本文介绍一种通过将基因的第一个编码外显子替换为转录驱动元件，从而在Drosophila中构建组织特异性双元转录系统的方法。该基于CRISPR/Cas9的技术将转录激活序列置于被替换基因的内源性调控元件控制之下，从而实现转录激活因子仅在特定基因时空表达模式中特异性表达。
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本文内容
摘要
摘要
二元转录系统是功能强大的遗传学工具，广泛用于模式生物中特定细胞或组织群体的细胞命运可视化及基因表达操控。该系统包含两个独立的转基因品系：驱动品系在组织特异性启动子/增强子控制下表达一种转录激活因子，报告基因/效应基因品系则在转录激活因子结合位点的下游携带目标基因。同时携带这两个组分的个体可实现目标基因在特定组织中的特异性转录激活。在靶向组织中实现基因的精确时空表达，对于无偏倚地解读细胞/基因活性至关重要。因此，建立一种能够生成严格细胞/组织特异性驱动品系的方法十分必要。本文介绍一种通过利用 "成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关" 基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术。在该方法中，内切酶Cas9由两条嵌合向导RNA（gRNA）引导，靶向基因第一个编码外显子中的特定位点 果蝇 基因组以产生双链断裂（DSB）。随后，利用含有转录激活因子序列的外源供体质粒，细胞自主的修复机制可介导双链断裂的同源定向修复（HDR），从而实现外显子被转录激活因子序列的精确删除与替换。插入的转录激活因子仅在那些 顺式-被替换基因的调控元件具有功能。本文提供的详细逐步实验方案用于构建在特定细胞或组织中表达的双元转录驱动系统 果蝇fgf/无分支可产生上皮/神经元细胞的方法可适用于任何基因或组织特异性表达。
引言
在Drosophila中，用于靶向基因表达的遗传工具箱已得到充分发展，使其成为研究参与多种细胞过程的基因功能的最佳模式系统之一。二元表达系统，例如酵母Gal4/UAS（上游激活序列），最初被应用于Drosophila遗传模型中的组织特异性增强子捕获和基因异位表达1（图1）。该系统推动了大量技术的发展，如在特定细胞群中实现基因过表达、异位表达、基因敲除，以及细胞消融、细胞标记、胚胎和组织中细胞与分子过程的活体示踪、发育过程中的谱系追踪和嵌合体分析。除原始的Gal4/UAS系统外，目前在Drosophila中广泛应用的还有多种二元转录系统，例如细菌LexA/LexAop系统（图1）和Neurospora Q系统，这些均为强大的遗传工具，可用于靶向基因表达1,2,3。
本文介绍了一种利用基因组编辑技术构建高度可靠组织特异性二元表达系统的方法。近年来，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术....
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方案
1. 设计与构建gRNA表达载体
- 为了精确替换外显子中一段较长的定义区域，可采用双gRNA策略6，其中每条gRNA可特异性靶向所选目标区域的两端。为了获得驱动基因精确的基因特异性时空表达，应选择位于该基因第一个编码外显子内的两个gRNA靶位点。
- 对于Drosophila melanogaster，使用flyCRISPR最优靶点查找工具（http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/）选择gRNA靶位点。也可使用其他可用的CRISPR设计工具，包括优化的CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）、FlyCas9（https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9）和E-CRISP（www.e-crisp.org/E-CRISP）。
注意：以下gRNA设计与克隆的实验方案改编自先前描述的方法6,7。- 将实际序列复制到在线工具提供的输入框中。在“Select genome”下拉菜单中选择最新发布的Drosophila melanogaster基因组注释版本“r_6”。在“Select guide length (n....
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结果
该方案已成功用于构建针对bnl表达细胞的特异性靶向双元表达报告系统5。调控bnl复杂时空表达的cis调控元件（CREs）尚未被明确。因此，为了在内源性bnl调控序列控制下实现时空特异性表达，仅将bnl的第一个编码外显子替换为细菌LexA转录激活因子的序列。选用了一种改进的nls-LexA::p65表达盒，该表达盒在Drosophila中可实现最佳表达效果。
替换策略旨在内源性转录及转录后调控下生成嵌合的 nls-LexA:p65-bnl mRNA。该嵌合mRNA包含完整的 bnl 5'非翻译区（UTR）、被编辑的 bnl 编码外显子（第一外显子）的5'端部分和3'端部分，以及完整的下游 bnl.......
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讨论
传统上，Drosophila 增强子捕获系通过两种不同方法构建。其中一种方法是通过转座（例如 P 元件转座）将驱动子序列（如 Gal4）随机插入基因组中1。另一种方法则是将驱动子序列置于质粒构建体中假定的增强子/启动子区域的转录调控之下，随后将该构建体整合到基因组的异位位点3,11。尽管这些方法已为 Drosophila 产生了大量 Gal4 或 LexA 增强子捕获系，但仍存在若干局限性。P 元件介导的基因组随机插入可能破坏关键的 cis 调控序列的调控活性；由于转座在基因组中的随机性，转录激活因子的表达可能反映多个邻近基因的表达模式。另一方面，构建增强子捕获质粒需要预先了解目标基因的 cis 调控序列，且质粒构建体中可克隆和测试的序列长度也受到限制。从内源基因组环境中分离并克隆出的DNA片段可能无法完全再现基因特异性的表达模式。例如，bn.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 F. Port 博士、K. O'Connor-Giles 博士和 S. Feng 博士在 CRISPR 策略方面的讨论；感谢 T.B. Kornberg 博士和布卢明顿果蝇资源中心提供试剂；感谢马里兰大学影像核心设施；以及美国国立卫生研究院（NIH）提供的经费支持：SR 获得 R00HL114867 和 R35GM124878 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | 克隆 |
| LB-琼脂 | BD Difco | BD 244520 | 克隆 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | 分子生物学 |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | 分子生物学 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | 分子生物学 |
| UltraPure 无DNase/RNase水 | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | 分子生物学 |
| 10% SDS | Sigma Aldrich | 71736 | 分子生物学 |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | 分子生物学 |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | 分子生物学 |
| GeneJET 质粒小提试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K0503 | 质粒小量提取 |
| PureLink HiPure 质粒大提试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K210006 | 质粒大量提取 |
| BbsI | NEB | R0539S | 限制性内切酶 |
| 引物 | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg 实验室 | gRNA的DNA模板和载体 | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-高保真Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly 主混合液 | NEB | NEB #E2611 | DNA组装 |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | LexA扩增的DNA模板 | |
| 蛋白酶K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | 分子生物学 |
| 2x PCR 预混液（含染料，红色） | Sydlab | MB067-EQ2R | 分子生物学 |
| 凝胶回收试剂盒 | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | 分子生物学 |
| TRI 试剂 | Sigma-Aldrich | 分子生物学 | |
| Direct-zol RNA 提纯试剂盒 | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | 分子生物学 |
| OneTaq 一步法RT-PCR试剂盒 | NEB | E5315S | 分子生物学 |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg 实验室 | 果蝇品系 | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg 实验室 | 果蝇品系 | |
| btl-Gal4 | Kornberg 实验室 | 果蝇品系 | |
| MKRS/TB6B | Kornberg 实验室 | 果蝇品系 | |
| 共聚焦显微镜 SP5X | Leica | 成像表达模式 | |
| CO2 培养站 | Genesee Scientific | 59-122WCU | 果蝇操作 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ-61 | 果蝇操作 |
| 微型离心管匀浆杵 | Fisher-Scientific | 03-421-217 | 基因组DNA提取 |
| NanoDrop 分光光度计 | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA定量 |
参考文献
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....
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重印与许可
