Method Article

高效可扩展的人多潜能干细胞临床相容角膜缘上皮干细胞的定向分化

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议介绍了一种简单的两步法在异种和无细胞培养条件下, 从人多潜能干细胞中分化角膜缘上皮干细胞的方法。这里介绍的细胞培养方法可实现经济高效的大规模生产, 适用于角膜细胞治疗使用的临床质量细胞。

Abstract

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角膜缘上皮干细胞 (LESCs) 负责持续更新角膜上皮细胞, 从而保持角膜的稳态和视觉清晰度。人类多能干细胞 (hPSC) 衍生 LESCs 为角膜细胞置换治疗提供了有希望的细胞来源。未定义、异种的培养和分化条件导致了研究结果的变化, 阻碍了 hPSC 治疗的临床翻译。该协议为异种和馈线无细胞条件下的 hPSC LESC 分化提供了一种可重现和有效的方法。首先, 对重组 laminin-521 (LN-521) 和定义的 hPSC 培养基中未分化 hPSC 的单层培养是稳定生产高质量起始材料的基础。其次, 快速简单的 hPSC LESC 分化方法仅在24天内就会产生 LESC 种群。该方法包括四天表面外胚层诱导的小分子悬浮液, 其次是在 LN-521/collagen IV 组合基质上贴壁培养相, 确定角膜上皮分化培养基。Cryostoring 和扩展分化进一步净化细胞的种群, 并使细胞的银行在大量的细胞治疗产品。由此产生的高质量 hPSC LESCs 为角膜表面重建治疗角膜缘干细胞缺乏 (康乐文化署) 提供了一种潜在的新的处理策略。

Introduction

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眼睛表面的透明角膜允许光线进入视网膜并提供大部分眼球的折射力。角膜缘上皮干细胞 (LESCs) 持续再生, 是最外层的层状角膜上皮细胞。LESCs 位于巩膜交界处1,2的角膜缘壁龛的基底层。LESCs 缺乏特定的和独特的标记, 因此它们的识别需要对一套假定标记进行更广泛的分析。上皮转录因子 p63, 特别是 p63 (ΔNp63α) 阿尔法异构体的 n-末期截断转录, 已被提出作为一个相关的阳性 LESC 标记3,4。LESCs 的不对称分裂允许他们自我更新, 但也产生迁移向心地和前方的后代。随着细胞向角膜表面的进展, 他们逐渐失去了干性, 最后最终分化为从角膜表面不断丢失的表面鳞状细胞。

对任何角膜层的损伤都会导致严重的视力损害, 因此角膜缺陷是全球视力丧失的主要原因之一。在角膜缘干细胞缺乏症 (康乐文化署), 角膜缘被破坏的疾病或创伤导致 conjunctivalization 和白内障的表面和随后的视力损失5,6。使用自体或异基因角膜缘移植的细胞置换疗法为康乐文化署4

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Protocol

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坦佩雷大学经芬兰国家法医学鉴定事务局 (Dnro 1426/32/300/05) 批准, 对人类胚胎进行研究。该研究所还有皮尔卡曼医院区道德委员会的支持性声明, 以推导、培养和区分人类胚胎干细胞线 (Skottman/R05116), 并在眼科研究中使用 hiPSC 线 (Skottman/R14023)。这项研究没有新的细胞系。

注意: 所述的协议是基于特定的, 商业上可用的 hPSC 和角膜上皮分化培养基。有关制造商/供应商信息和目录编号, 请参阅材料表。

1. 建立异种和无饲养 hPSC 文化

  1. 准备
    1. 大衣24孔板与人重组 laminin-521 (LN-521)。对于第一个无馈线 (FF) 通道, 使用 LN-521 在浓度为1.09 µg/厘米2, 并在0.55 µg/厘米2为以下段落。建议的 LN-521 浓度作为成功的 FF 文化的起点, 但可以降低。
      1. 按照制造商的指示, 在4摄氏度下缓慢解冻 LN-521 小瓶。
        注意: 在解冻后, 适当处理的 LN-521 溶液可以储存在4摄氏度, 长达3月。
      2. 要准备涂层解决方案, 请用1x 杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 稀释适量的 LN-521 库存溶液, 其中含有 Ca2 +和 M....

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Results

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从 hPSCs 到 hPSC-LESCs

从诱发 FF hPSCs 到 cryostoring hPSC LESCs 的整个过程大约需要3.5 周。图 1A给出了突出其关键步骤的微分方法的原理图概述。图 1B显示了协议不同阶段细胞种群的典型形态。所提供的数据采用 Regea08/017 人类胚胎干细胞线和 04607. WT hiPSC 线, 在芬兰坦佩雷大学获得和表征, 如前26、27、28所述。

在 hPSC 培养基的 LN-521.......

