慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。
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本文内容
摘要
摘要
慢性淋巴细胞白血病（CLL）以恶性B细胞克隆扩增为特征，是西方国家最常见的白血病类型。大多数CLL患者疾病进展缓慢，其白血病细胞表现为无能（anergic）表型，即B细胞受体对外源性刺激无反应。我们近期研究发现，转录因子NFAT2在CLL细胞无能状态中起关键调控作用。在不同疾病中分析转录因子功能时，一个主要挑战是鉴定其特异性靶基因。这一点对于 阐明致病机制及潜在治疗干预具有重要意义。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）是一种用于检测蛋白质与DNA相互作用的经典技术，因此可用于鉴定哺乳动物细胞中转录因子的直接靶基因。本文中，ChIP被用于鉴定 LCK 作为NFAT2在人类CLL细胞中的直接靶基因。使用甲醛对DNA及其结合蛋白进行交联，随后通过超声处理将DNA剪切为约200-500个碱基对（bp）的片段。利用抗NFAT2抗体（αNFAT2抗体）从细胞碎片中选择性地免疫沉淀与NFAT2交联的DNA片段。经纯化后，通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测结合的DNA片段。富集明显的DNA序列代表基因组中被NFAT2靶向的区域。 在体DNA的适当剪切以及所需抗体的选择对于该方法的成功应用尤为关键。本方案适用于演示NFAT2与靶基因之间的直接相互作用。其主要局限性在于，难以在大规模检测中将染色质免疫沉淀技术（ChIP）应用于完整生物体内多种转录因子靶基因的分析。
引言
慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家成人中最常见的白血病，其特征是表达CD19、CD23和CD5的成熟B细胞显著积聚1。大多数患者病情进展缓慢，多年内无需 特殊治疗。相比之下，部分患者病情迅速进展，需立即接受免疫化疗或其他靶向治疗2,3。活化T细胞核因子（NFAT）是一类转录因子家族，调控多种细胞类型的发育和活化过程4,5,6。我们近期研究发现，在病情缓慢进展的CLL患者中，CLL细胞存在NFAT2的过表达及其组成性激活7。在此类细胞中，NFAT2调控一种对B细胞受体刺激无反应的状态，称为无能（anergy）7。为证实NFAT2能够结合人CLL细胞中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）启动子并调控LCK的表达，本研究建立并应用了一种特异性的染色质免疫沉淀实验（ChIP）。
染色质免疫沉淀（ChIP）是研究转录因子在基因表达中作用的多种技术之一8
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方案
所有涉及 人体材料的实验均经蒂宾根大学伦理委员会批准，并已获得参与本研究样本提供的所有患者的书面知情同意。
1. Jurkat 细胞的分离与刺激
注意：为了优化该实验方案，建议使用已知高表达 NFAT2 的 Jurkat 细胞系。所有步骤均需在层流罩内进行。
- 将RPMI 1640培养基加入10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素，置于37 °C水浴中预热，配制50 mL。
- 在细胞培养瓶中，用20 mL含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养Jurkat细胞1–2天，使细胞密度达到约2 × 106 个/mL（通过台盼蓝染色和血球计数板在显微镜下计数），然后以200 × g离心5分钟收集细胞。
- 用移液器吸除上清液，将细胞重悬于10 mL含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。随后，使用常规台盼蓝染色法和血球计数板在显微镜下对细胞进行计数。
- 将步骤1.3中的细胞以200 × g离心5分钟，吸除上清液。然后将细胞重悬于含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中，调整细胞密度为2 × 107 个/mL，并用移液器将1 mL细胞悬....
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结果
图1展示了对一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者进行CD19-FITC和CD5-PE抗体染色后的典型流式细胞术分析结果。图1a显示了淋巴细胞的设门区域，这些细胞在CLL患者的血液中占大多数。图1b显示了CD19+/CD5+ CLL细胞的比例，在本例中占淋巴细胞的89.03%。该患者体内CD19+/CD5- B细胞的比例为3.72%。
图2展示了不同固定时间处理的Jurkat细胞中抗体性能的示例，通过SDS-PAGE和Western Blot进行评估。分析了来自不同生产商的多种抗体。图2a<.......
