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方法文章

一种通过基因组编辑在Drosophila中高效构建组织特异性双元转录系统的方法

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⸱

DOI：

10.3791/58268

⸱

2018年9月19日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

本文内容

摘要

本文介绍一种通过将基因的第一个编码外显子替换为转录驱动元件，从而在Drosophila中构建组织特异性双元转录系统的方法。该基于CRISPR/Cas9的技术将转录激活序列置于被替换基因的内源性调控元件控制之下，从而实现转录激活因子仅在特定基因时空表达模式中特异性表达。

摘要

二元转录系统是功能强大的遗传学工具，广泛用于模式生物中特定细胞或组织群体的细胞命运可视化及基因表达操控。该系统包含两个独立的转基因品系：驱动品系在组织特异性启动子/增强子控制下表达一种转录激活因子，报告基因/效应基因品系则在转录激活因子结合位点的下游携带目标基因。同时携带这两个组分的个体可实现目标基因在特定组织中的特异性转录激活。在靶向组织中实现基因的精确时空表达，对于无偏倚地解读细胞/基因活性至关重要。因此，建立一种能够生成严格细胞/组织特异性驱动品系的方法十分必要。本文介绍一种通过利用 "成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关" 基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术。在该方法中，内切酶Cas9由两条嵌合向导RNA（gRNA）引导，靶向基因第一个编码外显子中的特定位点 果蝇 基因组以产生双链断裂（DSB）。随后，利用含有转录激活因子序列的外源供体质粒，细胞自主的修复机制可介导双链断裂的同源定向修复（HDR），从而实现外显子被转录激活因子序列的精确删除与替换。插入的转录激活因子仅在那些 顺式-被替换基因的调控元件具有功能。本文提供的详细逐步实验方案用于构建在特定细胞或组织中表达的双元转录驱动系统 果蝇fgf/无分支可产生上皮/神经元细胞的方法可适用于任何基因或组织特异性表达。

引言

在Drosophila中，用于靶向基因表达的遗传工具箱已得到充分发展，使其成为研究参与多种细胞过程的基因功能的最佳模式系统之一。二元表达系统，例如酵母Gal4/UAS（上游激活序列），最初被应用于Drosophila遗传模型中的组织特异性增强子捕获和基因异位表达1（图1）。该系统推动了大量技术的发展，如在特定细胞群中实现基因过表达、异位表达、基因敲除，以及细胞消融、细胞标记、胚胎和组织中细胞与分子过程的活体示踪、发育过程中的谱系追踪和嵌合体分析。除原始的Gal4/UAS系统外，目前在Drosophila中广泛应用的还有多种二元转录系统，例如细菌LexA/LexAop系统（图1）和Neurospora Q系统，这些均为强大的遗传工具，可用于靶向基因表达1,2,3。

本文介绍了一种利用基因组编辑技术构建高度可靠组织特异性二元表达系统的方法。近年来，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的进步为在多种生物中实现定向基因组改造提供了前所未有的机遇。与其他现有的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9 系统具有成本低、效率高和可靠性强的优点。该技术利用了细菌适应性免疫系统的组分：来自Streptococcus pyogenes的 Cas9 内切酶，可在基因组特定位置产生双链断裂（DSB）；以及一种嵌合的向导 RNA（gRNA），可引导 Cas9 定位于特定基因组位点以实现靶向 DSB4。细胞内存在多种修复 DSB 的机制。非同源末端连接（NHEJ）通常导致小片段的插入或缺失，从而破坏基因功能；而同源定向修复（HDR）则可通过外源提供的 HDR 供体模板，实现特定且可预测的基因组敲入或敲除。基于 HDR 的替换策略可高效用于构建高度可靠的组织特异性二元表达系统，从而克服传统增强子捕获方法的全部局限性。本文详细描述了利用 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复机制，构建在果蝇（Drosophila）基因内源性转录及转录后调控元件控制下表达的二元转录驱动品系的逐步操作流程。在本方案中，我们以编码 FGF 家族蛋白的branchless（bnl）基因为例，该基因调控气管上皮的分支形态发生5。在此实例中，bnl 基因的第一个编码外显子被细菌LexA 转录激活因子序列所替换，而未改变bnl 基因任何内源性的cis-调控序列。我们证明，该策略成功构建了bnl-LexA 驱动品系，可在bnl 表达的上皮细胞、间充质细胞及神经元细胞中，时空特异性地调控位于LexA 操纵子（LexAop 或 LexO）下游的报告基因表达。

