本方案介绍了一种在细胞环境中评估固有活性较低的单次周转蛋白酶蛋白水解活性的方法。具体而言，该方法应用于评估PCSK9的蛋白水解活性，PCSK9是脂质代谢的关键调控因子，其蛋白水解活性对其最终导致高胆固醇血症的功能至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）是一种单次作用的蛋白酶，可调节血清低密度脂蛋白（LDL）水平，从而影响心血管疾病的发生。尽管PCSK9的蛋白水解作用对其发挥完全的高胆固醇血症效应至关重要，但其蛋白酶功能的评估具有挑战性：目前已知PCSK9仅能自我切割，仅发生一次催化循环，且在蛋白水解后，其底物仍保留在活性位点中，成为自身抑制剂。本文所述方法提供了一种克服上述难题的检测手段。该检测方法基于细胞体系，聚焦于PCSK9的分子间蛋白水解作用，并将切割成功与否与分泌型荧光素酶活性相关联，后者可在培养上清液中便捷地检测。 通过 通过依次进行的诱变、瞬时转染和荧光素酶检测，该检测方法能够以高通量方式在基因或分子干扰条件下研究PCSK9的蛋白水解过程。该体系既适用于临床发现的错义单核苷酸多态性（SNPs）的生化评估，也适用于PCSK9蛋白水解小分子抑制剂的筛选。
引言
PCSK9 会靶向低密度脂蛋白受体（LDL-R）并促使其降解，从而升高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，推动动脉粥样硬化性心脏病的发生1,2。靶向 PCSK9 的治疗手段可显著降低 LDL-C 水平，并改善患者的心血管预后，即使在联合他汀类药物进行强化降脂治疗时仍具有疗效3,4。然而，目前获批的疗法仅限于基于抗体的方法，且存在成本效益不足的问题5,6。为解决这一问题，亟需开发成本更低的治疗替代方案、识别可能获得更大益处的患者的方法，或两者兼而有之。
小分子方法有望靶向细胞内PCSK9，提供更优的给药途径并降低成本，使其成为该领域的"终极目标"7。然而，PCSK9已被证明难以通过小分子药物进行靶向干预。作为一种蛋白酶，靶向PCSK9的蛋白水解功能是一种颇具吸引力的策略，因为自水解是PCSK9成熟过程中的限速步骤8，且对其在LDL-R上的最大效应至关重要9。然而迄今为止，....
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方案
1. 蛋白酶载体的定点突变
- 设计并订购定制合成的寡核苷酸，通过改进的标准定点突变技术引入目标突变12标准脱盐引物（无需额外纯化）完全可用。
注意：引物设计的一般方法包括设计部分重叠的引物，如图所示 表1，使用熔解温度（Tm) 针对目标聚合酶的计算器。 - 在冰上按照指示设置用于定点突变的聚合酶链式反应（PCRs） 表 2.
- 按照指示进行PCR循环 表3.
- 运行 2 - 5 µL 在1%琼脂糖凝胶上电泳每轮PCR产物，并进行成像以确认扩增成功。
注意：成功的PCR应显示一条清晰且单一的DNA条带，其大小位于模板的相应标记位置（约7.8 kB）。 - 添加 0.5 µL （每25）µL DpnI 反应，并将样品在 37 °C 1小时。
- 转化 2 µL 将反应物转入化学感受态 大肠杆菌 coli.
注意：快速生长的 E. coli 菌株将缩短孵育时间，但任何克隆菌株均可接受。 - 将转化产物接种至含有 50 - 100 µg/mL 羧苄青霉素。将平板在37°C下孵育过夜 37 °C.
- 选择2 - 4个菌落接种于小规模培养体系中（2 - ....
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结果
高通量蛋白酶解检测依赖于克服三个主要挑战。首先，为克服单次催化循环中PCSK9蛋白酶固有的低活性，采用缺失抑制性前结构域的PCSK9蛋白酶，并将前结构域末端的切割序列与可分泌的荧光素酶相连接。14其次，为了满足蛋白酶与其抑制性前结构域形成复合物后正确折叠的需求，这两种多肽被共表达 在转染中 在细胞环境中15,16, 通过 一种双顺反子载体。第三，为了区分被切割与未被切割的底物，将PCSK9蛋白酶在C678位点进行截短，该截短可阻止PCSK9复合物从内质网（ER）中转运出去，但不影响其蛋白水解功能。17,18综上所述，这使得可以通过检测分泌的荧光素酶来间接评估PCSK9蛋白水解的存在及其程度（图1A）.......
