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小鼠发育期及有丝分裂后视网膜中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的免疫组织化学检测

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DOI：

10.3791/58274

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2018年8月29日

 ,  ,  , 
1BioTime, Inc

本文内容

摘要

本报告的目的是描述在发育中和有丝分裂后的小鼠视网膜中对表观遗传标志物5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）进行可靠免疫组织化学检测的实验方案。

摘要

视网膜发育的表观遗传学是一个研究较为深入的领域，有望加深人们对多种人类视网膜变性疾病机制的理解，并明确新的治疗方向。小鼠视网膜的核结构具有两种不同的模式：常规模式和倒置模式。常规模式具有普遍性，其异染色质位于细胞核边缘，而具有活性的常染色质则位于细胞核内部。相反，倒置的核结构模式仅见于成年视杆光感受器细胞的细胞核，其异染色质位于细胞核中心，而常染色质则位于细胞核边缘。DNA甲基化主要出现在染色中心。DNA甲基化是一种发生在CpG二核苷酸胞嘧啶残基上的动态共价修饰（5-甲基胞嘧啶，5mC），这些CpG位点在许多基因的启动子区域富集。三种DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）参与了发育过程中的DNA甲基化。由于所有DNA碱基（包括5mC修饰的碱基）均隐藏在双链DNA螺旋内部，因此使用免疫组织化学技术检测5mC极具挑战性，这也导致实验结果存在较大变异性。然而，详细描绘发育过程中5mC的分布具有重要的信息价值。本文中，我们描述了一种可重复的、用于在发育中及有丝分裂后小鼠视网膜中强效免疫组织化学检测5mC以及另一种表观遗传DNA标记物5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的技术，后者与"开放"的、转录活跃的染色质共定位。

引言

小鼠视网膜发育及有丝分裂后稳态的表观遗传调控是一个充满前景的研究领域，有望为调控视网发生和细胞命运决定、细胞类型特异性的代谢功能以及细胞病理、细胞死亡与再生的生物学机制带来全新的认识1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。染色质在发育过程中以及响应各种外界信号（如应激、代谢变化或细胞死亡刺激）时会发生动态变化6,14,15,16,17,18。在小鼠细胞核中，染色质分为具有活性的常染色质和无活性的异染色质6,19,20。在间期细胞核中，常染色质位于细胞核内部区域，而异染色质则沿核膜边缘和核仁分布。这种分布模式被称为常规模式，在真核生物中高度保守。相比之下，夜行性动物（如小鼠和大鼠）的视杆细胞核具有倒置的结构，即细胞核中心被异染色质占据，周围由常染色质包裹形成最外层的壳状结构6,18,20。出生时，视杆细胞核具有常规的核结构。在发育过程中，通过常规核结构的重塑，视杆细胞核发生倒置。在此过程中，位于周边的异染色质从核膜边缘分离，染色中心融合形成位于细胞核中央的一个单一染色中心6,18。

基因组DNA甲基化参与调控局部染色质构象21。在小鼠基因组中，DNA甲基化发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶残基的5'位点，这些位点富集于许多基因的启动子区域22,23,24,25,26，同时也存在于携带调控元件的基因间区和内含子区域27。近端启动子区CpG岛21,24以及基因增强子中的CpG序列27,28的甲基化，在调控二价染色质的动态状态中具有重要作用，而二价染色质包含许多在发育、癌症和衰老过程中发挥关键作用的发育相关基因/转录因子29,30,31,32,33,34。三种DNA甲基转移酶（DNMTs）参与小鼠发育过程中的DNA甲基化35。这三种DNMTs在小鼠视网膜发育过程中均有表达36，且视网膜特异性的Dnmt基因改变会影响视网膜发育2,7。羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶（5mC）去甲基化的氧化产物。三种Ten-Eleven Translocation（TET）酶参与介导5mC的去甲基化过程37,38,39。羟甲基胞嘧啶（5hmC）修饰富集于基因启动子区、基因体以及基因富集且活跃转录区域的基因间序列中27,40。

