切片中石蜡嵌入组织的切割和漂浮方法

摘要

在这里, 我们提出了一个改进石蜡切片的协议。这种方法结合切割和浮动使用一个简单的恒温室, 以避免转让过程中所需的传统方法。结果表明, 石蜡切片的效率和数量均有显著提高。

摘要

石蜡嵌入组织切片被广泛应用于组织学和病理学。然而, 这是乏味的。为了改进这种方法, 几家商业公司利用流体水设计了复杂的断面传输系统。为了简化这项技术, 我们创建了一个简单的方法, 使用自制的设备, 结合切割和浮动在一个简单的恒温室;因此, 各部分自动进入水浴在水面上。用常规石蜡切片和所提出的方法进行比较, 对成年小鼠脑、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠大脑和成年斑马鱼眼的海马体进行切割。统计分析表明, 改进后的方法节省了时间, 产生了较高的质量剖面。此外, 在短时间内石蜡切片的整个标本是容易的初级操作者。

引言

形态学研究在生物研究中具有重要意义。虽然新技术允许研究人员直接从整个组织或有机体观察他们的目标^1,2,3, 切割标本成薄切片, 其次是染色, 仍然是主要的方法 fornot 组织形态学, 也可直接在组织中进行蛋白靶向。光镜使用三切片类型: 石蜡, 冷冻和半薄切片。虽然 cryosectioning 是常见的保护组织抗原性, 标本准备是简单的, 保留组织形态学较差, 不适合薄切片^4,5。石蜡切片是展示保存完好的形态学最常用的方法。由于试样完全脱水, 并嵌入蜡, 石蜡块可以无限期储存。此外, 石蜡切片产生薄切片, 以改善生物探针进入进一步的实验和减少细胞层叠加在 Z 方向。

然而, 传统的石蜡切片是繁琐的, 需要操作员的技能。石蜡切片经过固定, 脱水, 嵌入, 切割和漂浮。重要的是, 将节带从刀座转移到水浴是必要的, 但对于初级操作者来说是困难的。特别是在干燥的空气中, 节带会由于静电而扭曲, 在温暖的水面上很难展开。为提高切片质量, 在切片刀片通过后, 将所暴露的组织表面湿润, 将蜡块浸泡在冰水中, 或者在切片附近用加湿器提高湿度, 建议^6、7.改进石蜡切片的新方法包括混合石蜡嵌入, cryosectioning⁸和商业部分转移系统协助⁹。虽然这些方法部分提高了石蜡切片的速度和质量, 但它们使切片变得更加繁琐, 商业剖面转移系统是昂贵的。

在本协议中, 我们演示如何逐步创建简单, 廉价和灵活的设备, 这可以连接到旋转切片的刀片持有人。该设备由截面通道、水浴和带有温度检测开关的加热器组成。切割后, 大量的断面流进断面通道, 直接进入水浴, 从而自动展开。这提高了石蜡切片的效率, 使该技术更方便。使用这种方法, 更多的成年小鼠海马切片, 成年小鼠肾脏切片, 胚胎15.5 天老 (E15.5) 小鼠脑切片, 和成年斑马鱼眼切片被收获在较少的时间, 并保持更完整的形态。这种方法也可以用于其他组织样品, 需要加速石蜡切片, 同时避免损失的部分区分。

方案

这里介绍的所有方法均经南昌大学动物保育委员会批准。

1. 装配设备并连接切片

1. 根据要求设计参数 (补充图 1)。
2. 将参数提交当地工厂生产丙烯酸板。
3. 按顺序装配所有部件: 使用氯仿将7个商业丙烯酸板组合成一个带有截面通道和水浴的水箱 (图 1)。
   注意: 氯仿在遇到光和氧时会产生有毒物质。把器具装配在通风罩里。
4. 将管状电热元件通过压克力板 #1 (图 2A、箭头) 安装在孔中。
5. 要安装温度控制器, 请使用电钻在 #2 丙烯酸板上创建一个小孔, 并安装温度检测器 (图 2A、箭头)。在水箱上安装数字恒温器 (图 2A)。
   注: 温度探测器应在水面以下1厘米以内。
6. 要提供电源接入, 请在打开设备前调整电压低于 24 V。
7. 从切片中移除剖面废物托盘。
8. 用中性硅胶密封胶将截面通道与切片刀片架连接 (图 2B)。
   注: 请勿涂抹在刀片顶部上方的中性硅胶密封胶, 使旧刀片易于更换。
9. 夜间干燥, 允许氯仿和中性硅酮密封胶时间固化。
10. 将刀片式服务器安装到刀片式服务器上。将水倒入水浴中 (图 2C)。水面应该只是触摸刀片的顶部 (图 2D,箭头头)。