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Discussion

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该协议的预期结果是在大约3.5 周内从 FF hPSC 的单个电池悬浮液中成功和稳健地生成 LESCs。由于角膜上皮发育从表面外胚层29, 该议定书的第一步旨在指导 hPSCs 走向这一血统。24 h 诱导与转化生长因子β (SB-505124) 拮抗剂, 和 bFGF 用于诱导外胚层分化, 其次 48 h 中胚层 BMP-4 提示推动细胞朝向表面外胚层。将 IV/LN-521 组合矩阵的以下贴壁分化步骤与化学定义的分化培养基结合在一起, 进一步引导分化为 LESCs。

高品质的起始材料 (FF hPSCs) 是成功分化的关键。只有 FF hPSC 的区域性与近汇流和接近100% 的未分化表型应使用。建议使用常规的 hPSC 核型分析, 因为单细胞传代可使 hPSCs 核型异常, 从而导致生长和分化优势30。长时间接触胰蛋白酶可能导致 EB 形成不足或 hPSC 死亡。该协议通过五个单独衍生的和基因上不同的 hPSC 线 (人类胚胎干细胞和 hiPSC 线) 进行了测试。不需要对小分子浓.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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该研究得到了芬兰科学院 (赠款297886号)、特克斯的人力备件计划、芬兰技术和创新资助机构、芬兰眼和组织银行基金会以及芬兰文化基金会的支持。作者感谢生物医学实验室技术人员我 Melin、汉娜 Pekkanen、艾玛维克斯泰特和我 Heikkilä为卓越的技术援助和对细胞培养的贡献。Katriina 教授 Setälä被公认为提供用于荧光成像设备的 hiPSC 线和普司通成像核心设施。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
材料/试剂
1x DPBS，含 Ca2+ 和 Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS，不含 Ca2+ 和 Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm 细胞培养皿Corning CellBIND#3296贴壁 hPSC-LESC 的培养容器形式分化
12 孔板Corning CellBIND#3336用于 IF 样品的培养容器
规格 24 孔板Corning CellBIND#3337用于 IF 样品的培养容器规格
-巯基乙醇Gibco#31350-010
6 孔板，超低附着度Corning Costar#3471用于悬浮液诱导的培养容器规格培养
Alexa Fluor 488 抗小鼠 Ig ThermoFisherScientific#A-21202IF 二抗
Alexa Fluor 488 抗兔 IgThermoFisher Scientific#A-21206IF 二抗
Alexa Fluor 568 抗山羊 IgThermoFisher Scientific#A-11057IF 二抗
Alexa Fluor 568 抗小鼠 IgThermoFisher Scientific#A-10037IF
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，人）PeproTech Inc.#AF-100-18B无动物源重组人 FGF 碱性 （154 a.a.）
BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液BD Biosciences#554722流式细胞术固定和透化溶液
BD Perm/洗涤缓冲液BD Biosciences#554723流式细胞术洗涤缓冲液
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
骨形态发生蛋白 4 （BMP-4）PeproTech Inc.#120-05A
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma-Aldrich#A8022-100G
细胞角蛋白 12 抗体Santa Cruz Biotechnology#SC-17099IF
细胞角蛋白 14 抗体一抗 R&D Systems#MAB3164IF
细胞角蛋白 15 抗体ThermoFisher Scientific#MS-1068-PIF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30壁 hPSC-LESC 分化
IV 型胶原（人）Sigma-Aldrich#C5533人胎盘胶原 IV 型
CoolCell LX冻存容器Sigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure 试管Sarsted#72.380用于 hPSC-LESC 冻存的 1.6 mL 冻存
管 确定的胰蛋白酶抑制剂Gibco#R-007-100
Essential 8 Flex 培养基试剂盒Thermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
层粘连蛋白 521生物层粘连#Ln521人重组层粘连蛋白 521
ΔNP63&α;抗体BioCare Medical#4892IF
OCT3/4 抗体一抗 R&D Systems#AF1759IF
p63&alpha 抗体Cell Signaling Technology#ACI3066AIF
p63-&alpha 一抗;（D2K8X）XP 兔单克隆抗体 （PE 偶联物）Cell Signaling Technology#56687p63-α流式细胞术 PE 偶联抗体
PAX6 抗体Sigma-Aldrich#HPA030775IF
青霉素/链霉素Lonza#17-602E
多聚甲醛 （PFA）Sigma-Aldrich#158127IF
ProLong Gold 细胞固定剂 含 DAPIThermo Fisher Scientific#P36931硬封片剂用于 IF
PSC 冻存试剂盒Thermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select 酶Gibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' 的安装物s 修改后的鹰's 培养基Gibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM 非必需氨基酸Gibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787的透化剂
#H-1200用于液体封片的 DAPI封片剂 IF
<>名称<>Company目录号Comments
>设备
Cytocentrifuge，e.g.CellSpin IITharmac
流式细胞仪，例如BD Accuri C6BD Biosciences
荧光显微镜，例如Olympus IX 51Olympus
2二抗一抗 一抗 贴培养基 蛋白 一抗 用于 IF VectaShield 载体实验室

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.

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