方法文章

基于基因组编辑的果蝇组织特异二进制转录系统的高效生成策略

DOI：

10.3791/58268

⸱

2018年9月19日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了一个方法, 以产生组织特定的二进制转录系统的果蝇, 取代第一编码外显子的基因与转录驱动。CRISPR/Cas9-based 方法在被替换的基因的内生调控下放置一个 transactivator 序列, 从而促进 transctivator 表达专门在基因特定的时空模式。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

二进制转录系统是强大的遗传工具, 广泛用于可视化和操作细胞的命运和基因表达在特定群体的细胞或组织的模型有机体。这些系统包含两个组分作为分开的转基因线。一条驱动线在组织特异的促进剂/促增强剂的控制下表达转录激活物, 一个报告/效应线将一个目标基因放置在转录激活器的结合部位。饲养两个组分的动物诱导了靶基因表达的组织特异转录激活。精确的时空表达基因在靶向组织是至关重要的无偏见的解释细胞/基因活动。因此, 开发一种生成专属细胞/组织特定驱动程序线的方法是必不可少的。在这里, 我们提出了一个方法来产生高度组织特定的目标表达系统, 采用 "聚集定期 Interspaced 短回文重复/CRISPR 相关" (CRISPR/Cas) 的基因组编辑技术。在这种方法中, 限制性 Cas9 的目标是两个嵌合导向 rna (gRNA) 到特定地点的第一编码外显子的基因在果蝇基因组, 以创建双链断裂 (争端)。随后, 使用含有 transactivator 序列的外源性捐赠质粒, 细胞自主修复机械能够实现争端处理机构的同源定向修复 (HDR), 从而精确删除和替换外显子与 transactivator序列。被敲入的 transactivator 是完全地表达在被替换的基因的cis调控元素起作用的细胞。在这里提出的详细的分步协议, 以产生一个二进制转录驱动程序表达在果蝇/branchless产生的上皮/神经细胞细胞可以采取任何基因或组织特定的表达。

引言

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基因工具箱的目标基因表达已经在果蝇中得到了很好的发展, 这使得它成为一个最好的模型系统, 以调查有关基因的功能, 涉及多种细胞过程。二进制表达系统, 如酵母Gal4/UAS (上游活化序列), 首次采用的组织特异性增强诱捕和基因 misexpression 在果蝇遗传模型1 (图 1)。该系统促进了许多技术的发展, 如基因过度表达的时空调控, misexpression, 在选定的细胞组的挖空, 以及细胞消融, 细胞标记, 细胞和分子的实时追踪在发育过程中的胚胎和组织, 沿袭追踪和马赛克分析。一些二进制转录系统, 如细菌莱克萨/莱克萨操作系统 (图 1) 和粗糙Q 系统, 是强大的基因工具, 现在广泛用于果蝇,除了原 Gal4/UAS 系统的目标基因表达1,2,3。

在这里, 我们提出了一个方法来生成高可靠的组织特定的二进制表达系统, 采用基因组编辑技术。最近在 CRISPR/Ca....

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方案

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1. gRNA 表达载体的设计与构造

  1. 要精确替换外显子的长定义区域, 请使用双 gRNA 方法6, 其中每个 gRNA 可以专门针对所选区域的两端。为了获得一个精确的基因特定的时空表达的驱动程序, 选择两个 gRNA 目标网站内的第一编码外显子的基因。
  2. 对于果蝇, 使用 flyCRISPR 最佳目标查找工具 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) 选择 gRNA 目标站点。其他可用的 CRISPR 设计工具也可以使用 , 包括优化的 CRISPR 设计工具 ( http : / / crispr . mit . edu ) , FlyCas9 ( https : / / shigen . . ac . jp / fly / nigfly / cas9 ) 和电子脆 ( www . e - crisp . org / E - CRISP ) 。
    注意: gRNA 设计和克隆的以下协议是从先前描述的6、7的方法中采用的。
    1. 将实际序列复制到联机工具中提供的框中。选择最近发布的果蝇基因组注释版本 "r_6", 在 "选择基因组" 下拉菜单中。在 "选择指南长度 (nt)" 字....