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讨论
成功进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验的关键步骤包括选择合适的抗体以及优化染色质剪切过程25。在本实验方案的开发过程中，αNFAT2抗体的选择尤为困难。尽管目前市面上有多种αNFAT2抗体，且其中大多数适用于Western印迹及其他应用，但只有克隆号为7A6的抗体能够成功用于ChIP实验7。即使是来自不同生产商、标称为相同的7A6抗体，在ChIP实验中的表现也存在显著差异。一个主要挑战在于，XChIP实验流程中所使用的交联固定过程可能破坏目标蛋白的抗原表位25。
染色质剪切步骤对于获得XChIP实验的合适结果也至关重要。在本NFAT2 ChIP方案中，通过琼脂糖凝胶电泳评估，200-500 bp的片段大小被证明是最佳的7。若剪切条件不当，导致起始DNA材料不足或DNA片段过小或过大，通常会在进行该检测时产生次优结果。使用冻存后复融的外周血单个核细胞（PBMCs）时，也观察到剪切效果不理想。因此.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）资助项目 MU 3340/1-1 和德国癌症援助基金会（Deutsche Krebshilfe）资助项目 111134（两项资助均授予 M.R.M.）。我们感谢 Elke Malenke 提供出色的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL 试管振荡器 Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | 可用类似仪器替代 |
| 10X Bolt 样品还原剂 | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS 电泳缓冲液 | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37% 甲醛 p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS 样品缓冲液 | Thermo Scientific | B0007 | |
| 抗 NFAT2 抗体 | Alexis | 1008505 | 克隆号 7A6 |
| 抗 NFAT2 抗体 | Cell Signaling | 8032S | 克隆号 D15F1 |
| 抗 NFAT2 抗体 ChIP 级 | Abcam | ab2796 | 克隆号 7A6 |
| 大型离心机 | Eppendorf | 5804R | 可用类似仪器替代 |
| CD19-FITC 小鼠抗人抗体 | BD Biosciences | 555412 | 克隆号 HIB19 |
| CD5-PE 小鼠抗人 CD5 抗体 | BD Biosciences | 555353 | 克隆号 UCHT2 |
| 密度梯度介质 Biocoll（密度 1.077 g/mL） | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind 1.5 mL 管 | eppendorf | 22431021 | |
| 优质 FBS | Merck | S0615 | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCalibur | 可用类似仪器替代 |
| Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100X） | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 蛋白转印装置 | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 转印膜堆，硝酸纤维素，标准尺寸 | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIP-seq 组蛋白检测试剂盒 | Diagenode | C01010059 | |
| 钙离子霉素钙盐 | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT 驴抗兔 IgG (H + L)，0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG (H + L)，0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey 近红外成像系统 | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 96 孔白色多孔板 | Roche | 4729692001 | 可用其他实时 PCR 仪器的板替代 |
| 裂解液 OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA 级水 | Covaris | 520101 | |
| M220 专注式超声破碎仪 | Covaris | 500295 | |
| 磁力架，DynaMag-15 磁铁 | Thermo Scientific | 12301D | 可用类似仪器替代 |
| MEM 非必需氨基酸溶液 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| 显微镜 Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | 可用类似仪器替代 |
| microTUBE AFA 纤维预切带卡口盖 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| 改进型 Neubauer 计数板 | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | 可用类似仪器替代 |
| NH4 肝素单采血管 | Sarstedt | 02.1064 | |
| 无核酸酶水 | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔 | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® 封闭缓冲液（TBS）500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| 青霉素/链霉素 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| 引物 CD40L 启动子区正向引物 | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| 引物 CD40L 启动子区反向引物 | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| 引物 IL-2 启动子区正向引物 | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| 引物 IL-2 启动子区反向引物 | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| 引物 LCK 启动子区正向引物 | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| 引物 LCK 启动子区反向引物 | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| 兔单克隆 IgG XP 同型对照抗体 | Cell Signaling | # 3900S | 克隆号 DA1E |
| 实时 PCR 仪 | Roche | LightCycler 480 | 可用类似仪器替代 |
| 滚轴混合器 | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物 | Thermo Scientific | 61870010 | |
| 安全型 Multifly 针头 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 预染蛋白标准品 | Thermo Scientific | LC5925 | |
| 振荡器 Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | 可用类似仪器替代 |
| 小型离心机 | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | 可用类似仪器替代 |
| 丙酮酸钠 | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-巯基乙醇 | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris 缓冲盐水（TBS-10X） | Cell Signaling | #12498 | |
| 台盼蓝溶液 | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
参考文献
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A.
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重印与许可
