Method Article

高通量荧光素酶法评价单周转蛋白酶 PCSK9 的蛋白质水解

DOI:

10.3791/58265

⸱

August 28th, 2018

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

In This Article

Summary

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本协议提出了一种评估细胞内一种内在的低活性、单周转蛋白酶的蛋白水解活性的方法。具体来说, 该方法用于评价 PCSK9 的蛋白水解活性, 这是脂代谢的关键驱动力, 其蛋白水解活性是其最终胆固醇功能所必需的。

Abstract

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Proprotein convertase 枯草杆菌9型 (PCSK9) 是一种单周转蛋白酶, 它调节血清低密度脂蛋白 (LDL) 水平, 从而导致心血管疾病。尽管 PCSK9 蛋白水解是其完全胆固醇效果所必需的, 但对其蛋白水解功能的评价是有挑战性的: PCSK9 只知道它自己, 只经历一个单一的营业额, 并在蛋白质水解后, 保留其基底在其活性部位为自动抑制剂。这里提出的方法描述了一种克服这些挑战的试验。该方法的研究重点是细胞间蛋白水解, 并将成功的裂解与分泌的荧光素酶活性联系在一起, 可以很容易地在条件培养基中读出。通过突变、瞬变转染和荧光素酶读数的顺序步骤, 该方法可以在基因或分子摄动条件下, 在高通量的情况下 PCSK9 蛋白质水解。该系统非常适合于临床发现的无义单核苷酸多态性 (SNPs) 的生物化学评价, 以及筛选 PCSK9 蛋白水解物的小分子抑制剂。

Introduction

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PCSK9 靶向 ldl 受体 (ldl R) 降解, 提高 ldl 胆固醇 (ldl C) 和驱动动脉粥样硬化性心脏病1,2。治疗靶向 PCSK9 稳健低密度脂蛋白 C 和改善心血管结局的患者, 即使添加到积极的降脂治疗与他汀类药物3,4。然而, 目前批准的疗法仅限于基于抗体的方法, 而且缺乏成本效益5,6。为了解决这个问题, 不那么昂贵的治疗方案, 一种方法来识别患者可能获得更大的利益, 或两者, 是需要的。

小分子方法可以针对细胞内 PCSK9, 提供一个改进的管理路线, 并降低成本, 使它们成为这个领域的 "圣杯"7。然而, PCSK9 已经被小分子所证明是难以用药的。作为蛋白酶, 靶向 PCSK9's 蛋白水解功能是一个很有吸引力的策略, 因为自我分解是 PCSK9 成熟8的速率限制步骤, 它对 LDL-R9的最大影响是必需的。然而, 到目前为止, 这项战略还没有成功, 可能是....

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Protocol

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1. 蛋白酶载体的定点诱变

  1. 设计和订购自定义合成的寡核苷酸, 通过修改标准站点定向突变协议来安装感兴趣的变异12。标准淡化底漆 (没有额外的净化) 是完全可以接受的。
    注: 对底漆设计的一般方法涉及创建部分重叠的底漆, 如表 1所示, 使用的熔融温度 (Tm) 计算器特定的聚合酶的兴趣。
  2. 如表 2所示, 在冰上设置聚合酶链反应 (PCRs) 进行现场定向突变。
  3. 按表 3所示循环 PCRs。
  4. 运行 2-5 µL 的每一个 PCR 在1% 琼脂糖凝胶和可视化的产品, 以确认成功的放大。
    注意: 一个成功的 PCR 将显示一个单一的, 突出的 DNA 波段在大约大小标记的模板 (~ 7.8 kB)。
  5. 添加0.5 µL (每 25-µL 反应) 的 DpnI 和孵化样品37°c 1 小时。
  6. 将反应的2µL 转化为具有化学 能力的大肠杆菌。
    注: 快速生长的大肠杆菌菌株将减少潜伏期, 但任何克隆菌株都是可以接受的。
  7. 将转换盘到含有 50-100 µg/毫升羧苄青霉素的 Luria-Bertani (磅) 琼脂上。在37摄氏度一夜之间孵化盘子。
  8. ....

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Results

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高通量的蛋白质分解测定方法依赖于克服三大挑战。首先, 为了克服单周转 PCSK9 蛋白酶固有的低产量, PCSK9 蛋白酶缺乏抑制 prodomain, 与分裂序列的 prodomain 链接到一个荧光素酶, 可以分泌14。第二, 为了满足蛋白酶在复合体中的折叠与抑制 prodomain 的需要, 这两种多肽在细胞 coexpressed15,16,通过一个 bicistronic 的载体在反式中。第三, PCSK9 蛋白酶在 C678 中被截断, 防止 PCSK9 复合物从内质网 (ER) 中 uncleaved, 但对蛋白水解功能17、18 无影响..结合起来, 这允许评估分泌的荧光素酶作为一个代理的存在和程度的 PCSK9 蛋白水解 (

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Discussion

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上述实验程序提出了一种克服单周转蛋白酶 PCSK9 内在低活性的方法, 并以稳健的方式评价其蛋白水解功能。该检测的关键概念依赖于将单个周转事件转换为酶放大读数。该检测的优点包括相对较短的时间框架和易用性荧光素酶的记者, 以及它的可伸缩性高吞吐量的方法。此外, 该化验结果评估蛋白质水解在其本机, 细胞的上下文。此外, 通过这种检测, 临床鉴定的 snp 可以评估其对 PCSK9 蛋白水解的影响, 而不需要任何人或病人组织;只有兴趣基因型的知识是必要的。

