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方法文章

一种高通量荧光素酶检测法用于评估单次作用蛋白酶PCSK9的蛋白水解活性

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DOI：

10.3791/58265

⸱

2018年8月28日

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

本文内容

摘要

本方案介绍了一种在细胞环境中评估固有活性较低的单次周转蛋白酶蛋白水解活性的方法。具体而言，该方法应用于评估PCSK9的蛋白水解活性，PCSK9是脂质代谢的关键调控因子，其蛋白水解活性对其最终导致高胆固醇血症的功能至关重要。

摘要

前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）是一种单次作用的蛋白酶，可调节血清低密度脂蛋白（LDL）水平，从而影响心血管疾病的发生。尽管PCSK9的蛋白水解作用对其发挥完全的高胆固醇血症效应至关重要，但其蛋白酶功能的评估具有挑战性：目前已知PCSK9仅能自我切割，仅发生一次催化循环，且在蛋白水解后，其底物仍保留在活性位点中，成为自身抑制剂。本文所述方法提供了一种克服上述难题的检测手段。该检测方法基于细胞体系，聚焦于PCSK9的分子间蛋白水解作用，并将切割成功与否与分泌型荧光素酶活性相关联，后者可在培养上清液中便捷地检测。 通过 通过依次进行的诱变、瞬时转染和荧光素酶检测，该检测方法能够以高通量方式在基因或分子干扰条件下研究PCSK9的蛋白水解过程。该体系既适用于临床发现的错义单核苷酸多态性（SNPs）的生化评估，也适用于PCSK9蛋白水解小分子抑制剂的筛选。

引言

PCSK9 会靶向低密度脂蛋白受体（LDL-R）并促使其降解，从而升高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，推动动脉粥样硬化性心脏病的发生1,2。靶向 PCSK9 的治疗手段可显著降低 LDL-C 水平，并改善患者的心血管预后，即使在联合他汀类药物进行强化降脂治疗时仍具有疗效3,4。然而，目前获批的疗法仅限于基于抗体的方法，且存在成本效益不足的问题5,6。为解决这一问题，亟需开发成本更低的治疗替代方案、识别可能获得更大益处的患者的方法，或两者兼而有之。

小分子方法有望靶向细胞内PCSK9，提供更优的给药途径并降低成本，使其成为该领域的"终极目标"7。然而，PCSK9已被证明难以通过小分子药物进行靶向干预。作为一种蛋白酶，靶向PCSK9的蛋白水解功能是一种颇具吸引力的策略，因为自水解是PCSK9成熟过程中的限速步骤8，且对其在LDL-R上的最大效应至关重要9。然而迄今为止，该策略尚未取得成功，原因可能在于PCSK9独特的生物化学特性：PCSK9仅能切割自身10，表现为单次催化反应；在自切割后，PCSK9的前结构域仍保留在活性位点中，发挥自抑制作用11，从而阻止任何后续蛋白酶活性的检测。

本文介绍了一种高通量评估PCSK9蛋白水解功能的方法8。通过定点诱变，研究人员可利用该检测方法探究临床中发现的编码区单核苷酸多态性（SNPs）对蛋白水解——即PCSK9成熟过程中的限速步骤——的影响。此外，该方法可用于设计高通量筛选实验，以鉴定能够调节PCSK9蛋白水解的分子，这些分子有望最终阻断PCSK9向低密度脂蛋白受体（LDL-R）的呈递，从而调控PCSK9引起的高胆固醇血症效应。最后，只要满足以下两个条件，本方案也可适用于其他内源性活性较低的蛋白酶：i）能够找到特异性的底物-蛋白酶配对；ii）能够为底物建立合适的细胞内锚定位点。

