基于蛋白质的水凝胶的力钳 Rheometry

摘要

采用一种新的力钳 rheometry 技术, 研究了声线圈电机与力传感器之间的低体积蛋白质基水凝胶样品的力学性能。模拟比例积分-导数 (PID) 系统允许 "夹紧" 的力量体验到所需的协议。

摘要

在这里, 我们描述了一种力钳 rheometry 方法来表征蛋白质基水凝胶的生物力学特性。该方法采用模拟比例积分-导数 (PID) 系统, 在圆柱蛋白基水凝胶样品上应用受控力协议, 并将其与线性音圈电机和力传感器拴在一起。在操作过程中, PID 系统调整水凝胶样品的延伸以遵循预定义的力协议, 通过最小化测量和设定点力之间的差异。这种独特的蛋白质基水凝胶方法能够使极低体积的水凝胶样品 (< 5 µL) 与不同的蛋白质浓度结合在一起。在力-匝道协议中, 当应用应力随时间线性增加和减小时, 系统能够研究与蛋白质 (un) 折叠相关的弹性和滞后行为, 以及标准弹性的测量和粘弹性参数。在恒定力的情况下, 力脉冲具有一步状形状, 由于力的变化, 弹性响应与粘弹性响应是分离的, 这是由蛋白质领域展开和复用而来的。由于其体积小, 在应用各种机械扰动时具有通用性, 因此, 采用大体积法对力钳 rheometry 进行了优化, 以研究蛋白质在受力下的力学响应。

引言

除了具有独特的物理特性外, 基于蛋白质的水凝胶具有革命性的力量光谱学的希望, 能够在一个 ' 拉力 ' 中测量数亿的分子, 从而使在拥挤的环境中对蛋白质进行研究,与皮肤和其他组织中遇到的类似。蛋白质领域仍然折叠在水凝胶内, 允许研究其生物力学反应的力量, 结合合作伙伴, 和化学条件。此外, 水凝胶内蛋白质领域的生物力学反应类似于单分子力谱技术所看到的反应。例如, 化学变性剂和氧化剂降低了折叠状态的稳定性, 无论是在单蛋白领域^1,2,3和在宏观水平^4,5,6,7. 同样, 渗透调节物质增加了单蛋白^8、9的稳定性, 导致水凝胶的粘弹性反应减少, 同一力条件为^7、10。

通过使用物理相互作用^11、12或共价键交联^4、13, 已经实施了几种合成蛋白质基水凝胶的方法。共价反应允许固定的交联位置和这些水凝胶可以恢复初始状态后的机械或化学扰动的去除。一种成功的共价交联方法依赖于用过硫酸铵 (APS) 作为氧化剂和钌 (II) 盐作为引发剂 (图 1)¹⁴, 在暴露的酪氨酸氨基酸之间形成共价键碳碳键。当接触到白光时, 浓缩蛋白质的溶液可以转化为水凝胶。通过控制反应开始时, 蛋白质 APS 组合可以注入任何铸件形式, 如聚四氟乙烯 (PFTE) 管 (图 1B和1C), 允许使用一个非常小的解决方案体积¹⁵。此外, 利用白光触发交联反应导致荧光蛋白的有限漂白, 并允许用荧光标记来配制复合水凝胶 (图 1)。其他基于蛋白质的水凝胶形成方法采用基于 SpyTag-SpyCatcher 共价相互作用的交联¹⁶、胺交联通过戊二醛¹³或生物素-链亲和素相互作用¹⁷。

动态力学分析 (DMA) 是目前广泛用于研究聚合物基水凝胶^13,18的技术。虽然 DMA 可以将恒定的力量协议应用于生物材料, 它需要年轻的模数超过10帕, 和大样本量超过200µL¹⁹。由于这些局限性, 蛋白质水凝胶一般太软, 不能用这种方法来研究。由于工程 polyproteins 比聚合物更难合成, 因为它们需要一个活的系统来生产, 这样的高容量是低效的, 充其量是^4,15。此外, 大多数生物组织的软比10帕。为生物样品开发了几种方法, 特别是研究肌肉弹性^20、21。这些技术也可以在反馈作用下运行恒定力, 但为小直径 (在微米范围内) 暴露在非常短的时间 (通常少于1秒) 的样品优化。

