组织微柱采集装置

摘要

本文介绍一种制备 harvesting 针头的方案，该针头可用于采集全层皮肤组织，同时不会导致供体部位出现瘢痕。这些针头可与简单的采集系统结合使用，实现高通量采集。

摘要

本文描述了一种实验室装置的制备过程，该装置由市售组件制成，可用于采集全层皮肤组织的微柱。微柱体积较小，可使供体部位快速愈合，且不会导致供体部位瘢痕形成；同时，由于采集的是全层组织，因此能够保留皮肤组织中所有细胞和细胞外成分，包括与深层真皮区域及附属皮肤结构相关的成分，而这些结构目前尚无法通过传统组织工程技术成功复制。这些微柱可直接应用于皮肤创面以促进愈合，也可作为其他组织工程方法中自体细胞/组织的来源。采集针头通过对标准皮下注射针头进行改造制成，既可单独用于采集少量组织，也可与基于简单负压的收集系统（同样由常见的实验室耗材制成）联用，实现大量组织采集，从而便于开展大动物模型的相关研究。

引言

自体皮肤移植是创面修复的主要手段，但受限于供区皮肤资源稀缺及供区并发症，近几十年来人们致力于开发可替代传统皮肤移植的新治疗方案^1,2。我们近期开发了一种替代性的皮肤采集方法，在保留全层皮肤移植优势的同时，最大限度地减少供区损伤。通过以微小（直径约0.5 mm）"微柱"形式获取全层皮肤，供区通常可在无瘢痕的情况下快速愈合（潜在例外情况参见下文讨论部分）³。微柱可直接植入创面床，促进创面闭合，减轻收缩³，并重建多种表皮和真皮细胞类型以及功能性附属结构⁴，而这些结构在传统的中厚皮片移植或当前的生物工程皮肤替代物中往往缺失⁵。微柱促进愈合的能力及其供区无瘢痕愈合的特性，已由其他研究团队独立验证^6,7。

我们此前已开发出一种实验室采收系统，以实现微柱的大规模收集⁸；然而，该系统由许多定制组件构成，这些组件并不普遍可得。本文详细描述了 harvesting 针头的制备过程，以及主要由市售组件构成的简易采集系统的制作方法，可用于实现高通量采集。本论文所述装置适用于 体外 以及动物实验，但不可用于人体。一种已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准、可用于人体的临床设备已有商业化产品，但本文不对其作详细讨论。

方案

所有涉及活体动物和动物组织样本的工作均已获得麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 采收针的制备

1. 生产阶段的设置
   1. 将一个雌性鲁尔锁接头固定在支柱上，并将该支柱安装到旋转台上，使鲁尔锁接头位于旋转台中心（图1A）。
   2. 将第一个旋转台垂直放置，并将其垂直安装在第二个水平旋转台上（图1B）。
   3. 将水平旋转台安装到一个双轴平移台上（图1B）。
   4. 将整个组件固定在稳定的表面上，例如光学面包板。
   5. 将一个旋转工具单独安装在同一块面包板上，使工具与面包板平行，并且高度大致与旋转/平移组合台上的鲁尔锁接头相同（图1C）。
   6. 将两个切割轮同心地安装在旋转工具上（较小的低粒径金刚石切割轮套在一个较大的高粒径砂石切割轮外）（图1D）。
      NOTE：两个切割轮直径之间约9 mm的差异通常已足够。
   7. 在旋转工具上方安装一个带可调节臂的顶置光源，使光线对准切割轮。
   8. 为增强可视化效果，将解剖显微镜置于生产装置上方，使目镜聚焦于切割盘上（图1C）。
      ​NOTE：用户也可佩戴放大眼镜作为替代方案。
2. 重塑针尖
   1. 佩戴防护眼镜和外科口罩，以防止细小金属颗粒进入眼睛或呼吸道。
   2. 根据实验需求选择合适规格的皮下注射针头。
   3. 在每根采集针上标记出预期长度。
      NOTE：用于猪皮肤采集时，8 mm长的针头通常已足够；但长度可根据实验需要调整（例如，目标皮肤组织厚度、针头规格）。一般而言，19号针头适用于猪皮肤。
   4. 开启电源后，使用平移装置将针头垂直下移至旋转工具处，利用外侧切割盘边缘在步骤1.2.3标记的位置切断针头多余部分。
   5. 将截短后的钝头针连接至生产台上的雌性鲁尔锁接头。
   6. 调节水平旋转台，使针头与旋转工具上的切割盘呈12°平行角度（改变角度会影响针头插入所需的力）。
   7. 打开顶置光源，并在放大镜下观察针头的同时调整光源位置，直至光线从针头中线（纵向）反射出来。
   8. 启动旋转工具，然后使用平移台将针头向内侧（金刚石）切割盘推进（图2A）。
   9. 持续缓慢推进针头接触切割盘，直到切割盘切入至针头中线附近（通过顶置光源沿中线的反射来判断）。
   10. 缓慢将已切割的针面从内侧金刚石轮转移到外侧砂石轮，以获得更精细的抛光表面（图2B）。
   11. 将针头从切割盘处回撤。
   12. 使用垂直旋转台将针头旋转180°。
   13. 重复步骤1.2.9–1.2.10，重塑针头另一侧。
       NOTE：此时针头应具有两个长度大致相等的切割尖端（图 2C 和 2D）。
   14. 从生产台上取下针头。
   15. 使用略小于针头内径的金属丝清洁针管内腔。
   16. 使用尖锐的木棒（例如，折断棉签上的小木棒末端），清除仍附着在新形成针头边缘的任何毛刺。
       NOTE：采集针可根据需要进行电化学抛光，并通过高压灭菌器灭菌。

