非常重要。在缓冲液选择中需要特别小心。例如,使用三联甲酸甲烷和柠檬酸缓冲溶液的POM的捕获率明显低于磷酸盐缓冲溶液中的捕获率,这可能是因为前两个缓冲液中的任何一个与POM形成复合物,而POM不会与纳米孔的强相互作用。此外,NaCl电解质被特意用于代替KCl(以及其他碱金属),以避免[PW₁₁O₃₉] 7- K⁺的沉淀。

准确测量停留时间分布的关键是在足够高的带宽下测量电流的能力。例如,在以指数分布的居住时间下,与长期居住时间相比,存在比长时间更短的封锁,通过收集大量数据(即,以系统电电容允许的带宽获得)。为了在纳米孔光谱中达到此条件,应尽量减少系统电容(膜和杂散电容)。通过减少所有连接电缆的长度并使用高质量的电气触点,可降低杂散电容。通过减小双层材料的表面面积、增加支撑材料(即石英、聚四氟乙烯

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nanopatch DC System	Electronic Biosciences， Inc.， EBS
Millipore LC-PAK	Millipore 真空过滤器
1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DPhPC）	Avanti 极性脂质，雪花石膏，AL	850356P
Decane，ReagentPlus 和 ge;99%，	Sigma-Aldrich	D901
αHL	List 生物实验室，坎贝尔，加利福尼亚州
Ag 线	Alfa Aesar
2 mm Ag/AgCl 盘电极	体内公制	E202
高阻抗放大器系统	Electronic Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥
石英毛细管
定制聚碳酸酯测试池
数据处理与分析 MOSAIC	https://pages.nist.gov/mosaic/
磷钨酸水合物	Sigma-Aldrich	455970
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
磷酸钠 一氢二氢物	Sigma-Aldrich	71507