本方案介绍了一种在无异种成分且无饲养层细胞的培养条件下，将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞的简单两步法。此处提供的细胞培养方法能够以较低成本大规模生产具有临床质量的细胞，适用于角膜细胞治疗。
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方法文章
高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
角膜缘上皮干细胞（LESCs）负责持续更新角膜上皮，从而维持角膜稳态和视觉清晰度。由人多能干细胞（hPSC）衍生的LESC为角膜细胞替代疗法提供了有前景的细胞来源。未定义的、异种来源的培养和分化条件会导致研究结果的变异，并阻碍hPSC衍生治疗产品的临床转化。本方案提供了一种在无异种成分且无饲养层细胞的条件下，可重复且高效地实现hPSC向LESC分化的技术方法。首先，将未分化的hPSC在重组层粘连蛋白-521（LN-521）上以单层形式培养于成分明确的hPSC培养基中，为后续分化提供高质量、稳定的起始材料。其次，采用一种快速且简便的hPSC-LESC分化方法，仅需24天即可获得LESC细胞群体。该方法包括使用小分子在悬浮条件下进行为期四天的表面外胚层诱导，随后在成分明确的角膜上皮分化培养基中，于LN-521/IV型胶原组合基质上进行贴壁培养。通过冷冻保存和延长分化过程，可进一步纯化细胞群体，并实现细胞的大规模储存，以满足细胞治疗产品的需求。所获得的高质量hPSC-LESC为治疗角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）所致的角膜表面重建提供了潜在的全新治疗策略。
引言
眼球表面透明的角膜允许光线进入视网膜，并提供眼睛大部分的屈光力。最外层为分层的角膜上皮，由角膜缘上皮干细胞（LESCs）持续再生。LESCs 位于角膜缘生理性微环境基底层的角膜巩膜交界处1,2。LESCs 缺乏特异且唯一的标志物，因此其鉴定需要对一组假定标志物进行更广泛的分析。上皮转录因子 p63，尤其是 p63 α 亚型的 N 端截短转录本（ΔNp63α），已被提出作为重要的阳性 LESC 标志物3,4。LESCs 的不对称分裂使其能够自我更新，同时产生子代细胞，这些子代细胞向心性并向前迁移。当细胞向角膜表面移动时，逐渐失去干细胞特性，最终分化为表层的扁平鳞状细胞，并持续从角膜表面脱落。
角膜各层的损伤均可能导致严重的视力障碍，因此角膜缺陷是全球范围内视力丧失的主要原因之一。在角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）中，角膜缘因疾病或外伤遭到破坏，导致结膜化和角膜表面混浊，进而造成视力丧失5,6。利用自体或异体角膜缘移植物进行细胞替代治疗，为LSCD患者提供了一种治疗策略4,
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方案
坦佩雷大学已获得芬兰国家医学法律事务局（批准编号：1426/32/300/05）的批准，可开展涉及人类胚胎的研究。该机构还获得了皮尔坎马医院区伦理委员会的支持意见，允许其建立、培养和分化人胚胎干细胞系（Skottman/R05116），以及在眼科研究中使用人诱导多能干细胞系（Skottman/R14023）。本研究未建立新的细胞系。
注意：所述方案基于特定的商业化人多能干细胞（hPSC）及角膜上皮分化培养基。请参阅材料表以获取生产厂家/供应商信息及目录编号。
1. 建立无异种成分且无饲养层的hPSC培养体系
- 准备工作
- 用人类重组层粘连蛋白-521（LN-521）包被24孔板。首次无饲养层（FF）传代时，使用浓度为1.09 µg/cm²的LN-521。2，以及 0.55 µg/cm2 以下段落中，建议的LN-521浓度可作为成功进行无饲养层（FF）培养的起始点，但可适当降低。
- 按照制造商说明，在 4 °C 下缓慢解冻 LN-521 冻存管。
注意： 正确处理的LN-521溶液在解冻后可于4 °C保存最长3个月。 - 为制备包被溶液，将适量LN-521储存液用含有Ca²⁺的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释2+....
- 按照制造商说明，在 4 °C 下缓慢解冻 LN-521 冻存管。
- 用人类重组层粘连蛋白-521（LN-521）包被24孔板。首次无饲养层（FF）传代时，使用浓度为1.09 µg/cm²的LN-521。2，以及 0.55 µg/cm2 以下段落中，建议的LN-521浓度可作为成功进行无饲养层（FF）培养的起始点，但可适当降低。
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结果
从人多能干细胞到人多能干细胞来源的角膜缘上皮干细胞
从诱导FF hPSCs分化到冻存hPSC-LESCs的整个过程大约需要3.5周。该分化方法的关键步骤示意图如下所示 图1A. 图1B 展示了不同实验阶段细胞群体的典型形态。所展示的数据来自Regea08/017 hESC细胞系和UTA.04607.WT hiPSC细胞系，这两种细胞系均由芬兰坦佩雷大学建立并完成表征，具体方法如前所述。26,27,28.
在含hPSC培养基的LN-521.......
