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从始发多能性诱导多能干细胞衍生的类胚体表面产生人类原始生殖细胞样细胞

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DOI：

10.3791/58297

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2019年1月11日

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1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

本文内容

摘要

原始生殖细胞（PGCs）是精子和卵子的共同前体细胞。人类胚胎中的原始生殖细胞通过细胞因子的相互作用，由多能性上胚层细胞发育而来。本文中，我们描述了一种为期13天的实验方案，可从处于启动态多能性的诱导性多能干细胞出发，在类胚体表面诱导产生在转录组水平上类似于原始生殖细胞的人类细胞。

摘要

原始生殖细胞（PGCs）是所有生殖系细胞的共同前体。在小鼠胚胎中，约40个PGCs由多能性上胚层细胞在包括骨形态发生蛋白4（Bmp4）在内的多种细胞因子有序作用下被诱导产生。在人类胚胎中，最早的PGCs于卵黄囊内胚层壁被发现，时间约为第3周末rd 妊娠周数，但关于人类原始生殖细胞（PGC）的特化过程及其早期发育机制仍知之甚少。为了克服研究人类胚胎PGC所面临的技术与伦理障碍，近年来已利用多能干细胞建立了替代性的体外细胞培养模型。本文介绍一种为期13天的高效方案，用于大量生成人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）。处于启动态多能性状态的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在4i naïve重编程培养基中孵育48小时后，被解离为单细胞并接种至微孔中。hiPSCs在naïve多能性状态下长期维持会导致显著的染色体异常，应避免此种情况。接种于微孔中的hiPSCs在4i培养基中继续培养24小时以形成类胚体（EBs），随后将EBs转移至低黏附性塑料器皿中，在含高浓度重组人BMP4的hPGCLC诱导培养基中，于摇动条件下培养。EBs在持续摇动、非黏附的条件下进一步培养最多8天，以获得最大产量的hPGCLCs。通过免疫组织化学检测，hPGCLCs在几乎所有EBs的表面均表现为强表达OCT4的细胞，易于识别。当EBs经酶解解离并进行FACS富集时，hPGCLCs可被收集为CD38+细胞，收获率可达40–45%。

引言

原始生殖细胞（PGCs）是两性中所有生殖系细胞的共同前体。关于哺乳动物胚胎中 PGC 发育的大部分知识均来自对实验小鼠的研究1,2。在小鼠胚胎发育第 6.0–6.5 天时，约有 6 个或相近数量的 PGC 前体细胞位于上胚层中，并在邻近细胞分泌的骨形态发生蛋白 Bmp2 和 Bmp4 的作用下，诱导产生约 40 个 PGC 创始群体。迄今为止在人类胚胎中发现的最早的 PGC 位于妊娠第三周左右的卵黄囊内胚层壁上3。由于该位置与小鼠胚胎中迁移期 PGC 所处的位置相同，因此所观察到的人类 PGC 很可能正处于迁移路径上，而非创始群体。然而，目前尚缺乏对人类胚胎中更早期阶段的 PGC 或 PGC 前体细胞的追踪研究。

由于技术和伦理方面的障碍，获取人类胚胎原始生殖细胞（PGCs）十分困难。为克服这些难题，近年来已利用人类多能干细胞（PSCs）建立了类似原始生殖细胞的体外培养模型。多能性是指细胞分化为生殖系以及三个胚胎胚层的能力4。在包被有细胞外基质蛋白的培养皿中，使用mTeSR1培养基（一种即用型商业化培养基，专为维持人类PSCs处于 primed 多能性状态而设计）培养的人类PSCs具有primed态多能性4；而2013年Jacob Hanna实验室表明，通过将primed多能性细胞暴露于含有多种蛋白激酶抑制剂（包括ERK1/2、GSK3、JNK、ROCK、PKC和p38 MAPK）以及生长因子LIF、TGF、bFGF的naïve人类干细胞培养基（NHSM）中，可将其转化为naïve多能性状态5。基于处于naïve多能性状态的人类PSCs，2015年Hanna与Azim Surani领导的研究团队首次成功实现了从PSCs高效生成人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）6。此后，包括我们实验室在内的多个研究团队相继报道了采用略有差异的实验方案由PSCs诱导生成hPGCLCs的方法7,8,9,10。我们的研究提供了证据表明，使用不同实验方案（详见我们先前发表的研究中表S1的总结10）所获得的hPGCLCs在转录组水平上彼此高度相似10。现有证据支持hPGCLCs与早期人类胚胎PGCs具有相似性，尤其是在全基因组表观遗传擦除7和/或趋化迁移发生之前阶段10。