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方案

1. 设计与构建gRNA表达载体

  1. 为了精确替换外显子中一段较长的定义区域，可采用双gRNA策略6，其中每条gRNA可特异性靶向所选目标区域的两端。为了获得驱动基因精确的基因特异性时空表达，应选择位于该基因第一个编码外显子内的两个gRNA靶位点。
  2. 对于Drosophila melanogaster，使用flyCRISPR最优靶点查找工具（http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/）选择gRNA靶位点。也可使用其他可用的CRISPR设计工具，包括优化的CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）、FlyCas9（https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9）和E-CRISP（www.e-crisp.org/E-CRISP）。
    注意：以下gRNA设计与克隆的实验方案改编自先前描述的方法6,7。
    1. 将实际序列复制到在线工具提供的输入框中。在“Select genome”下拉菜单中选择最新发布的Drosophila melanogaster基因组注释版本“r_6”。在“Select guide length (nt)”字段中输入“20”。选择“Find All CRISPR targets”，然后点击“Find CRISPR Targets”。
    2. 通过将“Stringency”设置为“Maximum”、“PAM”设置为“NGG Only”来评估所有候选gRNA靶点。尽量选择无潜在脱靶位点或脱靶位点最少的gRNA位点。使用Doench et al. 2014 8中描述的网络工具，选择具有“良好”活性评分潜力的gRNA。
    3. 同时，确保所选用于注射的亲本果蝇品系（例如位于X染色体上的nos-Cas9，BL# 54591）基因组中gRNA靶点区域不存在单核苷酸多态性（SNP）。按照Gratz et al. 20157中描述的方案，从亲本果蝇品系中提取基因组DNA。使用跨越目标序列两侧的引物和高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增约500–1,000 nt的区域，并对PCR产物进行测序验证。
  3. 为构建串联gRNA表达载体，采用无连接酶克隆法6，将两个原间隔序列插入pCFD4 RNA表达载体中。请注意，现已提供改进的多gRNA表达载体（pCFD5），其中两个sgRNA均由强U6:3启动子驱动表达9（https://www.crisprflydesign.org）。可使用DNA组装方法将gRNA克隆至pCFD4载体中。
    1. 设计并订购用于将两个原间隔序列插入RNA表达载体pCFD4的正向和反向引物（表1A）。如先前所述6，正向引物包含第一个原间隔序列，其两侧为对应于pCFD4中U6-1启动子和gRNA核心的区域；反向引物包含第二个原间隔序列的反向互补序列，其两侧为对应于gRNA核心和pCFD4中U6-3启动子的区域。
    2. 使用无DNase和RNase的双蒸水（ddH2O）将引物重悬至100 μM，配制10 μM的工作浓度引物。以pCFD4质粒为模板，使用高保真聚合酶及推荐的PCR反应条件进行PCR扩增6。
    3. 为将扩增产物克隆至pCFD4中，使用BbsI酶对pCFD4质粒进行酶切，反应体系如下：2–5 μg pCFD4质粒、5 μL 10×酶切缓冲液、1 μL BbsI酶，用ddH2O补足至终体积50 μL。轻轻弹击离心管混匀反应液，并短暂离心使管壁上的液滴收集至管底。37 °C孵育2小时。
    4. 将第2步的PCR产物和第3步的酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。电泳足够时间以完全分离DNA条带。在紫外透射仪下切取正确大小的DNA条带，并按照制造商说明使用凝胶回收柱纯化目标产物（见材料表）。PCR产物应为600 bp，线性化pCFD4质粒应约为6.4 kb6。
    5. 按照制造商说明（见材料表），在PCR管中设置DNA组装反应。
    6. 将2 μL组装产物转化至感受态细菌（DH5α或具有ΔrecA1、ΔendA1的类似菌株），涂布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB（LB/Amp）琼脂平板上，37 °C过夜培养。注意：DNA组装混合物可能对某些细菌菌株具有毒性，但稀释组装混合物可降低毒性。
    7. 从过夜培养的平板上挑取3–4个抗氨苄青霉素的单菌落，接种至含100 μg/mL氨苄青霉素的3 mL LB培养基中，在37 °C摇床中过夜培养。按照制造商说明使用质粒小提试剂盒提取过夜培养细菌中的质粒（见材料表）。
    8. 使用T3通用引物对质粒进行测序，筛选含有正确串联gRNA插入的克隆。将测序验证正确的pCFD4-gRNA转化菌株制备成20%甘油菌，并保存于-80 °C冰箱中以备后续使用。