目前已报道多种用于检测细胞中DNA甲基化模式动态变化的方法41,42,43,44,45,46，其中一些方法可用于量化DNA甲基化的全局变化，而另一些则专注于启动子和增强子区域内富含CpG位点的精确变化。此外，也有报道用于检测和定量5hmC的方法。47，包括通过免疫组织化学方法13免疫组织化学技术能够有效监测发育中及有丝分裂后细胞核内5mC和5hmC的变化，对于阐明染色质动态具有重要信息价值。 原位 响应影响细胞的外部或内部变化4,13,48,49然而，由于在组织学样本中检测胞嘧啶修饰存在技术困难，该方法容易低估DNA甲基化和羟甲基化的变化。这是因为包括5mC和5hmC修饰的胞嘧啶在内的非极性DNA碱基隐藏在双链DNA螺旋的内部50，且需要进行抗原修复。这在冷冻组织切片中尤为困难，因为当采用剧烈处理时，组织可能迅速失去原有的信息性结构。

小鼠视网膜是研究DNA甲基化在神经发育及有丝后稳态中作用的理想模型。视网膜中仅包含6种神经元（视杆细胞和视锥细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞和节细胞）、一种胶质细胞（Müller胶质细胞）和一种神经上皮细胞（视网膜色素上皮细胞）51。已有研究报道，不同视网膜细胞类型具有不同的DNA甲基化模式18,19，最近这些模式已在单碱基分辨率水平上得到研究1,5,9,12。我们近期报道了利用免疫组织化学方法描绘视网膜细胞核内5mC分布模式及其在成年小鼠视网膜细胞核中的变化，其中通过条件性靶向技术删除了全部三种DNA甲基转移酶7。与许多仅能将视网膜细胞中DNA甲基化的存在视为高甲基化并经历凋亡细胞中的阳性或阴性信号的研究相比，我们的方法能够检测视网膜细胞核内特定的染色质结构，这一点我们及多个研究团队此前已有报道和讨论5,6,7,18,19,36,52。本文中，我们详细描述了在冷冻的多聚甲醛固定的组织切片中检测5mC和5hmC的免疫组织化学（IHC）技术，并展示了我们能够从原始报告中重复获得的数据7。

方案

所有小鼠实验操作均依照儿童医院奥克兰研究所动物护理与使用委员会批准的方案进行，并遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。

1. 免疫染色的组织准备

  1. 在胚胎第16天（E16）、出生后第0天（P0）、P15和P90，使用二氧化碳（CO2）处死C57 BL/6J小鼠，随后对E16和P0小鼠进行断头处理。
  2. 立即用29G1/2针头在眼球背侧穿刺后摘除小鼠眼球。在室温下，将眼球置于1 mL含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 8.0）中固定5分钟 （min）。
  3. 对于P0、P15和P90小鼠，将眼球置于4% PFA中，使用精细眼科剪刀解剖去除角膜和晶状体以制备眼杯。
    注意：E16眼球因体积过小，无需执行此步骤。
  4. 将眼杯（P0、P15和P90）及完整眼球（E16）在4% PFA中室温固定20分钟 ，随后在1 mL 1× PBS中室温洗涤两次，每次10分钟。
  5. 将眼杯和完整眼球在含10%蔗糖的1× PBS（pH 8.0）中4 °C下 cryoprotect 1小时，再转移至20%蔗糖的1× PBS中1小时，最后在30%蔗糖的1× PBS中4 °C过夜饱和。
  6. 次日，将眼杯和完整眼球置于冷冻模具中，加入500 µL最佳切割温度化合物（OCT），在干冰/乙醇浴中速冻，随后于-80 °C保存。
  7. 将包埋有眼杯和完整眼球的模具从-80 °C取出，置于-20 °C环境中平衡1小时，再进行冰冻切片。
  8. 使用冰冻切片机在-20 °C下沿视神经头处沿颞鼻轴平行切取厚度为12 µm的视网膜横切面。
  9. 将视网膜切片贴附于显微镜载玻片上53，并储存于-80 °C。