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结果

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该协议成功地用于生成一个特定于bnl表达单元5的目标二进制表达式报告器系统。控制复杂时空bnl表达的cis调控元素 (重新审查) 没有特征。因此, 为了在内源bnl调控序列的控制下实现时空表达, 只有bnl的第一编码外显子被设计为以细菌莱克萨transactivator 序列取代。一个改进的 nls-莱克萨::p 65盒已知提供最佳的表达在果蝇被选中。

替代策略旨在在内源转录和转录后控制下生成嵌合体nls-LexA:p65-bnl mRNA。这种嵌合 mRNA 包含完整的bnl 5 ' UTR, 部分 5 ' 末端和 3 ' 结尾的编辑bnl编码外显子 (第一显子), 和完整的下游bnl内含子.......

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讨论

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传统上,果蝇增强器陷阱是由两种不同的方法产生的。其中一个方法包括随机插入一个驱动程序 (例如, Gal4) 序列在基因组中通过移位 (e., P 元素移位)1 。或者, 驱动程序序列可以放置在一个假定的增强/启动子区域的转录控制的质粒结构, 然后将集成到基因组3,11的异位点。虽然这些方法已经产生了大量的Gal4或莱克萨增强器陷阱的果蝇, 他们有几个限制。P 元素介导的随机插入基因组可能扰乱关键的cis监管序列的监管活动。由于基因组中的随机移位, transactivator 表达可能会报告多个相邻基因的模式。另一方面, 一个基因的 cis 调控序列的先验知识是一个增强-陷阱质粒结构的必要。在质粒结构中可以克隆和测试序列的长度也有限制。仅从内源基因组中分离和克隆 DNA 的部分片段可能不会重现完整的基因特定表达模式。例如, bnl-Gal4 .......

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披露

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作者没有披露的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 f 港博士、奥康纳博士和冯博士就 CRISPR 战略进行讨论;肺结核科恩伯格博士和布卢明顿试剂中心;UMD 成像核心设施;和从 NIH 获得的资金: R00HL114867 和 R35GM124878 到 SR。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
X-Gal/IPTGGentrox （Genesee Scientific）18-218克隆
LB-琼脂BD DifcoBD 244520克隆
Tris-HClSigma AldrichT3253分子生物学
EDTASigma AldrichE1161分子生物学
NaClSigma AldrichS7653分子生物学
UltraPure DNase/RNase Free WaterThermoFisher Scientific10977-023分子生物学
10% SDSSigma Aldrich71736分子生物学
KOAcFisher-ScientificP1190分子生物学
EtOHFisher-Scientific04-355-451分子生物学
GeneJET 小量制备ThermoFisher ScientificK0503小量制备
PureLink HiPure 质粒 Maxipep 试剂盒ThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539S限制性内切酶
引物IDT-DNA
PCR pCFD4科恩伯格实验室gRNA 的 DNA 模板和载体
KAPA HiFi 热启动 - （Kapa Biosystems）Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-高保真 TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly 预混液NEBNEB #E2611DNA 组装
pBPnlsLexA：用于 LexA 扩增的 p65UwAddgeneDNA 模板
蛋白酶 KThermoFisher Scientific25530049分子生物学
2x PCR 预混液，含染料（红色）SydlabMB067-EQ2R分子生物学
凝胶洗脱试剂盒Zymo Research （Genesee Scientific）11-300分子生物学
TRI 试剂Sigma-Aldrich分子生物学
直接-zol RNA 纯化试剂盒Zymo Research （Genesee Scientific）11-330分子生物学
OneTaq一步法 RT-PCR 试剂盒NEBE5315S分子生物学
lexO-CherryCAAX科恩伯格实验室飞线
UAS-CD8：GFP科恩伯格实验室飞线
btl-Gal4科恩伯格实验室飞线
MKRS/TB6B科恩伯格实验室飞线
共聚焦显微镜 SP5X徕卡成像表达模式
CO2 站杰纳西科学59-122WCU飞推
显微镜奥林巴斯SZ-61飞推
微管均质杵Fisher-Scientific03-421-217基因组 DNA 分离
NanoDrop 分光光度计ThermoFisher ScientificND-1000DNA 定量
立体

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

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CRISPR Cas9 RNA GAL4 LexA

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