2. 设计并构建HDR供体质粒

  1. 用于基因组敲入的 Gal4 或 LexA 序列，设计一个双链HDR供体，其中包含由两个同源臂侧接的转录激活因子序列。
    1. 使用 >位于gRNA靶向位点两侧的1.5 kb左右同源臂。延长的同源臂可提高修复过程中同源定向修复（HDR）的效率 10.
    2. 从选定用于注射的亲本果蝇品系中提取基因组DNA（gDNA），并以此为模板通过PCR扩增同源臂例如，nos-Cas9 （位于X染色体上），BL# 54591）。使用适用于长片段PCR扩增的高保真热启动Taq DNA聚合酶（参见 材料表）。进行序列验证。
  2. 为避免gRNA对编辑后位点的重新靶向，设计替换供体时应使外源序列的插入破坏gRNA识别位点。
    注意：为避免改变假定的顺式调控元件，应始终在编码外显子区域内选择gRNA识别位点。
  3. 为生成替换盒，需设计DNA组装策略，将四个片段连接在一起：5’和3’同源臂、中间的外源转录激活因子DNA序列，以及线性化的克隆载体骨架例如， pUC19 或其他常用克隆载体）。根据DNA组装试剂盒的制造商说明（见材料表），设计适用于PCR扩增和各片段组装的引物。用ddH₂O将引物重悬至100 μM。2O. 配制10 μM工作浓度的引物。所有PCR反应均使用高保真聚合酶。按照以下方案操作：
    1. PCR扩增一个 Gal4 或 LexA 表达盒从现有载体中获取（例如，nls-LexA:p65；理想的 Gal4/LexA/QF2 表达质粒可从 Addgene 等常见资源中查找并获取，所用引物列于 表1B.
      1. 为保留被替换外显子对转录激活因子DNA序列表达的所有原始转录及转录后调控，应设计表达盒，使得编辑后的基因组等位基因表达出转录激活因子与目的基因的嵌合mRNA。保留靶向外显子的5’端和3’端，以维持任何剪接信号。
      2. 在残余的5’编码外显子与转录激活因子序列之间插入一段T2A自剪切肽序列，以防止翻译产生嵌合蛋白。在外源性转录激活因子序列之后添加一个翻译终止密码子。图5).
    2. 从选定用于注射的亲本果蝇品系中提取基因组DNA（gDNA），并以此为模板通过PCR扩增同源臂例如，nos-Cas9 （位于X染色体上），BL# 54591）使用下表所列引物 表1B使用高保真聚合酶进行所有PCR反应，反应体系如下：5 μL 5x反应缓冲液，0.5 μL 10 mM dNTPs，1.25 μL 10 μM 正向引物，1.25 μL 10 μM 反向引物，0.5 μL 模板DNA，0.25 μL 高保真DNA聚合酶，16.25 μL ddH₂O。2O.
    3. 使用线性化的克隆载体，例如 pUC19。目前已有多种供体载体可供使用。完整列表请见以下网站：http://flycrispr.molbio.wisc.edu。
    4. 在1%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物。电泳时间应足够长，以确保目标条带与非特异性条带（如有）之间实现清晰分离。对预期的DNA片段进行凝胶纯化。使用分光光度计测定各纯化DNA片段的浓度。
    5. 按照制造商的说明设置DNA组装反应。将第3步和第4步中获得的线性化克隆载体和目标片段混合 在以下反应体系中：1 μL 线性克隆载体（50 ng/μL），每种目标片段过量 2–3 倍，10 μL 2x DNA 组装预混液，用 ddH₂O 定容至终体积 20 μL2O. 将反应混合物在 50 °C 下孵育 1 小时。
    6. 将2 μL连接产物转化至感受态细菌中，涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB/Amp琼脂平板。同时，在平板中加入X-Gal和IPTG进行蓝白斑筛选。
    7. 从过夜培养的平板上挑取3–4个白色菌落，接种于3 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C摇床过夜培养。使用质粒小提试剂盒，按照制造商说明书提取过夜培养细菌中的质粒（参见 材料表).
    8. 通过PCR或限制性酶切筛选阳性菌落。
    9. 对最终质粒的HDR供体区域进行测序验证。将含有正确克隆的菌液加入20%甘油，于-80 °C保存菌种，用于后续接种。