2. 石蜡切片

注: 碎屑经常堆积在蜡块和水面的上缘或下边缘。这些碎片应定期清除。

1. 执行常规石蜡切片¹⁰。
   1. 将石蜡嵌入试样夹在旋转切片上, 将刀片置于刀片夹持器中。
   2. 转动手轮和切片试样。
   3. 将石蜡切片的丝带转移到38.5 摄氏度温水浴。
   4. 展开后, 从水面上的显微镜上把切片捡起来。
   5. 将烤箱中的幻灯片干燥42摄氏度。
2. 改进石蜡切片 (图 3)
   1. 打开设备。
   2. 打开加热器与温度检测开关, 并设置目标温度之间的38.0 °c 到40.0 °c, 提前1小时, 以温暖的水。
   3. 修改石蜡嵌段获得的石蜡块;然后把石蜡块放在切片的卡带钳上, 然后锁上。
      注: 应水平调整石蜡块的上、下边界, 防止截面带状形成弧形, 无法流经狭窄断面通道。
   4. 通过剪切较厚的部分快速接近样品。
   5. 调整到合适的断面厚度 (10 µm 成年小鼠大脑, 成年小鼠肾脏, 胚胎小鼠大脑, 4 µm 为斑马鱼的眼睛)。转动手轮, 各部分将自动进入截面通道和浴缸。
   6. 切片的标本在一个缓慢和均匀的切割冲程 (图 3A)。
      注: 第一节的 Thethickness 将在手轮停止几分钟后改变。当切片有连续划痕时, 应更换一次性刀片。
   7. 将各部分引导至浴腔内以直线浮动 (图 3B、3C)。
      注: 如果头部部分附着在腔壁上, 请使用画笔导轨使其浮动。
   8. 将部分粘贴到显微镜幻灯片上。在水浴中充分展开部分后, 用镊子分隔几个部分。然后将它们从水浴中接上显微镜幻灯片 (图 3D)。
      注: 应从水浴后部拾起部分, 因为部分通道和水浴的前部仍未完全展开。
   9. 把这些幻灯片放在一个42摄氏度的烤箱里过夜。然后可以无限期地将幻灯片存储在室温下。
3. 应用苏木精-伊红 (he) 染色, 以评价改进方法⁸。

结果

改进后的方法增加了完整石蜡切片的数量。我们对成年小鼠海马组织、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠大脑和斑马鱼的眼睛进行了新的检测。水被增加到坦克, 并且水温保持在38.0 °c 之间到40.0 °c。在连续制备组织样品后, 切片并与常规切片进行比较。该方法避免了切片丢失, 增加了成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5 鼠脑和成年斑马鱼眼中完整切片的比例 (图 4A、4C、4E、4G)。最后, 我们的方法改进了切片, 防止切片损失和收获更完整的切片每标本。

改进后的方法减少了试样的花费时间。在比较常规方法和改进方法之间的时间时, 我们对成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5 鼠脑和成人进行了全系列切片 (从第一节到器官的最后一节)。斑马鱼的眼睛。结果表明, 改进后的方法在所有测试样品中加速了石蜡切片速度 (图 4B...

讨论

为改善石蜡切片形貌, 解决常规石蜡切片过程中的浪费时间问题, 我们建立了一种改进的石蜡切片方法, 结合切割和展开。这种改进的方法依赖于简单的设备, 包括剖面通道, 水浴和加热器与温度检测开关。节带通过剖面通道进入水浴, 并在切割时自动展开。因此, 该方法提高了石蜡切片的质量和效率, 这是通过石蜡切片的成年小鼠海马, 成年小鼠肾脏, E15.5 小鼠的大脑, 和成年斑马鱼眼睛验证。

为了避免在常规石蜡切片期间卷曲, 许多调整, 如滋润组织表面, 冷却蜡块, 增加湿度, 并结合 cryosectioning^{6,7, 8};然而, 这些调整使石蜡切片更繁琐。一个依赖于流体水的商业部门转移系统更加成功。在该系统中, 该剖面在切割后立即接触到水面, 电机驱动的水流将截面从刀片持有者转移到下温水浴⁹。由于其机理, 静电不会抑制切片, 从而提高断面质量。此外, 由于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Boekel Scientific	133000-2		培养箱
	国药化学试剂有限公司，Lid	64-17-5
二甲苯	国药化学试剂有限公司，盖子	1330-20-7
寄生体	徕卡	39601006
加热石蜡包埋模块	徕卡
商用亚克力板
三氯甲烷	国药集团化学试剂有限公司，盖子	67-66-3
管状电加热元件（12 V 200 W）
温度控制器（12 V 120 W）	明硕	XH-W3002
石版切片机	Leica
中性硅酮密封胶			用切片机刀架连接水道
电压互感	Dearll	S-250-12
一次性刀片	Accu-Edge	4689
苏木精	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
曙红	Baso Diagnostics Inc. 公司	BA-4025
Microslide	Sail 品牌	7105
中性香脂	国药化学试剂有限公司，盖	10004160
盖玻片	Citoglas	10212424C
显微镜	Carl Zeiss
盐酸	西龙化工	7647-01-0
石蜡切片水浴	Leica
HistoCore Arcadia C - 冷板	Leica
石蜡驱蚊喷雾	Thermo Scientific	9990420