通过带有可切除抗生素抗性盒的 P1 转导在 Escherichia coli 中实现基因缺失

摘要

本文介绍一种利用已有的抗生素抗性盒缺失构建体作为基础，在其他大肠杆菌（E. coli）菌株中构建缺失突变体的实验方案。此类缺失突变可通过P1噬菌体转导技术，转移并插入至受体菌株的相应基因位点。

摘要

研究细菌中未知基因功能的初步方法是构建该基因的敲除突变体。本文介绍一种高效且快速的实验方案，用于将基因缺失突变从一个菌株转移到另一个菌株 大肠杆菌 通过使用噬菌体P1的普遍性转导，将突变从一个菌株转移到另一个菌株。该方法要求突变是可选择的（例如， 基于使用抗生素抗性盒插入导致的基因破坏）。这类抗生素抗性盒可从供体菌株转移并导入目标受体菌株，从而快速、简便地构建基因缺失突变体。抗生素抗性盒可设计为包含弗林普酶识别位点，使其能够通过位点特异性重组酶介导被切除，仅在基因组中留下约100个碱基对长度的瘢痕序列，实现无痕敲除。我们通过敲除 tamA 编码参与自转运蛋白生物合成的组装因子的基因，并检测该基因敲除对两种三聚体自转运粘附素生物合成与功能的影响。尽管通过P1转导进行基因缺失存在局限性，但其操作简便且速度快，使其成为其他基因缺失方法的一种有吸引力的替代方案。

引言

研究基因功能的常用初始方法是进行基因敲除突变，并观察由此产生的表型，这种方法也称为反向遗传学。在过去约70年中，大肠杆菌（E. coli）因其易于培养以及适合遗传操作，一直是分子生物学研究的主要模式生物¹。目前已发展出多种在E. coli中实现基因缺失的方法，包括标记交换突变技术^2,3，以及近年来使用的基于λ Red或Rac ET系统的重组工程（recombineering）技术^4,5,6。

在一个广泛应用的系统中，单个基因的编码序列被一个抗生素抗性盒所替代，该抗性盒随后可从染色体上切除^5,7。编码序列被替换，例如被一个卡那霉素（Kan）抗性盒替代，该抗性盒两侧由翻转酶（FLP）识别靶点（FRT）位点包围。FRT位点可被重组酶FLP识别，FLP介导FRT位点之间的特异性重组，从而导致Kan抗性盒的删除。通过这种方法，可实现对特定基因编码序列的完全删除，仅留下约100个碱基对（b....

方案

1. 菌株与质粒

1. 细菌菌株
   1. 使用 E. coli 菌株 BW25113⁵，JW4179（BW25113） tamA::kan)⁷，BL21(DE3)²⁰，和 BL21ΔABCF²¹参见 材料清单 如需更多信息。
2. 噬菌体
   1. 使用噬菌体 P1病毒 用于普遍性转导。将噬菌体以液体形式保存，并加入几滴氯仿（参见步骤 2.2）。欲了解更多信息，请参见 材料表.
3. 质粒
   1. 在本方案中使用以下质粒：pCP20²²pIBA2-YadA²³和 pEibD10²⁴作为对照质粒，使用 pASK-IBA2 和 pET22b（参见 材料清单).

结果

构建 BL21ΔABCF 的 tamA 基因敲除菌株：

上述策略先前已被用于构建BL21(DE3)的一个衍生菌株，该菌株是一种用于蛋白质生产的标准实验室菌株，经过优化可高效表达外膜蛋白，命名为BL21ΔABCF²¹。该菌株缺失了四个编码高丰度外膜蛋白的基因，因此相较于野生型菌株，能够表达更多的异源外膜蛋白。为了检测TAM是否参与TAA的生物合成，我们在该菌株背景下删除了tamA基因。

使用Keio文库菌株JW4179制备P1噬菌体裂解液，该菌株中tamA基因（先前称为yftM）的编码序列已被卡那霉素抗性盒取代。随后以BL21ΔABCF作为受体菌株进行转导实验。获得多个卡那霉素抗性菌落后，选取其中两个进行卡那霉素抗性盒的切.......