2. 使用 5-mC 和 5-hmC 抗体进行免疫染色

  1. 用疏水屏障笔在载玻片上的视网膜切片周围画圈。疏水屏障可减少染色过程中所需抗体的用量。
  2. 用 200 µL 的 1x PBS 将视网膜切片洗涤一次，持续 10 分钟。
  3. 用 200 µL 含 0.1% Triton X-100 的 1x PBS（PBS-T）对视网膜切片进行通透处理，孵育 10 分钟 在室温下
  4. 在37 °C培养箱中，用200 µL新配制的2 N盐酸（HCl）溶于1x PBS中，对视网膜切片进行30分钟的变性处理。
    注意：需要仔细滴定盐酸处理以优化5mC信号。
  5. 优化5mC信号时，务必设置生物学重复（3-4个）54.
    注意：我们设置了4个抗原修复时间点（15分钟、30分钟、1小时和2小时），发现30分钟的孵育时间对5mC信号最为理想。HCl孵育时间过长会导致细胞核结构降解，从而无法将5mC信号定位于细胞核内。
  6. 变性后，向视网膜切片上加入100 µL 0.1 M Tris-HCl（pH 8.3），作用10分钟以中和视网膜切片。
  7. 在湿盒中，于室温下将切片置于500 µL封闭液（含5%非免疫正常山羊血清、0.1% Triton X-100的1x PBS溶液）中孵育1小时。
  8. 封闭后，将抗-5mC和抗-5hmC抗体用封闭液按1:500稀释后加入视网膜切片中。
  9. 在4 °C的湿盒中孵育视网膜切片过夜。
  10. 次日用0.1% PBS-T洗涤视网膜切片3次（每次10–15分钟），然后在含有相应二抗（山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG，稀释比例1:1000）及DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（1 µg/mL）的封闭液中，室温孵育1小时。
    注意：免疫检测的各个阶段均应避免切片干燥。
  11. 用 1 mL 0.1% PBS-T 缓冲液洗涤载玻片三次。
  12. 最后一次洗涤后，将切片用抗荧光淬灭封片剂（水性封片介质）封固于盖玻片下，并用无色指甲油封边。

3. 共聚焦免疫组织化学

  1. 将切片方向调整为视杯的视网膜色素上皮侧始终朝向同一方向（例如， 向上，以保持一致性。
  2. 以63倍物镜放大倍数结合2倍或3倍数字放大，对免疫染色的视网膜切片进行成像。
  3. 对每个选定的图像生成多个光学切片z在所有三个通道（红、绿、蓝，RGB）中以 0.35 µm 步长进行层扫描。
    注意：当使用（通常采用的）10倍目镜时，以10–20倍（物镜放大倍数）观察标本的最终放大倍数分别为63倍。
    可视化压缩的光学图像堆栈以定位5mC和5hmC信号

结果

为了确定5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）在视网膜发育过程中以及在有丝分裂后视网膜中的分布情况，我们对C57BL/6J小鼠在E16、P0、P15和P90时期的视网膜切片进行了免疫染色，所用抗体分别为特异性识别5mC和5hmC的抗体。

在E16时期，细胞核的染色中心中5mC染色较强，而整个细胞核中的染色较弱（图1a）。5hmC染色局限于细胞核内，而在染色中心中未见染色（图1b）。

在 P0 视网膜中，5mC 信号定位于细胞核的染色中心及核周区域（图 2a，箭头和箭头所示）。我们还观察到细胞核染色中心之间存在微弱的 5mC 染色信号。5hmC 信号在细胞核中强阳性表达，但染色中心除外（图 2b）。我们发现内层神经母细胞层（INBL）中有更多的细胞核呈现 5mC 和 5hmC 染色（图 2c，虚线所示）

在P15视网膜中，我们发现5mC和5hmC在外核层（ONL）、内核层（INL）以及神经节细胞层（GCL）均有强染色（图3）。在外核层（视杆感光细胞）中，5mC信号位于细胞核的染色中心及核周区域（图3a-3c、3g）；5hmC信号则分布于整个细胞核内，但染色中心区域除外（图3d-3f）。对P15视网膜进行的透射电子显微镜观察显示，视杆细胞核内异染色质区域的分布模式与5mC抗体信号所显示的结果相似（图3h 和 图3i）。