采用改进的 rheometry 技术, 成功地研究了蛋白质基水凝胶。例如, 在环形形状中浇铸水凝胶, 可以利用伸展 rheometry 来测量有经验的力的变化, 作为扩展^4,22的函数。其他研究蛋白质基水凝胶流变特性的方法是采用受控剪切应力 rheometry。这些技术也可以达到低样本量和容忍软材料。然而, 这些方法缺乏模仿导致蛋白质在体内展开的拉动力的能力, 并且根据需要各种假设和修正²³的复杂理论计算杨氏模量。

我们最近报告了一种新的方法, 利用了小体积的蛋白质, 聚合管内与直径 < 1 毫米。我们的第一个实施这一技术是在长度钳模式, 其中凝胶是延长后, 预期的协议¹⁵。在这种方法中, 当域展开时, 蛋白质在扩展和力方面都经历了不断的变化, 使得数据解释变得繁琐。最近, 我们报告了一种新的力钳 rheometry 技术, 其中反馈回路可以揭露低容量的蛋白质水凝胶到预定义的力量协议⁷ (图 2)。模拟 PID 系统将力传感器测量的力与计算机发送的设定点进行比较, 并通过移动语音线圈来调整凝胶的扩展, 以最小化两个输入之间的差异。这种 "夹紧" 的力量现在允许新的实验, 以测量蛋白质水凝胶的生物力学。

在力-坡道模式下, 栓蛋白水凝胶的受力随时间的推移不断增加和减少。根据蛋白质和水凝胶配方的变化, 采用非线性的方法, 对任何粘弹性变形进行补偿。力坡道的主要优点是, 由于蛋白质领域的展开和复用, 它允许量化标准参数, 如杨氏模量和能量耗散。

在恒力模式下, 应用力的变化是一种类似于步进的方式。在这种模式下, 当力增加或减小时, 胶凝体扩展和收缩弹性, 其次是时变变形。这种粘弹性变形发生在凝胶经历恒定力的情况下, 与域展开/复用直接相关。在简化的方法中, 这种扩展可以被看作是相当于几个亿个单一分子的痕迹平均在一起, 并测量所有一次。恒力协议可以用来研究蛋白质水凝胶的蠕变和松弛, 作为一种力和时间的函数。作为一种力的功能, 对 BSA 为基础的蛋白质水凝胶, 我们最近表明, 有一个线性依赖性之间的弹性和粘弹性延长和反冲与应用应变⁷。

在这里, 我们详细介绍了一种使用由蛋白质 l (8 域²⁴, 描述为 L₈) 和蛋白质 l-eGFP 构造 (l-eGFP) 组成的复合凝胶的力钳流变仪的操作, 这使得整个水凝胶荧光和易于证明。

方案

1. 试剂溶液的制备

1. 用三个缓冲器 [20 毫米三 (羟甲基) 氨基甲烷和150毫米氯化钠, pH 7.4], 将感兴趣的蛋白质溶解/稀释至所需浓度, 制备起动蛋白溶液。
   注: 交联导致水凝胶的最小蛋白质浓度取决于所使用的蛋白质, 通常 > 1 毫米。
2. 通过溶解 ap 和 [汝 (bpy)₃]^{2 +}粉末在三个缓冲器中, 准备过硫酸铵 (APS) (1 米) 和三 (吡啶) 钌 (II) 氯化物 ([汝 (bpy)₃]^{2 +}) (6.67 毫米) 溶液。

2. 蛋白质基水凝胶的合成

1. 用压柱塞固定1毫升注射器上的23克针。
2. 用刀片切割10厘米聚四氟乙烯 (聚四氟乙烯) 管 (内径为0.022 英寸, 外径为0.044 英寸)。将针头和注射器连接到聚四氟乙烯管的一端。
3. 将管的第二端插入硅烷溶液中, 并通过缩回注射器柱塞来填充管子。把管子放在30分钟左右。
4. 除去硅烷溶液, 用压缩空气干燥管。
   注意: 确保所有的硅烷溶液都是干的, 并且没有残留在管子里。
5. 将蛋白质溶液与 APS 和 [汝 (bpy) 3]^{2 +}在1.5 毫升管中使用恒定容积比 [例如, 15:1: 1 或 15:0. 5:0. 5 (v: v: v)]。
6. 涡感光溶液, 直到它完全混合。
7. 离心混合以最大速度 (例如, 1.4万 x g), 以消除任何气泡从解决方案。
8. 将经处理的聚四氟乙烯管的开口端插入感光混合物中, 并通过缩回注射器柱塞将溶液拉入管内。
9. 把装满的管子从 100 W 水银灯放到10厘米, 以防加热, 并在室温下保持30分钟 (图 1B)。
   注: 在某些情况下, 曝光时间可低至三十年代. 在这里使用较短的凝胶时间用于荧光凝胶, 以限制漂白。
10. 把管子从针头上取下, 用剃刀刀片把水凝胶末端的管子边缘切开。
11. 使用钝24克针将水凝胶挤出到三溶液中 (图 1C)。
    注: 钝针用于避免任何凹槽或损坏的水凝胶样品。
12. 目视检查凝胶是否有任何可能在挤出过程中形成的缺陷, 或由于气泡而丢弃有缺陷的凝胶。