对小鼠胚胎原始生殖细胞（PGCs）、小鼠PGCLCs以及人类PGCLCs的研究（但对人类PGCs的获取极为有限）表明，小鼠与人类在PGC特化过程中的分子机制存在显著差异1,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。例如，Prdm14在小鼠胚胎PGC特化过程中发挥关键作用，但在人类PGC特化中的作用似乎较为有限1,15。相反，EOMESODERMIN诱导SOX17的表达对人类PGC特化至关重要6,11,14，而这些转录因子在小鼠PGC特化过程中似乎并非必需15。这些利用hPGCLCs所取得的初步研究成果，强有力地支持了该体外培养细胞模型作为人类胚胎PGCs替代体系的重要价值。

近期发表的研究表明，包括我们实验室在内，通过对基因组DNA拷贝数进行深度测序分析，发现将多能干细胞（PSCs）长期维持在初始态多能性（naïve pluripotency）状态会显著增加染色体不稳定性和结构异常的风险。该现象在小鼠18和人类19的PSCs中均有观察到。Hanna/Surani团队最初报道的人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）诱导方案，是针对已在4i初始态多能性培养基中维持至少2周的人类PSCs所开发的6。为了保持人类PSCs及hPGCLCs正常的二倍体核型，我们开发了一种改良方案，将人类PSCs在4i培养基中的暴露时间缩短至仅72小时10，本文即介绍该优化后的流程。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）通常维持在 primed 多能性状态。在拟胚体（EB）形成前，细胞先在4i初始态重编程培养基（一种改良的NHSM培养基）中孵育48小时。随后将细胞解离并接种至微孔板中，在4i培养基中继续培养24小时以形成EB。EB随后转移至含高浓度重组人BMP4的hPGCLC诱导培养基中，在摇动条件下进行无贴壁培养，最长持续8天，以获得最大产量的hPGCLCs。经过8天的EB培养后，可通过FACS从解离的EB细胞中分离出CD38+的hPGCLCs，其得率最高可达约40%，并可获得适合FACS分选的单细胞悬液。与此前已发表的其他方法7,8,9（包括我们改进前的原始方案6）通常在自发形成的细胞聚集体中产生hPGCLCs且无特定定位不同，本方案所产生的hPGCLCs主要出现在拟胚体（EBs）的表面。