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方案

1. 蛋白酶载体的定点突变

  1. 设计并订购定制合成的寡核苷酸，通过改进的标准定点突变技术引入目标突变12标准脱盐引物（无需额外纯化）完全可用。
    注意：引物设计的一般方法包括设计部分重叠的引物，如图所示 表1，使用熔解温度（Tm) 针对目标聚合酶的计算器。
  2. 在冰上按照指示设置用于定点突变的聚合酶链式反应（PCRs） 表 2.
  3. 按照指示进行PCR循环 表3.
  4. 运行 2 - 5 µL 在1%琼脂糖凝胶上电泳每轮PCR产物，并进行成像以确认扩增成功。
    注意：成功的PCR应显示一条清晰且单一的DNA条带，其大小位于模板的相应标记位置（约7.8 kB）。
  5. 添加 0.5 µL （每25）µL DpnI 反应，并将样品在 37 °C 1小时。
  6. 转化 2 µL 将反应物转入化学感受态 大肠杆菌 coli.
    注意：快速生长的 E. coli 菌株将缩短孵育时间，但任何克隆菌株均可接受。
  7. 将转化产物接种至含有 50 - 100 µg/mL 羧苄青霉素。将平板在37°C下孵育过夜 37 °C.
  8. 选择2 - 4个菌落接种于小规模培养体系中（2 - 5 mL LB培养基，含50 - 100 µg/mL 羧苄青霉素）。将培养物置于 37 °C 在220 rpm下振荡至浑浊。
  9. 使用质粒DNA纯化试剂盒从细胞中分离质粒DNA即，采用质粒小提（“miniprep”）试剂盒，按照制造商说明书操作。使用微量分光光度计测定洗脱DNA的浓度。
  10. 使用桑格测序服务（如核心实验室或商业机构）对质粒DNA进行广泛测序。根据测序服务的要求制备DNA样品。先前测序反应中成功使用的引物已在下文中注明 表4.
    注意：由于对整个质粒进行了PCR扩增，建议对每个突变体进行PCSK9编码区全长的测序。