3. 基于蛋白质的水凝胶附着体和力钳式流变仪的建立

1. 启动仪表控制程序。打开声音线圈马达。将线圈位置设置为指向范围末尾的值 (例如, 7.5 mm)。
   注: 建议将语音线圈位置朝向最大运动范围的末尾, 最大限度地扩大水凝胶的可能延伸。
2. 在z方向偏移钩子, 并将它们对准x方向的折弯 (即拉动坐标; 请参见图 2B)。记录x方向的千分尺螺钉的值。
3. 将2条无菌缝线切成等长的股 (2-3 厘米; 见图 3A和B)。
4. 绑一个松散的双上手结进入每股, 并把2环路连接到力传感器 (图 3C和3D) 挂钩。
5. 用三缓冲器填充实验室, 用医用镊子将水凝胶样品输送到填充腔内。
6. 将声音线圈和强制传感器挂钩靠近解决方案表面, 并使用x/y/z定位机械手将钩子对准所有方向。
7. 使用医用镊子, 将蛋白质水凝胶样品的两侧挂在连接到语音线圈和力传感器的挂钩上 (图 3C)。
8. 收紧1缝合环水凝胶样品的声音线圈钩通过持有两端的缝合环与医疗镊子, 并拉他们同时 (图 3D)。
9. 对连接到力传感器的循环重复步骤 3.8 (图 3D)。
   注意: 避免对缝线进行极端收紧, 以防止水凝胶样品的结构损伤和横向切割。
10. 拧紧每个钩的弯曲上的缝合环, 以防止任何滑动;使用这些折弯作为参考点, 以查找步骤3.2 中挂钩之间的零分隔。用医用剪刀剪掉缝合线的多余长度 (图 3D)。
11. 将所附的水凝胶沿z轴的z形机械手移动到实验室, 将水凝胶浸入实验溶液中。
12. 使用机械手将水凝胶样品在yz上对齐, 这样凝胶就不会受到任何压力。
13. 零力传感器, 并使用x微米级分隔两个挂钩, 直到凝胶开始体验力。一旦发生这种情况, 在x方向稍微向后旋转千分尺螺钉。
14. 记录两个机械手的位置, 为语音线圈马达和传感器, 并利用这些值之间的差异和测量的步骤 3.2, 以计算在实验开始的挂钩钩之间的精确分离。
15. 将松弛曲线的范围设置为 ~ 1.5-2 毫米, 并测量凝胶松弛度 (图 4A)。
    注意: 对于每个时差测量, 尝试保持松弛系统的开始, 靠近初始的声音线圈位置, 允许最佳的数据点数以适应2种制度 (图 4A)。凝胶长度可以用微米的分辨率来确定, 方法是使用钩子与松弛曲线中2个体制之间的交集 (请参见步骤 5.1)。由于实验条件的变化, 力传感器可能会随时间漂移, 所以在不受力的情况下, 松弛曲线的一部分会在这个可能的漂移上报告。在将设置点命令发送到 PID 回路时, 控制仪表的程序自动补偿此差异 (图 4A插入)。