方案

1. 处于始发态多能性的 hiPSC 细胞培养

  1. 细胞外基质蛋白包被培养皿的制备
    1. 将Matrigel（细胞外基质蛋白）在冰箱或冷室中置于冰上过夜解冻（切勿在室温或温水浴中解冻）。在冰上将基质蛋白分装至无菌低吸附离心管或细胞冻存管中（每管约200 μL；分装体积由每批次生产商确定，并标注于瓶身标签上）。分装过程中必须始终保持细胞外基质蛋白处于冰上低温状态，以防止其凝固。分装后储存于-80 °C。
    2. 为包被细胞培养用塑料培养皿，取一份分装的基质蛋白与25 mL冰上预冷的DMEM/F12培养基混合，均匀涂布于三个10 cm培养皿中（每皿约8 mL）。室温孵育至少1小时。包被完成后，可用封口膜密封培养皿，并在室温下保存最多一周。
    3. 在接种始发态多能性hiPSCs前，立即吸除培养皿中的液体。无需使用培养基或无钙镁磷酸盐缓冲液[PBS(-)]洗涤包被过的培养皿。
  2. 始发态多能性hiPSC培养的启动
    1. 在15 mL离心管中，向10 mL mTeSR1培养基中加入2 µL 50 mM Y27632 [Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂]。为从1 mL冻存细胞起始在1个10 cm培养皿中启动培养，需准备两管含ROCK抑制剂的10 mL培养基。Y27632补充培养基需当天使用，并在37 °C水浴中预热5分钟。
      注意：本方案适用于维持在mTeSR1中的hiPSCs。当hiPSCs在支持人类PSC生长的其他培养基中维持，且处于不同程度的始发态或多能性初始态时，hPGCLC的产量可能会显著不同。
      注意：完全mTeSR1培养基在4 °C可保存2周，在-20 °C可保存6个月，但反复冻融会导致性能下降。我们将40 mL分装的mTeSR1在-20 °C冷冻保存直至使用。
    2. 使用37 °C水浴解冻一管始发态多能性hiPSC冻存细胞（1.0 - 3.0 x 106 个细胞，溶于1 mL冻存液中）。解冻完成后立即转移整管内容物至一管（10 mL）预热的含Y27632培养基中。
    3. 在室温下以300 x g离心细胞悬液8分钟。弃上清，用另一管中预热的含Y27632培养基重悬细胞沉淀，总体积为10 mL。
    4. 将细胞悬液均匀铺入已包被细胞外基质蛋白的10 cm培养皿中。将培养皿置于三气CO2培养箱（37 °C，6.5% O2，5% CO2）中。hiPSC培养需在低氧压力条件下维持。
    5. 每天更换培养基（不含Y27632的mTeSR1）。ROCK抑制剂（Y27632）对单细胞解离后hiPSC的存活至关重要。一旦hiPSC以均匀分布的小细胞团形式贴附于细胞外基质蛋白包被的表面，且融合度超过>10%（通常在接种后16小时内完成），即可不再使用Y27632。在接种解离后的hiPSC后过早更换为不含Y27632的培养基，可能导致几乎完全的细胞死亡。
  3. 始发态多能性hiPSC的传代
    注意：当细胞集落占据约80%有效生长面积时进行传代。正确的传代操作和接种密度对实验可重复性至关重要。我们观察到，从冻存细胞起始培养6天（经历一次或两次传代）或一个月（经历>10次传代）的hiPSC在hPGCLC诱导效率上无显著差异。尽管未进行定量评估，但维持超过两个月的hiPSC仍可成功诱导hPGCLC。
    1. 取4 mL细胞解离酶混合液于15 mL离心管中，在室温下平衡5分钟。
    2. 在15 mL离心管中预热10 mL PBS(-)，置于37 °C水浴中加热超过>5分钟。
    3. 在15 mL离心管中，向10 mL mTeSR1培养基中加入2 µL 50 mM Y27632（ROCK抑制剂）。准备两管含ROCK抑制剂的10 mL培养基，并于同一天使用。另取一15 mL离心管，加入5 mL未添加Y27632的mTeSR1培养基。将含/不含Y27632的培养基在37 °C水浴中预热5分钟。
      注意：步骤1.3.3中制备的所有培养基分装液均可含有Y27632。
    4. 吸除10 cm培养皿中的旧培养基，用预热的10 mL PBS(-)冲洗细胞一次。弃去PBS(-)，向培养皿中加入4 mL解离酶。将培养皿置于CO2培养箱中（使用三气培养箱更佳，但非必需）约4分钟，直至细胞从底部脱离。轻柔吹打使细胞形成单细胞悬液。
    5. 将hiPSC单细胞悬液转移至含有5 mL不含Y27632的预热培养基的离心管中（15 mL离心管中总体积约为9 mL）。在室温下以300 x g离心8分钟。
    6. 弃上清，用10 mL含Y27632的预热培养基重悬细胞沉淀。
    7. 使用40 µm细胞筛去除细胞团块，并使用库尔特计数器测定细胞密度。
    8. 用预热的含Y27632培养基稀释细胞悬液，使10 mL中含3.0 x 106个细胞，用于接种至已包被细胞外基质蛋白的10 cm培养皿中。将接种后的培养皿置于三气CO2培养箱（37 °C，6.5% O2，5% CO2）中。
    9. 每天更换培养基（不含Y27632的mTeSR1）。