2. 皮肤组织采集

1. 使用采集针从皮肤中收集微柱样本 离体 组织或活体动物。
2. 对于 离体 对于较薄的皮肤组织（尤其是皮下脂肪缺失或已被修剪掉的样本），应将目标组织置于50 mL离心管开口上方，或将两片组织叠加在一起，以避免针尖触碰硬物表面而受损。
   ​注意：对于 体内 从活体动物采集时，建议通过皮内注射局部利多卡因和肾上腺素以达到镇痛效果并减少出血。
3. 根据所需的微柱数量，按以下说明组装收获装置。
4. 低至中等体积选项：
   1. 为了收获少量至中等量的微柱，只需将标准注射器（通常使用10–20 mL注射器）装满生理盐水，并将其连接至收获针头即可。
   2. 将采集针完全插入供体皮肤，然后回撤。
   3. 推动注射器活塞，使生理盐水通过采集针，冲洗并推出卡在针孔内的微柱。
   4. 为加快收获过程，在执行步骤 2.4.3 排出微柱前，重复步骤 2.4.2 3 至 5 次。
      注意：通常可将微柱排出至标准细胞滤筛中，以便后续收集微柱。
   5. 若针头发生堵塞，可增加活塞压力以推出阻塞的组织，清除堵塞物。如果仅增加压力仍不足以解决问题，则可通过针尖开口插入金属丝，以清除针管内的堵塞物。
   6. 使用前应始终保持微型柱浸没在生理盐水或培养基中，以防干燥。
      ​注意：由经验丰富的操作人员执行时，上述方法可用于以每秒约1个微柱的速度收获微柱。
5. 高通量选项：
   1. 创建一种简单的辅助吸力装置，可用于构建以促进大量微柱的收集。
      注意：该装置由采集针、带鲁尔锁喷嘴的 20 mL 注射器以及通常用于吸脂术的负压吸引接头组成（图3A，以及无菌吸液瓶。
   2. 从20 mL注射器上取下活塞。
   3. 将注射器连接到吸力接头。
   4. 通过将收集针连接到注射器上完成组装（图3B).
   5. 使用一段无菌吸液管将吸液接头连接至无菌吸液瓶。确保收集装置连接至允许液体顺畅流入吸液瓶的入口（可能需要连接标记为流出而非流入的吸液瓶端口）。
   6. 将装置连接至负压源。
      注意：所需压力取决于针头的直径和长度，如前所述⁸对于本文所述的装置，典型手术室中的吸力系统通常已足够。
   7. 将收获针连接到注射器上。
   8. 通过将采集针插入皮肤来采集微柱。
      注意：微柱将通过吸力被吸入注射器，随后冲入吸液罐中。
   9. 在采集过程中，间歇性地将采集针浸入无菌生理盐水容器中，以冲洗系统。
      注意：此生理盐水冲洗有助于微柱的转移，并确保其保持湿润。或者，可将MFF鲁尔接头连接至注射器的鲁尔锁接口，并通过连接管与悬挂的生理盐水输液袋相连。
   10. 准备一根金属丝或较细的针头，其直径略小于采集针的内径。若针头发生堵塞，可将金属丝插入针管内以清除堵塞。
   11. 当收集罐中积累的微柱达到所需数量时，断开负压装置，然后将收集罐中的内容物通过滤膜倾倒，以回收微柱。
6. 收获后，在供区涂抹局部抗生素软膏。
   注意：供皮区通常不需要额外敷料。

结果

采集针应能够获取全层皮肤组织的微柱，成功率约为 80–90%，每个微柱应包含表皮、真皮以及部分皮下脂肪（图 4）。如果采集成功率较低，或插入组织时感到困难，则可能需要更换新的针头。如果即使使用新针头，采集成功率仍然持续偏低，则可能是针头过短所致。

如果使用 体内供体部位应愈合迅速，因为再上皮化通常在数天内完成³微柱可直接应用于创面床以促进伤口愈合^3,4，或可与不同的基质材料结合以制备复合结构。微柱也可在培养条件下长期维持 体外 研究⁹.

讨论

本文所述方法旨在利用市售实验室耗材制作的工具，收集足量的组织微柱，用于大动物的体内研究。该装置此前已用于获取离体人皮肤^4,9以及活体猪皮肤的组织³。文中描述的具体参数是针对猪组织取样优化而确定的。预计该装置也可经修改后用于啮齿类及其他小型动物的组织采集，但本实验室尚未对此进行验证。

本方案的关键步骤包括：确保采集针具有足够的长度（采集效率低下通常是由于针过短所致），在整个采集过程中保持微柱始终浸没在液体中以防止干燥，以及至少间歇性地用生理盐水冲洗系统（否则微柱更容易堵塞针腔）。该技术的主要局限性在于速度；例如，在我们的演示中，负压辅助装置通常每分钟可采集约120 mg组织，这对于动物实验中常用的较小创面已足够，但对于非常大的创面（例如，严重烧伤模型），采用此方法可能在操作上存在困难。针的规格是另一项限制因素——针的规格越小，越容易发生弯曲，而弯曲正是该技术最主要失效模式（相比之下，该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金刚石磨轮	Dremel	545
皮下注射针头（19G）	Fisher Scientific	14-840-98	可根据实验需求使用其他规格的针头
砂石磨轮	Dremel	540
注射器（20 mL，带鲁尔锁）	Fisher Scientific	22-124-967
吸引接头	Tulip Medical	PA20BD	可选，用于大容量采集
吸引瓶	Fisher Scientific	19-898-212	可选，用于大容量采集。使用前需灭菌。
吸引管路	Medline	DYND50216H	可选，用于大容量采集