在内核层（INL）和节细胞层（GCL）中，5mC染色在细胞核的染色中心处较强，而在整个细胞核中也有较弱的染色信号（图3j-3l 和 图3r-3t）。与5mC不同，5hmC信号定位于整个细胞核，但在INL和GCL的染色中心区域除外（图3m-3o 和 图3u-3w）。我们观察到GCL细胞核边缘存在强烈的5hmC信号。

在成年啮齿类动物的视杆光感受器中，5mC信号仅局限于细胞核的染色中心和核周区域（图4a-4c）而5hmc信号则局限于细胞核边缘（图4d-4f).

5mC 和 5hmC 免疫荧光染色；DNA 甲基化分析；显微图像。
图1. 小鼠胚胎第16天视网膜中5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的定位。
使用针对5mC（红色，a）和5hmC（绿色，b）的抗体对C57BL/6J小鼠视网膜进行免疫染色。在E16阶段，5mC信号在细胞核的染色中心非常强，同时在整个细胞核中也有较低水平的分布。5hmC染色则仅局限于细胞核内。图c为5mC与5hmC图像的叠加结果。细胞核用DAPI复染（蓝色，c）。插图为图像中星号标记区域的放大图。比例尺：5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示视网膜细胞中5mC、5hmC甲基化及DAPI染色的免疫荧光显微镜结果。
图2. 出生后第0天小鼠视网膜中5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的免疫组织化学染色。
使用针对5mC（红色，a）和5hmC（绿色，b）的抗体对C57BL/6J小鼠视网膜进行免疫标记。在出生后第0天（P0）的视网膜中，5mC和5hmC均存在于外神经母细胞层（ONBL）和内神经母细胞层（INBL）中。a）5mC信号在染色中心（箭头）和细胞核的核周区域（箭头指示）强烈存在，细胞核内染色中心之间的区域也可见微弱的5mC染色。b）5hmC染色局限于细胞核内，且在内神经母细胞层（INBL）中信号较强（c图中的虚线区域）。c图显示5mC与5hmC信号的叠加图像，细胞核经DAPI复染呈蓝色（c）。插图表示主图中星号标记区域的放大图像。比例尺：5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

免疫荧光显微镜：视网膜各层中5mC和5hmC的分布；ONL、INL、GCL；DAPI染色。
图3. 出生后第15天小鼠视网膜中5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶的分布。
使用抗5mC和5hmC抗体对C57BL/6J小鼠视网膜进行免疫染色（a–g，j–y）。在外核层（ONL）（视杆细胞光感受器）中，5mC信号（红色，a）通常与细胞核中的染色中心重合（箭头所示，b），同时也定位于核周区域（箭头，b）。图b（红色）和图c（灰色）为图a中标有星号区域的放大图像。5hmC信号（绿色，d）局限于整个细胞核，但染色中心区域除外。图e（绿色）和图f（灰色）为图d中标有星号区域的放大图像。图g为5mC和5hmC信号的合并图像。细胞核经DAPI复染。图h和图i为出生后第15天视杆细胞核的透射电子显微镜图像，显示异染色质结构域的分布情况。图h中的黑色箭头指示单个视杆细胞核，其在图i中被放大；图i中的红色箭头指示视杆细胞核内的异染色质结构域，而红色箭头则指示核周的异染色质。在内核层（INL，j–q）和神经节细胞层（GCL，r–y）的细胞核中，5mC信号（红色）定位于核周的染色中心，细胞核其余区域可见微弱染色。图k（红色）和图l（灰色）为图j中标有星号区域的放大图像。INL和GCL细胞核中的5hmC染色（绿色）遍布整个细胞核。注意GCL细胞核周区域5hmC染色较强。图p和图x分别为5mC与5hmC信号的合并图像，图q和图y分别为图p和图x中标有星号区域的放大图像。细胞核经DAPI复染。比例尺：5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜结果显示外核层中的视杆细胞，突出显示不同的标记物。
图 4. 出生后第90天 C57BL/6J 小鼠视网膜视杆感光细胞核中 5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基胞嘧啶的分布。
5mC 染色（红色，a）在细胞核的着丝粒区域强烈存在，在核周缘区域也有微弱分布。图 b（红色）和 c（灰色）为图 a 中星号所示区域的放大图像。5hmC 染色（绿色，d）仅局限于核周缘区域；图 e（绿色）和 f（灰色）为图 d 中星号所示区域的放大图像。图 g 为 5mC 与 5hmC 的合并图像，图 h 为图 g 中星号所示区域的放大图像。细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。比例尺：5 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