2. 人原始生殖细胞样细胞的生成

注意：当10 cm培养皿中的hiPSC细胞（mTeSR1培养基，包被细胞外基质蛋白）达到约80%融合度（约107个细胞）时，开始以下步骤。

  1. 细胞外基质蛋白包被培养皿的制备（第1天）
    1. 将一管细胞外基质蛋白在冰上解冻，并用25 mL冰预冷的DMEM/F12培养基稀释。
    2. 将稀释后的细胞外基质蛋白溶液加入6孔板中（每孔1 mL）。一管基质蛋白足以包被24个孔（4块板）。室温孵育至少1小时。未使用的包被板可密封后在室温保存最多一周。
    3. 在接种始发态多能性hiPSC前立即吸除孔内液体。无需用培养基或PBS(-)洗涤包被过的培养皿。
  2. 将始发态多能性hiPSC接种至细胞外基质蛋白包被的培养板中（第1天）
    1. 取4 mL细胞解离酶置于15 mL离心管中，室温平衡5分钟。
    2. 将10 mL PBS(-)预热于15 mL离心管中，在37 °C水浴中温育>5分钟。
    3. 在50 mL离心管中，向35 mL mTeSR1培养基中加入7 µL 50 mM Y27632（ROCK抑制剂）。Y27632补充培养基需当天使用。共配制两管，总计70 mL Y27632补充培养基，并在37 °C水浴中预热15分钟。
    4. 吸除10 cm培养皿中的旧培养基，用预热的10 mL PBS(-)冲洗细胞一次。弃去PBS(-)，向培养皿中加入4 mL细胞解离酶。将培养皿置于CO2培养箱中（可使用三气培养箱，但非必需），约4分钟后细胞从皿底脱落。轻柔吹打使细胞形成单细胞悬液。
    5. 将hiPSC单细胞悬液转移至含有10 mL Y27632补充培养基的预热离心管中。室温下300 × g离心8分钟。
    6. 弃去上清液，用10 mL预热的Y27632补充培养基重悬细胞沉淀。
    7. 将细胞悬液通过细胞筛（40 µm孔径）过滤以去除细胞团块，并使用库尔特计数器进行细胞计数。
    8. 用50 mL预热的Y27632补充培养基将hiPSC单细胞悬液稀释至5.0 × 106个细胞。
    9. 向已包被的6孔板（共4块，24孔）每孔接种2 mL细胞悬液（含2.0 × 105个细胞）。确保细胞在每孔中均匀分布。将细胞培养板置于三气CO2培养箱中（37 °C，6.5% O2，5% CO2）。
      注意：接种细胞密度及每孔中的均匀分布至关重要。若将hiPSC接种于10 cm培养皿，可能导致局部细胞密度过高。使用6孔板更易实现单细胞hiPSC的均匀分布。
    10. 接种后24小时，更换为不含Y27632的mTeSR1培养基（每孔2 mL）。
  3. 将始发态多能性hiPSC转化为4i幼稚态（ERK非依赖型）多能细胞（第3天和第4天）
    1. 在50 mL离心管中配制4i完全幼稚态多能性培养基（第3天和第4天使用）：50 mL 4i基础培养基，30 mM CHIR99021 5 µL，10 mM PD0325901 5 µL，20 mM BIRB796 5 µL，50 mM SP600125 5 µL，以及50 mM Y27632 5 µL。
      注意：4i基础培养基应保存于-80 °C，使用前在冰箱中过夜解冻。4i完全培养基需现用现配。避免4i化学试剂（CHIR、PD、BIRB和SP）暴露于强光下。切勿将4i完全培养基在4 °C保存或冷冻过夜及以上时间。
    2. 将50 mL 4i完全培养基在37 °C水浴中预热15分钟。在接种后48小时和72小时更换为预热的4i完全培养基（每孔2 mL）。精确的换液时间对获得高产率的人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）及实验可重复性至关重要。