3. 胚胎注射、果蝇遗传学及基因组编辑筛选

  1. 使用质粒大提试剂盒制备高纯度无内毒素的gRNA表达载体以及HDR供体质粒（参见 材料表).
  2. 共同注射gRNA表达质粒（100 ng/μL）和替换供体质粒（500 ng/μL）至生殖系中 nos-Cas9 胚胎6注意：我们使用商业服务进行注射，但该操作也可在实验室中自行完成。
  3. 果蝇遗传学与筛选图2 和 图3):
    1. 当注射的胚胎发育为成体后，将每条单个的G与0 将果蝇与平衡染色体果蝇杂交。为含有目标等位基因的染色体选择合适的平衡染色体。
    2. 将每对G0代杂交所得的F1代子代用CO₂麻醉2 垫板并在体视显微镜下随机选取10-20只雄性个体，按图示方式分别与平衡染色体雌性个体进行单对杂交 图3.
    3. 当F2代幼虫孵化后，从每次杂交中挑选出单个F1代父本，并使用单只果蝇基因组DNA提取方案提取基因组DNA：
      1. 配制基因组DNA提取缓冲液：10 mM Tris-Cl pH 8.2，1 mM EDTA，25 mM NaCl，室温保存。配制20 mg/mL蛋白酶K储存液，置于冷冻保存。
      2. 将每只果蝇放入一个1.5 mL微量离心管中，并标记管子。在-80 °C冰箱中保存过夜。
      3. 配制含有终浓度为 200 µg/mL 蛋白酶 K 的基因组 DNA 提取缓冲液新鲜工作液。
        注意：此步骤请勿使用陈旧的缓冲液。
      4. 用含有50 μL裂解缓冲液的移液器吸头按压每只果蝇10–15秒，期间不排出液体。将剩余缓冲液排入离心管中并充分混匀。37 °C孵育20–30分钟。
      5. 将离心管置于95 °C金属浴中加热1–2分钟，以灭活蛋白酶K。
      6. 以 10,000 x g 离心 5 分钟 g将制备好的样品于 4 °C 保存，以备后续 PCR 分析。
  4. 使用相同的方法从 a 中提取基因组 DNA nos-Cas9 果蝇，作为阴性对照。采用三步PCR筛选方法鉴定正确的“末端外”HDR（图2, 图5使用每只F1代雄性个体的基因组DNA作为模板5使用1 μL DNA样品进行以下PCR反应体系：10 μL含染料的2× PCR预混液，1 μL各引物（10 μM），1 μL DNA模板，以及7 μL ddH₂O。2O.
  5. 如图所示 图 5A，使用引物fwd1和rev1进行PCR，以检测插入或替换的存在；使用引物fwd2和rev2进行PCR，以从3’区域验证插入或替换；使用引物M13F和rev3进行PCR，以检测“ends-in”型HDR表 1C).
  6. 将确认发生末端外切同源定向修复（ends-out HDR）的果蝇品系与平衡染色体果蝇杂交，从F2代建立平衡品系。再次与平衡染色体果蝇回交，以去除其他染色体上可能存在的非预期突变。
  7. 从已建立的菌种中制备高质量基因组DNA，用于长片段PCR扩增>800–1,000 nt）的扩增子，使用高保真Taq聚合酶，并对来自基因组编辑区域的扩增子进行全长测序验证。或者，如前所述使用粗提gDNA提取物来扩增较短的（<800 nt）的重叠PCR产物，以对编辑后的基因组进行测序验证。请使用以下方案制备高质量 果蝇 基因组DNA