2. 基于荧光素酶的高通量蛋白降解分析

  1. 细胞铺板（第0天）
    1. 使用低传代次数的HEK293T细胞进行实验，并在含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。所有细胞操作均须在无菌条件下于组织培养超净台内进行，直至准备检测荧光素酶活性。根据实验需求预估所需孔板数量，每种实验条件下的转染需设置三个重复孔。
    2. 用少量0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）处理亲代培养瓶中的HEK293T细胞，使其脱离。加入2倍体积含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的作用，并将细胞转移至无菌离心管中。使用自动细胞计数仪（并用台盼蓝染色）对细胞进行计数。在500 x g条件下离心离心管 g 5 分钟以回收细胞。
    3. 吸弃含胰蛋白酶的培养基，用培养液重悬细胞，调整细胞浓度至 2 x 105 细胞/mL。使用多通道移液器，转移 100 µL 将细胞接种至白色（不透光底）96孔板的每个孔中，最终接种浓度为 2 x 104 细胞/孔
      注意：在初次实验时，可额外接种一个同批次的透明底96孔板，以便在实验过程中监测细胞生长和贴壁情况，并为后续 troubleshooting 提供参考。
    4. 将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 24 小时。
    5. 制备质粒的主板，采用96孔板格式。用洗脱缓冲液（Tris-HCl，pH 8.5）将每种质粒稀释至50 ng/μL。µL 在96孔板的单个孔中。
      1. 为阳性对照（WT）质粒准备4个孔8，阴性对照（S386A）质粒8，以及无质粒缓冲液（用于模拟转染）。如果计划进行药物或其他基于细胞的处理，则在主板中每孔加入阳性对照（WT）质粒，并设置4孔阴性对照（S386A）质粒和4孔无质粒缓冲液。
  2. 转染（第1天）
    1. 在深孔96孔板中以96孔板格式配制转染混合物。转染实验设三个重复，并确保配制足量的试剂以补偿移液和转移过程中的损耗。
      注意：以下计算可制备足量试剂，用于以三复孔运行一块 96 孔板（保守估算按 420 个孔计）。
      1. 配制稀释的脂质转染试剂主混合液，加入 50.4 µL 试剂的用量 2050 µL 低血清培养基。制备DNA预复合试剂的主混合液，加入 33.6 µL 试剂加入 1730 µL 低血清培养基
      2. 使用多通道移液器，分装 16.8 µL 将稀释的DNA预复合试剂混合物加入深孔板的每个孔中。
      3. 使用多通道移液器，分装 3.2 µL (160 ng) 的每种质粒从主板转移到深孔板的每个孔中。
      4. 使用多通道移液器，分装 20 µL 将稀释后的脂质转染试剂混合物加入到培养板的每孔中，使用多通道移液器混匀各孔内容物。盖好培养板，在室温（RT）静置10–15分钟，以形成脂质:DNA复合物。
        注意：转染后，每孔的最终成分为：40 ng DNA， 0.12 µL 转染试剂，以及 0.08 µL DNA预复合试剂，每孔内容物将为 10 µL 总体积（减血清培养基）。
    2. 使用多通道移液器小心更换96孔板中293T细胞的培养基，注意避免扰动细胞。将吸除的培养基替换为 95 µL 含10% FBS的DMEM
      注意：此时可对细胞进行任何目标药物的处理。
    3. 添加 10 µL 将转染混合物加入到每个相应的孔中 通过 一个多通道移液器。轻轻摇晃培养板以混匀各孔中的内容物。将培养板在指定条件下孵育 37 °C 含5% CO2 24 h。
      注意：各孔的最终体积为 105 µL，以补偿24小时内蒸发损失。
  3. 检测（第2天）
    1. 配制腔肠素试剂的储备液：3 M 抗坏血酸钠（溶于磷酸盐缓冲液（PBS），现配现用）、5 M NaCl、10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA；溶于 PBS，现配现用）和 2 mM 腔肠素（溶于含酸化甲醇的溶液中） 200 µL 每10 mL含3 N HCl。
      注意：2 mM 腔肠素在 -20 °C 避光保存时可稳定存放 2 周80 °C 且在无光条件下。
    2. 根据细胞和培养基分别配制用于荧光素酶检测的2倍浓度腔肠素试剂， 表5. 除腔肠素外，先将所有试剂混合，再通过0.22-µm 注射器滤器过滤，然后加入腔肠素。试剂在加入培养板前需避光保存。
      注意：由于过滤过程中溶液会损失，需配制足够的试剂，以弥补过滤以及转移过程中的损耗。 表5 显示2倍浓度试剂的终浓度（以及向一个96孔板中加入一种试剂时所需储备液的体积）。
    3. 转染24小时后，从培养箱中取出细胞。使用多通道移液器，转移 50 µL 将每个孔的条件培养基转移至新的白色不透明96孔板中。
      1. 标记培养板，注明其内含物为培养基或细胞。若转染了多个96孔板，需对培养板进行配对标记，确保每块含培养基的培养板与其对应的细胞培养板一一对应。
    4. 使用多通道移液器，加入 50 µL 向仅含条件培养基的孔板中加入2x非裂解性腔肠素试剂。在避光条件下，于室温轻轻摇动或振荡孔板5-10分钟。
    5. 使用多通道移液器，加入 50 µL 向含有细胞的孔板中加入 2x 裂解型腔肠素试剂。在避光条件下，于室温轻轻振荡或摇动孔板 5 - 10 分钟。
    6. 孵育结束后，先使用酶标仪读取仅含培养基的孔板的发光信号，随后在同一酶标仪上读取含细胞孔板的发光信号。
    7. 弃去培养板，保存文件用于数据分析。

