本方案描述了如何通过使用Chou和Talalay的联合指数方程，在临床前模型中评估抗癌抗体与抗肿瘤药物之间的协同作用。
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方法文章
增强抗肿瘤药物对抗癌抗体疗效的协同作用：利用联合指数方程检测抗体-药物协同效应
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
通过化疗药物增强具有细胞毒性的单克隆抗体（mAb）的疗效，是设计高效且安全抗癌治疗方案的重要策略。本文提供了一种在临床前阶段筛选合理药物组合的实验方案。首先，我们描述了一种基于细胞的检测方法，用于评估抗肿瘤单克隆抗体与细胞毒性药物之间的协同作用，该方法采用Chou和Talalay的联合指数方程进行分析。1包括使用MTT法测定肿瘤细胞对药物和抗体的敏感性，随后通过计算机自动分析计算联合指数（CI）值。CI值小于 <1 表明所测试的单克隆抗体与细胞毒药物之间存在协同作用1. 为了证实这一点 体外 研究结果 体内我们进一步描述了一种在异种移植肿瘤模型中评估联合用药方案疗效的方法。在该模型中，联合用药方案显著延缓了肿瘤生长，与单药对照组相比，显著延长了生存期。重要的是，该 体内 实验结果表明，该联合用药方案耐受性良好。本方案可有效评估抗癌药物组合在临床前模型中的效果，并筛选出合理的药物组合，用于后续临床试验的评价。
引言
传统上，针对多种不同类型癌症的治疗方法主要基于单一疗法。尽管该方法在许多情况下仍在使用，但其遇到了若干障碍，从而促使人们转向联合治疗策略2。特别是，癌细胞在单药治疗时更容易通过激活替代性生存机制而产生耐药性3，导致患者治疗失败4。此外，在单一疗法中，药物通常以高剂量给药，这种情况常常引发严重的剂量依赖性副作用，可能无法耐受，迫使医生终止治疗2。基于这些原因，目前更倾向于采用抗癌药物联合治疗而非单一疗法。
理想的药物组合应能协同作用于肿瘤细胞，同时不增加对正常细胞的毒性。协同作用是指两种或多种药物相互作用所产生的治疗效果大于各药物单独作用效果的总和。此类相互作用可能增强临床治疗效果2。它可限制治疗耐药性的产生，提高疗效，并可能降低毒性2。事实上，通过靶向不同通路，每种药物的剂量均可减少，从而降低其副作用。此外，其中一种分子还可作为对癌细胞的致敏剂。在已被致敏的细胞中，第二种药物的作用可能增强，因而可使用更低的剂量5。
联合治疗可包括两种或两种以上的化疗药物和/或生物制剂，例如单克隆抗体
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方案
动物饲养和实验程序已获得法国政府批准（许可协议编号：#C44-278 和 #APAFIS 03479.01）。动物护理和操作均依据欧盟指令 EU 2010/63/EU 以及法国关于用于科研目的动物保护的法律 #2013-118 进行。
1. 单克隆抗体8B6与拓扑替康药物相互作用的评估 体外
- 96孔板样品制备
警告：请咨询所在机构的健康与安全委员会，并遵守与实验室安全相关的当地法规。在使用任何培养基、细胞系或试剂前，应查阅材料安全数据表。操作时应采用适当的无菌技术，并在超净工作台内进行。所有用于细胞操作的溶液和设备必须无菌。
注意：以下方案适用于贴壁细胞。若应用于悬浮生长的非贴壁细胞，需进行相应修改；本方案中每个实验条件设置四个重复。- 在T75培养瓶中培养IMR5细胞。
- 第一天（第0天），在显微镜下观察细胞培养状态，检查细胞汇合度。吸除培养瓶中的培养基，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，加入3 mL含0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液。将培养瓶放回培养箱孵育3分钟（37 °C，5% CO2）。
- 在显微镜下观察细胞是否脱落。
注意：如有必要，可根据肿瘤细胞类型将培养瓶继续放回培养箱额外孵育3至5分钟。 - 向培养瓶中加入10 mL完全....