    1. 将约25只成年果蝇放入1.5 mL微量离心管中，置于-20 °C或-80 °C冰箱中冷冻至少1小时。
    2. 加入250 μL溶液A（0.1 M Tris HCl，pH 9.0，0.1 M EDTA，1% SDS）。
    3. 使用研磨杵在微量离心管中匀浆果蝇，并将试管置于冰上。
    4. 70 °C 下孵育 30 分钟。
    5. 加入35 μL KOAc（5 M），振荡并充分混匀，但不要涡旋。
    6. 冰上孵育30分钟。
    7. 以 12,000 x g 15分钟。
    8. 使用1 mL微量移液器，小心地将澄清的上清液转移至新管中，避免转移任何沉淀物或中间相。
    9. 向 supernatant 中加入 150 μL 异丙醇。轻轻颠倒混匀。
    10. 以 10,000 x g 离心 g 5 分钟。
    11. 小心吸除上清液，将沉淀留在管中。
    12. 用1 mL 70% EtOH洗涤沉淀。
    13. 以 12,000 x g 离心 g 5 分钟。
    14. 移除上清液。将沉淀物在空气中干燥15至20分钟。切勿过度干燥沉淀物。
    15. 将沉淀溶解于100 μL ddH₂O中2O.
    16. 使用适用于长扩增子的高保真DNA聚合酶（>800 bp）以扩增完整的编辑区域。理想情况下，选择插入盒外侧的两个引物来扩增基因组区域。对PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化，并如前所述，使用多个重叠引物对产物进行测序验证。
  8. 验证经基因改造的果蝇品系中解剖所得组织/胚胎的时空表达模式是否正确：
    1. 进行逆转录PCR 从总RNA中验证杂交mRNA产物的表达表 1D).
    2. 执行 原位 通过将目的mRNA产物与幼虫组织/胚胎进行杂交，以验证其表达。
    3. 为了在经序列验证的末端外显子编辑品系中筛选出精确的组织特异性时空表达模式，将获得的每一种基因编辑品系与二元表达驱动系统进行杂交 LexO-GFP 或 LexO-RFP（用于 LexA 驱动) 系（可从Bloomington保种中心获得）并观察 LexA 或 Gal4 在荧光显微镜下检测胚胎、幼虫和成体组织中由驱动子介导的报告基因表达。

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结果

该方案已成功用于构建针对bnl表达细胞的特异性靶向双元表达报告系统5。调控bnl复杂时空表达的cis调控元件（CREs）尚未被明确。因此，为了在内源性bnl调控序列控制下实现时空特异性表达，仅将bnl的第一个编码外显子替换为细菌LexA转录激活因子的序列。选用了一种改进的nls-LexA::p65表达盒，该表达盒在Drosophila中可实现最佳表达效果。

替换策略旨在内源性转录及转录后调控下生成嵌合的 nls-LexA:p65-bnl mRNA。该嵌合mRNA包含完整的 bnl 5'非翻译区（UTR）、被编辑的 bnl 编码外显子（第一外显子）的5'端部分和3'端部分，以及完整的下游 bnl...