3. 数据分析

  1. 使用电子表格软件进行初步数据分析。创建一个电子表格，包含来自细胞平板和培养基平板的结果。
  2. 手动检查细胞板的数据，以识别转染效果不佳的孔。显示以下情况的孔 < 应将阴性对照（S386A）质粒检测结果的5%–10%视为转染效率低下，这些数据的解读需谨慎。
  3. 根据空载转染孔计算每块板的平均背景荧光值，将每块板的背景值从该板各孔的读数中扣除。
    注：该值可能因所使用的酶标仪不同而可忽略不计。
  4. 通过计算每孔中培养基内的荧光素酶活性占总荧光素酶活性的比例来处理数据。由于细胞培养板中含有条件培养基和细胞，而仅含培养基的培养板中的条件培养基量与细胞培养板中的相同，因此适用以下公式：
    分泌型荧光素酶计算公式：2×RLU_MEDIUM/(RLU_MEDIUM+RLU_CELLS)，生化分析方程。
    此处，RLU = 相对发光单位（relative luminescence units），即酶标仪读数经背景扣除后的结果。
  5. 计算阳性对照（WT）和阴性对照（S386A）孔中分泌的荧光素酶的平均值。
  6. 通过计算Z因子来评估实验的整体质量13:
    Z因子方程；用于评估检测质量的统计分析，公式图像：1-3(σ_ACTIVE+σ_INACTIVE)/|μ_ACTIVE-μ_INACTIVE|
    注意：活性值来自阳性对照（WT）孔，非活性值来自阴性对照（S386A）孔。数值越接近1，表示实验质量越高。如果数值低于0，建议重复实验或优化实验流程。
  7. 将数据从电子表格程序传输至科学数据分析软件。
  8. 将分泌型荧光素酶活性归一化至阳性对照（WT）和阴性对照（S386A）的平均值，设定阳性对照为1，阴性对照为0。
  9. 使用回归与异常值剔除（ROUT）法对数据进行异常值清洗，设定最大错误发现率为1%。
  10. 通过将每种突变条件（或突变体）的数据与野生型（WT）活性的均值（归一化为1）进行比较，评估是否存在统计学上的显著差异。进行多次非配对检验 t-t检验，采用Holm-Sidak法校正多重比较，α = 0.05。

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结果

高通量蛋白酶解检测依赖于克服三个主要挑战。首先，为克服单次催化循环中PCSK9蛋白酶固有的低活性，采用缺失抑制性前结构域的PCSK9蛋白酶，并将前结构域末端的切割序列与可分泌的荧光素酶相连接。14其次，为了满足蛋白酶与其抑制性前结构域形成复合物后正确折叠的需求，这两种多肽被共表达 在转染中 在细胞环境中15,16, 通过 一种双顺反子载体。第三，为了区分被切割与未被切割的底物，将PCSK9蛋白酶在C678位点进行截短，该截短可阻止PCSK9复合物从内质网（ER）中转运出去，但不影响其蛋白水解功能。17,18综上所述，这使得可以通过检测分泌的荧光素酶来间接评估PCSK9蛋白水解的存在及其程度（图1A）...

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讨论

上述实验步骤提供了一种克服单次催化蛋白酶PCSK9本征活性低下的方法，并以稳健的方式评估其蛋白水解功能。该检测方法的关键原理在于将单次催化事件转化为酶促放大的检测信号。该方法的优势包括荧光素酶报告系统具有相对较短的检测周期、操作简便，且可扩展至高通量分析。此外，该检测在天然的细胞环境中评估蛋白水解过程。更重要的是，利用该方法可评估临床上鉴定的单核苷酸多态性（SNPs）对PCSK9蛋白水解功能的影响，而无需任何人体或患者组织样本，仅需了解目标基因型即可。