4. 基于蛋白质的水凝胶特性的控制力-坡道和恒定力测量

1. 力坡道实验
   1. 通过增加所需加载速率的力 (如0.01 锰/秒) 来执行力-坡道循环, 将启动和最终的力量以及协议的持续时间输入为翻转的 "V"。然后, 保持凝胶在0锰 (或低力) > 200s, 使蛋白质领域再折叠餐巾和凝胶弹性恢复。
   2. 保存跟踪。
2. 恒力实验
   1. 执行恒定力协议, 通过应用低力 (例如, 0.1 锰) 在三十年代, 然后增加的力量, 以恒定的力量 (例如, 1 锰), 在规定的时间 (例如, 120s), 然后淬火的力量回到相同的低价值 (如0.1 锰) > 300s 允许蛋白质领域再折叠餐巾和凝胶弹性恢复。
   2. 在第一个脉冲之后, 调整 PID 设置以最大化反馈回路的响应时间 (见图 2D)。
      注: 对于僵硬的凝胶和小的力量变化, 回路的响应时间受力传感器的电子和线圈的响应时间的限制, 并且可以低至5毫秒⁷。对于软凝胶和力的大变化, 响应时间取决于水凝胶的弹性 (图 2D)。
   3. 保存跟踪。

5. 数据分析

1. 利用在挂钩和计算线圈位置之间的测量的分离, 当凝胶开始体验力 (Δx 在图 4A插入), 计算凝胶长度L使用等式:
   l =₀ + ∆x
   这里, L₀ 是钩子之间的分离, 测量从测微螺钉的位置在实验之前 (步骤 3.14)。
   注: 对于不导致完全交联的低蛋白浓度凝胶, 测量的长度将从痕量变化。而且, 在长时间内, 水凝胶内的蛋白质可能会经历衰老效应²⁵, 从而导致凝胶的整体延长。
2. 将测量到的扩展到凝胶长度正常化以获得应变。
3. 使用用于聚合的管内径将所测力正常化为横向表面积。

结果

图 1A显示了用于合成 l-感光₈水凝胶的反应方案。图 1B显示了 photoactivation 前后聚四氟乙烯管中的水凝胶混合物。图 1C给出了在三溶液中挤压的 l-eGFP₈水凝胶。水凝胶样品没有凹槽等结构缺陷。应丢弃明显可见损伤的水凝胶。

在图 2A和2B中给出了力钳流变仪的装配和爆炸视图的渲染。图 2C显示了力钳式流变器方案, 其中水凝胶样品被拴在连接到线性语音线圈和力传感器的挂钩和浸入缓冲液中。模拟 PID 系统通过控制线性-声音线圈位置来调整水凝胶的延伸, 以跟随力设...

讨论

本文描述了一种力钳 rheometry 技术来研究低体积蛋白质基水凝胶的生物力学响应。此外, 还提供了一种合成均匀柱状低体积蛋白质水凝胶样品的协议。文中还介绍了如何将不同类型的蛋白质基水凝胶与各种弹性材料结合在一起, 而不会对蛋白质基水凝胶样品或钩上的凝胶的滑移造成任何机械变形或损伤。模拟 PID 系统, 连同线性的声音线圈和力传感器, 使应用的控制力的协议, 如力坡道和恒定的力量。最近, 该技术已被用来研究不同的交叉连接浓度的 BSA 为基础的水凝胶在不同的实验解决方案⁷。

在制定和使用蛋白质水凝胶的一个重要方面是测量的重现性。如果凝胶的蛋白质浓度过低或交联不完全, 永久性的塑性变形将出现在延长⁷。这些塑性变形将极大地限制数据解释, 因为粘弹性效应来自于凝胶内的域展开和分子重排。一个简单的测试, 看看是否有完整的交联是浸泡在化学变性剂水凝胶, 如6米胍氯¹。在这种情况下, 不应该有任何粘弹性的影响, 在应力与应变曲线, ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SI-KG4A 力传感器	世界精密仪器 （WPI）	SI-KG4A
线性音圈电机	设备 解决方案	LFA2010
牛血清白蛋白	落基山生物制剂 （RMBIO）	BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
氯化钠	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
硫酸铵		Sigma-Aldrich
6-0 尼龙缝合线 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
仅 1mL 注射器，Luer-Lok 尖端	BD	309628
硅烷，Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
微孔 PTFE 管，0.022 英寸内径 x 0.042 英寸外径，100 英尺/卷	Cole-Parmer	EW-06417-21
皮下注射针头，23 号	医疗保健用品专业人士	305194
Jensen Global JG24-1.5X 红色 IT 点胶针尖 - 24 号	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W 短弧汞灯	ALB	USH-103D USHIO
医用镊子
医用剪刀奥
林巴斯
定制零件的计算机代码和 CAD 设计可应要求提供给通讯作者。