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讨论
本方案预期结果是在约3.5周内，从单细胞悬浮状态的游离培养人多能干细胞（FF hPSC）成功且稳定地生成角膜缘上皮干细胞（LESC）。由于角膜上皮起源于表面外胚层29，本方案的第一步旨在引导hPSC向该谱系分化。通过使用转化生长因子β（TGF-β）拮抗剂SB-505124和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行为期24小时的短期诱导，启动外胚层分化，随后加入中胚层信号分子BMP-4作用48小时，以推动细胞向表面外胚层方向发展。接下来，在IV型胶原蛋白/层粘连蛋白521（col IV/LN-521）组合基质上进行贴壁分化，并结合化学成分明确的分化培养基，进一步引导细胞向LESC分化。
起始材料（即饲养层依赖型人多能干细胞，FF hPSCs）的质量对于成功分化至关重要。应使用接近汇合且未分化表型比例接近100%的FF hPSC培养物。建议定期对hPSC进行核型分析，因为单细胞传代可能使hPSC易于发生核型异常，从而获得生长和分化的竞争优势30。长时间暴露于胰蛋白酶可能导致胚胎体（EB）形成不.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由芬兰科学院（资助号 297886）、Tekes 人类备用部件计划、芬兰技术和创新资助局、芬兰眼与组织库基金会以及芬兰文化基金会资助。作者感谢生物医学实验室技术人员 Outi Melin、Hanna Pekkanen、Emma Vikstedt 和 Outi Heikkilä 在细胞培养方面提供的出色技术支持和贡献。感谢 Katriina Aalto-Setälä 教授提供所使用的 hiPSC 细胞系，以及 BioMediTech 成像核心设施提供荧光成像设备。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料/试剂 | |||
| 含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 1x DPBS | Gibco | #14040-091 | |
| 不含 Ca 的 1x DPBS2+ 和 Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm 细胞培养皿 | Corning CellBIND | #3296 | 用于贴壁hPSC-LESC分化的培养容器格式 |
| 12孔板 | Corning CellBIND | #3336 | IF 样品培养容器格式 |
| 24孔板 | Corning CellBIND | #3337 | 用于免疫荧光样品的培养容器规格 |
| 2-巯基乙醇 | Gibco | #31350-010 | |
| 6孔板，超低吸附 | Corning Costar | #3471 | 悬浮培养中诱导的培养容器格式 |
| Alexa Fluor 488 抗小鼠 Ig | 赛默飞世尔科技 | #A-21202 | 免疫荧光二抗 |
| Alexa Fluor 488 抗兔 Ig | 赛默飞世尔科技 | #A-21206 | 免疫荧光二抗 |
| Alexa Fluor 568 抗山羊Ig | 赛默飞世尔科技 | #A-11057 | 免疫荧光二抗 |
| Alexa Fluor 568 抗小鼠 Ig | 赛默飞世尔科技 | #A-10037 | 免疫荧光二抗 |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，人） | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | 无动物源性重组人碱性成纤维细胞生长因子（154个氨基酸） |
| BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜溶液 | BD 生物科学 | #554722 | 流式细胞术固定与透化溶液 |
| BD 固定/洗涤缓冲液 | BD 生物科学 | #554723 | 流式细胞术洗涤缓冲液 |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| 骨形态发生蛋白4（BMP-4） | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| 细胞角蛋白12抗体 | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | 免疫荧光一抗 |
| 细胞角蛋白14抗体 | R&D Systems | #MAB3164 | 免疫荧光一抗 |
| 细胞角蛋白15抗体 | 赛默飞世尔科技 | #MS-1068-P | 免疫荧光一抗 |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | 用于贴壁hPSC-LESC分化的培养基 |
| IV型胶原蛋白（人源） | Sigma-Aldrich | #C5533 | 人胎盘 IV 型胶原蛋白 |
| CoolCell LX 冷冻容器 | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure 管 | Sarstedt | #72.380 | 用于hPSC-LESC冷冻保存的1.6 mL冻存管 |
| 定义明确的胰蛋白酶抑制剂 | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex 培养基试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| 层粘连蛋白521 | 生物基质 | #Ln521 | 人重组层粘连蛋白521 |
| ΔNp63α 抗体 | BioCare Medical | #4892 | 免疫荧光一抗 |
| OCT3/4 抗体 | R&D Systems | #AF1759 | 免疫荧光一抗 |
| p63α 抗体 | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | 免疫荧光一抗 |
| p63-α (D2K8X) XP兔单克隆抗体（PE偶联物） | 细胞信号技术公司 | #56687 | p63-α 用于流式细胞术的PE偶联抗体 |
| PAX6 抗体 | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | 免疫荧光一抗 |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | #17-602E | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | #158127 | 免疫荧光用细胞固定剂 |
| 含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | 赛默飞世尔科技 | #P36931 | 用于免疫荧光的DAPI封片剂（硬封片） |
| PSC 冷冻保存试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | #A2644601 | |
| TrypLE Select 酶 | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut DMEM’s 改良的 Eagle’s 培养基 | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | 免疫荧光通透剂 |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | 用于免疫荧光的 DAPI 封片液 |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| 细胞离心机 例如 CellSpin II | Tharmac | ||
| 流式细胞仪 例如 BD Accuri C6 | BD 生物科学 | ||
| 荧光显微镜 例如奥林巴斯 IX 51 | Olympus |
参考文献
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.
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重印与许可