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讨论
上述实验步骤提供了一种克服单次催化蛋白酶PCSK9本征活性低下的方法，并以稳健的方式评估其蛋白水解功能。该检测方法的关键原理在于将单次催化事件转化为酶促放大的检测信号。该方法的优势包括荧光素酶报告系统具有相对较短的检测周期、操作简便，且可扩展至高通量分析。此外，该检测在天然的细胞环境中评估蛋白水解过程。更重要的是，利用该方法可评估临床上鉴定的单核苷酸多态性（SNPs）对PCSK9蛋白水解功能的影响，而无需任何人体或患者组织样本，仅需了解目标基因型即可。
该检测方法存在若干技术局限性。尽管该检测能够评估细胞内的蛋白水解过程，但其需要过表达载体。由于检测依赖于对 HEK293T 细胞系的瞬时转染，转染效率会增加孔间固有的变异性。虽然蛋白酶失活突变体 S386A PCSK9 可作为蛋白水解的阴性对照，但它同时也可作为转染本身的阳性对照，因为这些细胞能够产生有功能的、尽管被滞留在细胞内的荧光素酶。通过分析细胞培养板的原始数据，有助于识别转染效率存在显著差异的样本，这些数据可被剔除（如有需要，可重复实验）。此外，将分泌型荧光素酶占总荧光素酶产量的比例进行数据处理，有助于校正质粒递送和转录水平.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢来自 NHLBI/NIH（K08 HL124068 和 LRP HMOT1243）、通过加州大学旧金山分校临床与转化科学研究所催化剂项目获得的 NCATS/NIH 资助（UL1 TR000004）、加州大学旧金山分校学术参议会、赫尔曼基金会、吉利德科学研究学者奖、辉瑞 ASPIRE 心血管奖（以上各项资助均授予 John S. Chorba）以及霍华德·休斯医学研究所（授予 Adri M. Galvan 和 Kevan M. Shokat）提供的慷慨资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PCR管 | USA Scientific | 1402-2900 | 用于PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | 高保真DNA聚合酶 |
| 脱氧核苷酸溶液混合物 | New England Biolabs | N0447L | dNTPs（用于PCR） |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | 作者提供 | n/a | 可向作者索取 |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | 作者提供 | n/a | 可向作者索取 |
| 低电渗琼脂糖（Agarose LE） | Gold Biotechnology | A-201-100 | 用于DNA凝胶 |
| E-Gel成像系统（配备蓝光底座） | ThermoFisher Scientific | 4466612 | 用于DNA凝胶成像 |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | ThermoFisher Scientific | S33102 | 用于DNA凝胶染色 |
| Tris碱 | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | 用于DNA凝胶电泳缓冲液 |
| 冰乙酸 | ThermoFisher Scientific | A38-500 | 用于DNA凝胶电泳缓冲液 |
| 乙二胺四乙酸溶液 | Millipore Sigma | 3690 | EDTA，用于DNA凝胶电泳缓冲液 |
| 1 kb DNA Marker | Gold Biotechnology | D010 | DNA分子量标准 |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | 限制性内切酶 |
| 含100 µg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板 | Teknova | L1010 | LB-Carb平板 |
| One Shot Mach1 T噬菌体抗性化学感受态E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | 化学感受态细胞 |
| LB肉汤（Miller配方） | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB培养基 |
| 羧苄青霉素 | Gold Biotechnology | C-103-5 | 选择性抗生素 |
| E.Z.N.A. 质粒小量提取试剂盒I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA纯化小量提取试剂盒 |
| NanoDrop 2000分光光度计 | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | 分光光度计 |
| 293T细胞 | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | CRL-3216 | HEK 293T细胞 |
| DMEM（高糖，含丙酮酸钠） | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM，哺乳动物细胞培养基 |
| 胎牛血清 | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | ThermoFisher Scientific | 25300062 | 胰蛋白酶，用于细胞解离 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess全自动细胞计数仪 | ThermoFisher Scientific | C10227 | 全自动细胞计数 |
| Countess细胞计数板载玻片 | ThermoFisher Scientific | C10228 | 细胞计数用载玻片 |
| CELLSTAR组织培养板，白色，白底，带盖 | Grenier Bio-One | 655083 | 白色、白底96孔板 |
| TempPlate无裙边96孔PCR板，透明 | USA Scientific | 1402-9596 | 用于主质粒板的96孔板 |
| Nunc 2.0 mL深孔板 | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96孔深孔板 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | 脂质体转染试剂，Lf3K |
| P3000试剂 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA预复合试剂，随Lf3K提供 |
| OptiMEM I减血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 31985062 | 用于转染的减血清培养基 |
| (+)-L-抗坏血酸钠 | Millipore Sigma | A4034 | 抗坏血酸钠 |
| 氯化钠 | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| 牛血清白蛋白，第五组分，低重金属 | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| 甲醇（HPLC级） | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| 盐酸 | VWR | JT9535-2 | 浓HCl |
| 腔肠素 | Gold Biotechnology | CZ2.5 | 荧光素酶底物 |
| 注射器滤器，无菌 | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | 无菌滤器，PVDF材质，孔径0.22 µm |
| Pipet-Lite多通道移液器 L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | 多通道移液器 |
| Pipet-Lite多通道移液器 L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | 多通道移液器 |
| Pipet-Lite多通道移液器 L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | 多通道移液器 |
| 试剂储液槽 | Corning | 4870 | 试剂槽 |
| 离心管，15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL离心管 |
| 离心管，50 mL | Corning | 430829 | 50 mL离心管 |
| Spark微孔板读板仪 | Tecan | N/a | 微孔板读板仪 |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | 电子表格软件 |
| Prism | GraphPad Software | v7 | 科学数据分析软件 |
参考文献
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
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重印与许可