      注意：在此条件下，4i hiPSC培养密度较高，接种后48–72小时达到汇合状态，此为正常现象。
  4. 使用微孔板形成拟胚体（EB）（第5天）
    1. 在50 mL离心管中配制50 mL 4i完全培养基，使用前在37 °C水浴中预热约15分钟。
    2. 在50 mL离心管中预热35 mL DMEM/F12，使用前在37 °C水浴中温育约15分钟。
    3. 准备微孔板
      1. 在微孔板的8个活性孔中加入5%（w/v）过滤除菌的Pluronic F-127去垢剂（见材料表；每孔0.5 mL）。
      2. 将微孔板在室温下以1,000 × g离心5分钟。用倒置显微镜检查微孔，确保无气泡。将微孔板在室温下静置30分钟，使去垢剂充分包被微孔。
      3. 用移液器吸除微孔板各孔中的去垢剂溶液，并用预热的DMEM/F12（每孔2 mL）冲洗孔内。
      4. 将微孔板在室温下以1,000 × g离心5分钟。用倒置显微镜检查微孔，确保无气泡。
        注意：若微孔中仍可见气泡，请检查微孔片是否牢固粘附于孔底。
      5. 用移液器吸除微孔板各孔中的DMEM/F12，并用预热的DMEM/F12（每孔2 mL）再次冲洗。
      6. 重复步骤2.4.3.3至2.4.3.4。
      7. 向清洗后的微孔板各孔中加入4i完全培养基（每孔1 mL）。将剩余的4i完全培养基保留在37 °C水浴中。
      8. 将微孔板在室温下以1,000 × g离心5分钟。用倒置显微镜检查微孔，确保无气泡。
      9. 将微孔板置于三气培养箱（37 °C，6.5% O2，5% CO2）中，直至接种4i hiPSC。
    4. 将4i iPSC接种至微孔板
      1. 取13 mL细胞解离酶置于15 mL离心管中，室温平衡5分钟。
      2. 将50 mL PBS(-)预热于50 mL离心管中，在37 °C水浴中温育>5分钟。
      3. 吸除24孔幼稚态hiPSC培养物中的旧培养基，用预热的PBS(-)（每孔2 mL）冲洗一次。弃去PBS(-)，向每孔加入0.5 mL解离酶。将培养板置于CO2培养箱（37 °C）中约4分钟，直至细胞从皿底脱落。轻柔吹打使细胞形成单细胞悬液。
      4. 将hiPSC单细胞悬液转移至含有20 mL预热4i完全培养基的离心管中。室温下300 × g离心8分钟。
      5. 弃去上清液，用5 mL预热的4i完全培养基重悬细胞沉淀。
      6. 将细胞悬液通过细胞筛（40 µm孔径）过滤以去除细胞团块。用1 mL预热的4i完全培养基冲洗细胞筛3次。使用库尔特计数器进行细胞计数。
      7. 将4i幼稚态hiPSC单细胞悬液用9 mL预热的4i完全培养基稀释至27.0–32.4 × 106个细胞。注意：4i完全培养基中已含有Y27632。
      8. 从三气培养箱中取出含有1 mL 4i完全培养基的微孔板（见步骤2.4.3.9）。向每孔接种1 mL 4i幼稚态hiPSC悬液（每孔含3.0–3.6 × 106个细胞）。此细胞密度至关重要。通过轻柔吹打确保每孔中细胞均匀分布。
      9. 将微孔板在室温下以100 × g离心3分钟。
      10. 将微孔板置于三气CO2培养箱（37 °C，6.5% O2，5% CO2）中。避免扰动已沉降于微孔中的细胞。培养24–30小时。过夜培养（约16小时）通常不足以形成紧密的拟胚体（EB）。