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结果
代表性结果和图示经许可改编自先前发表的研究14。
抗O-乙酰化GD2单克隆抗体8B6协同增强拓扑替康对神经母细胞瘤细胞系生长的抑制作用：
为确定用于评估拓扑替康与单克隆抗体8B6之间协同作用的药物和抗体浓度，首先采用MTT法检测人IMR5神经母细胞瘤细胞对药物和抗体的敏感性。单独暴露于单克隆抗体8B6或拓扑替康72小时后，IMR5细胞活力均呈浓度依赖性抑制（图 4A。剂量-反应曲线可用于计算ED50 每个化合物的数值。为此，使用分析模拟软件计算了Fa值。计算得到的ED50 发现拓扑替康的值为 10 nM ± 1
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讨论
为了预测药物相互作用的效果，可以采用三种方法：等效图法17、非线性混合模型18以及联合指数法1。其中，联合指数分析应用最为广泛，因其可通过一个用户友好的计算机程序简化操作。为此，我们首先通过MTT实验19，对单独使用或联合使用的每种药物的剂量-效应关系进行了表征。该方法基于活细胞将四唑盐还原为紫色甲臜产物的能力，该产物在570 nm处具有最大吸光度19。细胞死亡后，失去将MTT转化为甲臜的能力。因此，生成的有色甲臜产物的量与培养物中活细胞的数量成正比19。事实上，我们选择该方法作为测量细胞增殖的非放射性替代方案，以取代将氚标记的胸苷掺入DNA的方法19。因此，MTT实验已被广泛采用，并在学术实验室中保持流行，已有数千篇发表文章为证。虽然甲臜的量通常通过使用酶标仪在570 nm处测定吸光度来获得，有时也会使用.......
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披露
S.Fa.、J.F. 和 S.B. 被列为正在申请的专利的发明人，这些专利涉及抗O-乙酰化GD2治疗性抗体的临床应用。
致谢
基金支持：南特大学项目基金会（Fondation de Projet de L'Université de Nantes）、les Bagouz' à Manon、卢瓦尔-大西洋省抗癌联盟（La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique）、莫尔比昂省分会（comité du Morbihan）和旺代省分会（comité de Vendée）、une rose pour S.A.R.A.H、L'Etoile de Martin 以及法国儿童与青少年癌症和白血病防治协会（Société Française de Lutte contre les Cancers et les leucémies de L'Enfant et de L'adolescent, SFCE）。 M.B. 和 J.F. 由法国抗癌联盟（La Ligue Contre Le Cancer）提供资助。作者感谢弗朗索瓦·博纳米联合研究结构（Structure Fédérative de Recherche François Bonamy）的UTE技术平台。作者还感谢巴黎国家健康与医学研究院（Inserm）的 S. Suzin 博士提供 IMR5 细胞，以及 H. Estéphan 女士的技术协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞增殖检测试剂盒（MTT） | Roche | 11-465-007-001 | |
| CompuSyn 软件 | ComboSyn | CompuSyn 可在 http://www.combosyn.com 免费下载 | |
| 电动剃须刀 | Bioseb | BIO-1556 | |
| 胎牛血清 | Eurobio | CVFSVFF00-01 | RPMI 1640 培养基中含 10% 经热灭活的胎牛血清 |
| Firefox | Mozilla Corporation | Firefox 可在 http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ 免费下载 | |
| 加热灯 | Verre&Quartz | 4003/1R | |
| 人神经母细胞瘤 IMR-5 细胞系 | Accegen Biotechnology | ABC-TC0450 | IMR-5 是人神经母细胞瘤细胞系 IMR32 5459762 的一个克隆。IMR-5 细胞由法国巴黎 U.872 的 Santos Susin 博士慷慨提供 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | RPMI 1640 培养基中含 2 mM L-谷氨酰胺 |
| 裂解液 | Roche | 11-465-007-001 | |
| mAb 8B6 | 南特大学 | N/A | |
| Matrigel | Corning | 354248 | |
| Multiskan FC | Thermofischer Scientific | N08625 | |
| 21G 1 ½ 针头 | BD Microlance | 304432 | |
| 25G 1 针头 | Terumo | NN-2525R | |
| NSG 小鼠 | Charles River Laboratories | 5557 | |
| Nunc MicroWell 96 孔微孔板 | Thermofisher | 167008 | |
| PBS | VWR | L182-10 | |
| 含 0.05% EDTA 的 PBS | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| 运行 Windows 7 操作系统的个人电脑 | Microsoft | Windows 7 可在 http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 购买 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | RPMI 1640 培养基中含 100 单位/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素 |
| 试剂储液槽 | Thermofischer Scientific | 8094 | |
| 啮齿类动物固定器 | Bioseb | TV-150-SM | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 31870-025 | |
| 1 mL 注射器 | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 拓扑替康 | Sigma-Aldrich | T2705 |
参考文献
- Chou, T. C. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).
- Bayat Mokhtari, R., et al. Combination therapy ....
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重印与许可