DNA甲基化和羟甲基化是动态且可逆的DNA修饰，可在发育中的细胞以及有丝分裂后细胞中调节多种多样的生物学机制。本文描述了一种可重复的技术，用于检测5mC和5hmC DNA修饰 原位 通过免疫组织化学技术（使用抗5mC和抗5hmC抗体），在多聚甲醛固定的冰冻小鼠视网膜切片中进行检测，并提供改进和标准化实验结果的指南，特别是在比较多个不同样本时。我们此前已采用该方法来阐明视网膜特异性靶向小鼠视网膜中5mC的变化情况 Dnmt1, Dnmt3a 和 Dnmt3b DNA甲基转移酶基因，并报道了其视网膜中5mC修饰的（预期）耗竭7.

5mC免疫组织化学检测的关键步骤是优化盐酸（HCl）对组织切片的处理：HCl预处理时间少于15分钟将无法获得可重复的结果，而过度的HCl处理则会破坏细胞核结构。我们发现，HCl孵育30分钟时效果最佳。我们建议始终使用新稀释的HCl以及新配制的4% PFA溶液，分别用于DNA变性和视网膜组织固定。

为排查实验结果，我们建议在优化5mC信号时包含三到四个生物学重复。尽管每组免疫组织化学染色实验可能会产生略微不同的结果（异染色质区域的明暗程度略有差异），这在免疫组织化学方法中属于正常现象，但只要严格按照实验方案操作，同一批切片中的5mC和5hmC核内分布应具有高度可重复性。

该技术也存在局限性，我们在同一张切片的感光细胞核中持续观察到5mC分布存在变异。一些细胞核显示出强烈的5mC信号，而相邻的细胞核则无5mC信号。这归因于盐酸处理冷冻切片时在暴露5mC抗原方面的局限性。

该技术的重要意义在于能够实现5mC的定位，且无需进行DNase和蛋白酶K处理，从而更好地保留染色中心结构。只要遵循实验方案，该技术预期可稳定适用于所有含有5mC和5hmC修饰的脊椎动物组织切片，不仅限于小鼠视网膜，其他采用类似处理方法的样本亦可适用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由一项小型企业创新研究拨款（1R44EY027654-01A1）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
耗材
29G1/2 ULTRA-FINEBD Biosciences329461
眼科剪刀Fine Science Tools, Inc. 15000-03
PAP笔RPICORP.com195505
Superfrost plus 载玻片VWR48311-703
试剂
多聚甲醛Electron Microscope Science15710
1x PBSCorning21-031-CV
蔗糖SigmaS9378
Tissue-Tek 光学切割包埋剂（OCT）VWR4583
Triton X-100SigmaT9284
6 N HClVWR analytical BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3TeknovaT1083
山羊血清Jackson Immunoresearch005-000-121
5mCGenway Biotech GWB-BD5190
5hmCActive Motif39791
LaminB1AbcamAb16048
Cy2 AffiniPure 山羊抗兔 IgGJackson Immunoresearch111-225-1444
Cy3 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgGJackson Immunoresearch115-585-166
DAPIThermo Fisher ScientificD1306
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36930
仪器设备
MICRM HM 550Thermo Fisher Scientific388114
共聚焦显微镜Zeiss

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小鼠发育期及有丝分裂后视网膜中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的免疫组织化学检测
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