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讨论

传统上，Drosophila 增强子捕获系通过两种不同方法构建。其中一种方法是通过转座（例如 P 元件转座）将驱动子序列（如 Gal4）随机插入基因组中1。另一种方法则是将驱动子序列置于质粒构建体中假定的增强子/启动子区域的转录调控之下，随后将该构建体整合到基因组的异位位点3,11。尽管这些方法已为 Drosophila 产生了大量 Gal4 或 LexA 增强子捕获系，但仍存在若干局限性。P 元件介导的基因组随机插入可能破坏关键的 cis 调控序列的调控活性；由于转座在基因组中的随机性，转录激活因子的表达可能反映多个邻近基因的表达模式。另一方面，构建增强子捕获质粒需要预先了解目标基因的 cis 调控序列，且质粒构建体中可克隆和测试的序列长度也受到限制。从内源基因组环境中分离并克隆出的DNA片段可能无法完全再现基因特异性的表达模式。例如，bn...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 F. Port 博士、K. O'Connor-Giles 博士和 S. Feng 博士在 CRISPR 策略方面的讨论；感谢 T.B. Kornberg 博士和布卢明顿果蝇资源中心提供试剂；感谢马里兰大学影像核心设施；以及美国国立卫生研究院（NIH）提供的经费支持：SR 获得 R00HL114867 和 R35GM124878 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218克隆
LB-琼脂BD DifcoBD 244520克隆
Tris-HClSigma AldrichT3253分子生物学
EDTASigma AldrichE1161分子生物学
NaClSigma AldrichS7653分子生物学
UltraPure 无DNase/RNase水ThermoFisher Scientific10977-023分子生物学
10% SDSSigma Aldrich71736分子生物学
KOAcFisher-ScientificP1190分子生物学
EtOHFisher-Scientific04-355-451分子生物学
GeneJET 质粒小提试剂盒ThermoFisher ScientificK0503质粒小量提取
PureLink HiPure 质粒大提试剂盒ThermoFisher ScientificK210006质粒大量提取
BbsINEBR0539S限制性内切酶
引物IDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg 实验室gRNA的DNA模板和载体
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-高保真TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly 主混合液NEBNEB #E2611DNA组装
pBPnlsLexA:p65UwAddgeneLexA扩增的DNA模板
蛋白酶KThermoFisher Scientific25530049分子生物学
2x PCR 预混液（含染料，红色）SydlabMB067-EQ2R分子生物学
凝胶回收试剂盒Zymo Research (Genesee Scientific)11-300分子生物学
TRI 试剂Sigma-Aldrich分子生物学
Direct-zol RNA 提纯试剂盒Zymo Research (Genesee Scientific)11-330分子生物学
OneTaq 一步法RT-PCR试剂盒NEBE5315S分子生物学
lexO-CherryCAAXKornberg 实验室果蝇品系
UAS-CD8:GFPKornberg 实验室果蝇品系
btl-Gal4Kornberg 实验室果蝇品系
MKRS/TB6BKornberg 实验室果蝇品系
共聚焦显微镜 SP5XLeica成像表达模式
CO2 培养站Genesee Scientific59-122WCU果蝇操作
体视显微镜OlympusSZ-61果蝇操作
微型离心管匀浆杵Fisher-Scientific03-421-217基因组DNA提取
NanoDrop 分光光度计ThermoFisher ScientificND-1000DNA定量

参考文献

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