这项试验的一些技术局限性存在。虽然该检测评估细胞内的蛋白质水解, 它也需要过度表达的载体。由于该检测要求 HEK293T 细胞系的瞬态转染, 转染效率增加了内在的好-好变异性。蛋白酶-死 S386A PCSK9 作为蛋白质水解的阴性控制, 它也作为对转染本身的积极控制, 因为这些细胞产生功能, 虽然 intracellularly 被困, 荧光素酶。对细胞板的原始数据进行评估有助于识别出转染效率总变异的细胞, 这些数据可以被丢弃 (如果需要的话, 实验重复)。此外, 处理所产生的总荧光素酶分泌的酶的比例的数据有助于调整质粒交付和转录输.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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提交人感谢 NHLBI/nih (K08 HL124068 和 LRP HMOT1243)、NCATS/nih 通过 UCSF 临床和转化科学研究所催化剂方案 (UL1 TR000004)、UCSF 学术参议院、赫尔曼基金会提供的慷慨资助,基列科学研究学者奖, 辉瑞渴望心血管奖 (全部对 John s Chorba) 和霍华德休斯医学研究所 (阿德里 m. 盖文和凯万 m. Shokat)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PCR 管USA Scientific1402-2900用于 PCR
Q5 热启动New England BiolabsM0493L高保真 DNA 聚合酶
脱氧核苷酸溶液混合物New England BiolabsN0447LdNTPs（用于 PCR）
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT作者n/a可从作者
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A 获得作者n/a可从作者处获得
琼脂糖 LEGold 生物技术A-201-100用于 DNA 凝胶
带蓝光底座的 E-Gel 成像系统ThermoFisher Scientific4466612用于 DNA 凝胶成像
SYBR Safe DNA 凝胶染料ThermoFisher ScientificS33102用于 DNA 凝胶
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1用于 DNA 凝胶电泳缓冲液
冰醋酸ThermoFisher ScientificA38-500用于 DNA 凝胶电泳缓冲液
乙二胺四乙酸溶液Millipore Sigma3690EDTA，用于 DNA 凝胶电泳缓冲液
1 kb DNA 分子量标准Gold BiotechnologyD010DNA 分子量标准
DpnINew England BiolabsR0176S限制性内切酶
LB 琼脂板，含 100 µg/mL 羧苄青霉素TeknovaL1010LB-Carb 板
One Shot Mach1 T 噬菌体抗性 化学感受态 大肠杆菌C862003化学感受态细胞
LB 肉汤，MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
羧青霉素金生物技术C-103-5选择性抗生素
E.Z.N.A. 质粒小量试剂盒 IOmega BioTekD6942-02DNA 纯化小量制备试剂盒
NanoDrop 2000 分光光度计ThermoFisher ScientificND-2000C分光光度计
293T 细胞美国组织培养保藏中心 （ATCC）CRL-3216HEK 293T 细胞
DMEM、高葡萄糖、丙酮酸ThermoFisher Scientific11995065DMEM、哺乳动物细胞培养基
胎牛血清Axenia BiologixF001FBS
胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红ThermoFisher Scientific25300062胰蛋白酶，用于细胞解离
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）ThermoFisher Scientific10010023PBS Countess
自动细胞计数仪ThermoFisher ScientificC10227自动细胞计数
Countess 细胞计数室载玻片ThermoFisher ScientificC10228用于细胞计数的载玻片
CELLSTAR 组织培养板，白色，白色底，带盖Grenier Bio-One655083白色，白色底 96 孔板
TempPlate 无裙边 96 孔 PCR 板，自然色USA Scientific1402-959696 孔板，用于主质粒板
Nunc 2.0 mL 深孔板板ThermoFisher Scientific27874396 孔深孔板
Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000008脂质体转染试剂，Lf3K
P3000 试剂ThermoFisher ScientificL3000008DNA 预复杂试剂，随 Lf3K
OptiMEM I 减血清培养基ThermoFisher Scientific31985062减血清培养基转染
（+）-L-抗坏血酸钠Millipore SigmaA4034抗坏血酸钠
氯化钠Millipore SigmaS9888NaCl
白蛋白、牛血清、组分 V、低重金属Millipore Sigma12659BSA
甲醇 （HPLC）ThermoFisher ScientificA4524MeOH
盐酸VWRJT9535-2浓 HCl
腔肠素金CZ2.5荧光素酶底
物注射器过滤器，无菌ThermoFisher Scientific09-720-3无菌过滤器，PVDF，0.22 和微量;m 孔
Pipet-Lite 多道移液器 L12-200XLS+Rainin17013810多通道移液器
Pipet-Lite 多道移液器 L12-20XLS+Rainin17013808多通道移液器
Pipet-Lite 多道移液器 L12-10XLS+Rainin17013807试剂
储液槽康宁4870试剂槽
离心管，15 mLThermoFisher Scientific05-539-1215 mL 离心
管 离心管，50 mLCorning43082950 mL 离心管
Spark 酶标仪Tecan，不适用，酶标仪
ExcelMicrosoft2016，适用于 Mac电子表格软件
PrismGraphPad 软件v7Scientific 数据分析软件
> 提供 生物技术

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.

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PCSK9 ProteolysisLuciferase AssayHigh Throughput ScreeningHEK293 CellsTransient TransfectionCoelenterazine ReagentConditioned MediumCleavage SequenceSNP AnalysisSmall Molecule Inhibitors

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