该检测方法存在若干技术局限性。尽管该检测能够评估细胞内的蛋白水解过程，但其需要过表达载体。由于检测依赖于对 HEK293T 细胞系的瞬时转染，转染效率会增加孔间固有的变异性。虽然蛋白酶失活突变体 S386A PCSK9 可作为蛋白水解的阴性对照，但它同时也可作为转染本身的阳性对照，因为这些细胞能够产生有功能的、尽管被滞留在细胞内的荧光素酶。通过分析细胞培养板的原始数据，有助于识别转染效率存在显著差异的样本，这些数据可被剔除（如有需要，可重复实验）。此外，将分泌型荧光素酶占总荧光素酶产量的比例进行数据处理，有助于校正质粒递送和转录水平...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢来自 NHLBI/NIH（K08 HL124068 和 LRP HMOT1243）、通过加州大学旧金山分校临床与转化科学研究所催化剂项目获得的 NCATS/NIH 资助（UL1 TR000004）、加州大学旧金山分校学术参议会、赫尔曼基金会、吉利德科学研究学者奖、辉瑞 ASPIRE 心血管奖（以上各项资助均授予 John S. Chorba）以及霍华德·休斯医学研究所（授予 Adri M. Galvan 和 Kevan M. Shokat）提供的慷慨资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PCR管USA Scientific1402-2900用于PCR
Q5 Hot StartNew England BiolabsM0493L高保真DNA聚合酶
脱氧核苷酸溶液混合物New England BiolabsN0447LdNTPs（用于PCR）
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT作者提供n/a可向作者索取
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A作者提供n/a可向作者索取
低电渗琼脂糖（Agarose LE）Gold BiotechnologyA-201-100用于DNA凝胶
E-Gel成像系统（配备蓝光底座）ThermoFisher Scientific4466612用于DNA凝胶成像
SYBR Safe DNA凝胶染料ThermoFisher ScientificS33102用于DNA凝胶染色
Tris碱ThermoFisher ScientificBP152-1用于DNA凝胶电泳缓冲液
冰乙酸ThermoFisher ScientificA38-500用于DNA凝胶电泳缓冲液
乙二胺四乙酸溶液Millipore Sigma3690EDTA，用于DNA凝胶电泳缓冲液
1 kb DNA MarkerGold BiotechnologyD010DNA分子量标准
DpnINew England BiolabsR0176S限制性内切酶
含100 µg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板TeknovaL1010LB-Carb平板
One Shot Mach1 T噬菌体抗性化学感受态E. coliThermoFisher ScientificC862003化学感受态细胞
LB肉汤（Miller配方）ThermoFisher ScientificBP1426-2LB培养基
羧苄青霉素Gold BiotechnologyC-103-5选择性抗生素
E.Z.N.A. 质粒小量提取试剂盒IOmega BioTekD6942-02DNA纯化小量提取试剂盒
NanoDrop 2000分光光度计ThermoFisher ScientificND-2000C分光光度计
293T细胞美国典型培养物保藏中心（ATCC）CRL-3216HEK 293T细胞
DMEM（高糖，含丙酮酸钠）ThermoFisher Scientific11995065DMEM，哺乳动物细胞培养基
胎牛血清Axenia BiologixF001FBS
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红ThermoFisher Scientific25300062胰蛋白酶，用于细胞解离
磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher Scientific10010023PBS
Countess全自动细胞计数仪ThermoFisher ScientificC10227全自动细胞计数
Countess细胞计数板载玻片ThermoFisher ScientificC10228细胞计数用载玻片
CELLSTAR组织培养板，白色，白底，带盖Grenier Bio-One655083白色、白底96孔板
TempPlate无裙边96孔PCR板，透明USA Scientific1402-9596用于主质粒板的96孔板
Nunc 2.0 mL深孔板ThermoFisher Scientific27874396孔深孔板
Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000008脂质体转染试剂，Lf3K
P3000试剂ThermoFisher ScientificL3000008DNA预复合试剂，随Lf3K提供
OptiMEM I减血清培养基ThermoFisher Scientific31985062用于转染的减血清培养基
(+)-L-抗坏血酸钠Millipore SigmaA4034抗坏血酸钠
氯化钠Millipore SigmaS9888NaCl
牛血清白蛋白，第五组分，低重金属Millipore Sigma12659BSA
甲醇（HPLC级）ThermoFisher ScientificA4524MeOH
盐酸VWRJT9535-2浓HCl
腔肠素Gold BiotechnologyCZ2.5荧光素酶底物
注射器滤器，无菌ThermoFisher Scientific09-720-3无菌滤器，PVDF材质，孔径0.22 µm
Pipet-Lite多通道移液器 L12-200XLS+Rainin17013810多通道移液器
Pipet-Lite多通道移液器 L12-20XLS+Rainin17013808多通道移液器
Pipet-Lite多通道移液器 L12-10XLS+Rainin17013807多通道移液器
试剂储液槽Corning4870试剂槽
离心管，15 mLThermoFisher Scientific05-539-1215 mL离心管
离心管，50 mLCorning43082950 mL离心管
Spark微孔板读板仪TecanN/a微孔板读板仪
ExcelMicrosoft2016 for Mac电子表格软件
PrismGraphPad Softwarev7科学数据分析软件

参考文献

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