讨论

P1 转导是一种在大肠杆菌（E. coli）中快速、稳健且可靠的基因敲除方法。本文通过将 Keio 供体菌株中的 tamA 基因缺失突变转导至 BL21 衍生的受体菌株，展示了该方法的应用。转导过程主要包括转导裂解液的制备、转导反应本身、卡那霉素抗性盒的切除以及通过 PCR 验证基因敲除结果。整个流程大约需要 1 周时间，除最后的 PCR 验证外，无需使用任何分子生物学技术。因此，在所需投入的时间和工作量方面，P1 转导可与 λ Red 重组技术相媲美，且远快于传统的标记交换诱变方法。

所提供的方案非常稳健，允许对许多步骤进行修改。然而，仍有一些关键参数需要注意。对于P1感染，必须向培养基中添加钙离子。钙离子是噬菌体吸附到细菌所必需的，若培养基中未加入足量的钙，将显著降低感染效率。某些细菌菌株（如BL21ΔABCF）在存在CaCl₂的情况下容易发生聚集。₂²¹在此类情况下，细菌可在无CaCl₂的条件下培养。₂，可在感染前短时间内加入该悬浮液中。但对于更常规.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
菌株
E. coli BW25113	NIG	ME6092	Keio文库的野生型菌株
E. coli BL21(DE3)	Merck	69450-3	表达菌株
E. coli BL21DABCF	Addgene	102270	源自BL21(DE3)
E. coli JW4179	NIG	JW4179-KC	tamA基因缺失突变体
P1 vir	NIG	HR16	通用性转导噬菌体
质粒
pCP20	CGSC	14177	带有FLP的条件性复制质粒
pASK-IBA2	IBA GmbH	2-1301-000	表达载体
pEibD10	N/A	N/A	用于EibD蛋白的生产；质粒可应要求提供
pET22b+	Merck	69744-3	表达载体
pIBA2-YadA	N/A	N/A	用于YadA蛋白的生产；质粒可应要求提供
化学试剂
乙酸	ThermoFisher	33209
琼脂	BD Bacto	214010
琼脂糖	Lonza	50004
氨苄青霉素	Applichem	A0839
无水四环素	Abcam	ab145350
抗I型胶原抗体COL-1	Sigma	C2456
牛I型胶原	Sigma	C9791
氯化钙	Merck	102382
氯仿	Merck	102445
磷酸氢二钠	VWR	28029
DNA染料	Thermo	S33102
DNA分子量标记物	New England BioLabs	N3232S
DNase I	Sigma	DN25
dNTP混合液	New England Biolabs	N0447
ECL HRP底物	Advansta	K-12045
EDTA	Applichem	A2937
甘油	VWR	24388
山羊抗小鼠IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005
山羊抗兔IgG-HRP	Agrisera	AS10668
HEPES	VWR	30487
异丙基硫代半乳糖苷	VWR	43714
卡那霉素	Applichem	A1493
溶菌酶	Applichem	A4972
氯化镁	VWR	25108
氯化锰	Sigma	221279
N-月桂酰肌氨酸	Sigma	L9150
脱脂奶粉	Sigma	70166
氯化钠	VWR	27808
tamA 正向引物	Invitrogen	N/A	序列 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA 反向引物	Invitrogen	N/A	序列 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA聚合酶	New England Biolabs	M0267
柠檬酸三钠	Merck	106448
胰蛋白胨	VWR	84610
Tween20	Sigma	P1379
酵母提取物	Merck	103753
设备
琼脂糖凝胶电泳槽	Hoefer	SUB13
珠磨破碎仪	Thermo	FP120A-115
CCD相机	Kodak	4000R
电穿孔比色皿	Bio-Rad	165-2089
电穿孔仪	Bio-Rad	1652100
凝胶成像系统	Nippon Genetics	GP-03LED
恒温摇床	Infors HT	Minitron
培养箱	VWR	390-0482
微量离心机	Eppendorf	5415D
微波炉	Samsung	CM1099A
PCR仪	Biometra	Tpersonal
PCR八联管	Axygen	PCR-0208-CP-C
pH计	Hanna Instruments	HI2211-01
PVDF膜	ThermoFisher	88518
SDS-PAGE电泳槽	ThermoFisher	A25977
台式离心机	Beckman Coulter	B06322
涡旋混合器	Scientific Industries	SI-0236
水浴锅	GFL	D3006
湿法转膜仪	Hoefer	TE22