  5. 将EB转移至低吸附板进行摇床培养（第6天）
    1. 在50 mL离心管中配制hPGCLC完全培养基（第6天至第13天使用）：
      20 mL hPGCLC基础培养基，500 mM 2-巯基乙醇 4 μL，20 mg/mL L-抗坏血酸 50 μL，50 mM Y27632 4 μL，100 μg/mL重组人BMP4 50 μL，500 μg/mL人SCF 4 μL，250 μg/mL人EGF 4 μL，以及250 μg/mL人LIF 8 μL。
      注意：hPGCLC完全培养基需现用现配，避免光照。切勿将hPGCLC完全培养基在4 °C保存或冷冻过夜及以上时间。
      注意：BMP4浓度非常高。不同批次BMP4的最适浓度可能不同。BMP4批次间的差异显著影响hPGCLC的生成。若hPGCLC完全培养基中缺乏BMP4，则hPGCLC产量极低6。其他细胞因子在hPGCLC完全培养基中的重要性由Hanna/Surani等人描述6。
      注意：本方案中，hPGCLC完全培养基中人LIF的终浓度为100 ng/mL6,10。此前发表的研究（包括我们自己的研究）中使用的终浓度为1 μg/mL。当人LIF试剂的比活性>10,000 units/μg（ED50 < 0.1 ng/mL）时，100 ng/mL的LIF足以支持EB中hPGCLC的生成。
    2. 转移EB
      1. 在37 °C水浴中预热5 mL hPGCLC基础培养基和20 mL hPGCLC完全培养基>5分钟。
      2. 将细胞筛倒置放置于50 mL聚丙烯离心管顶部。
      3. 极其轻柔地吹打微孔板各孔，使EB从微孔中脱离。将每孔内容物通过细胞筛过滤，以去除未整合进EB的细胞。
      4. 用1 mL预热的hPGCLC基础培养基清洗滞留在细胞筛上的EB。轻柔重复清洗5次。
      5. 清洗后的EB现滞留在倒置于50 mL离心管顶部的细胞筛膜上。将一个新的50 mL离心管置于细胞筛上，使细胞筛在新管中处于正常位置。然后迅速将细胞筛连同新管整体翻转。此时细胞筛和离心管均处于正常位置，EB位于细胞筛膜下方。
      6. 从细胞筛膜上方加入18 mL预热的hPGCLC完全培养基，使培养基穿过膜，将附着于膜下侧的EB冲入离心管底部。
      7. 将EB悬液接种至低吸附6孔板中（每孔3 mL）。
      8. 将低吸附板置于三气培养箱（37 °C，6.5% O2，5% CO2）中的往复摇床上，设置摇动速度约为每分钟20转。
        注意：避免使用旋转晃动，否则EB将在孔中央聚集并融合。需仔细调节摇动速度，防止EB聚集。过于剧烈的摇动会物理损伤EB。
        注意：强烈建议在低氧条件下培养EB。
  6. 在EB表面生成hPGCLC（第7天至第13天）
  7. 每天新鲜配制20 mL hPGCLC完全培养基。停止摇动后，EB约1分钟内会沉降至孔底。更换培养基时避免EB干燥（可保留约0.2 mL/孔旧培养基），每天更换新鲜hPGCLC完全培养基（每孔3 mL）。

3. 胚状体的免疫组织化学染色（第10天至第13天）

  1. 将EBs包埋于细胞外基质蛋白块中用于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的免疫染色
    1. 为了将hPGCLCs鉴定为OCT4+细胞，将EBs收集至1.5 mL低吸附微量离心管中。让EBs自然沉降至管底，或在室温下短暂离心（2秒），弃去上清液。用冰预冷的PBS(-)清洗EBs一次。
    2. 去除PBS(-)，加入1 mL冰预冷的含1%（w/v）叠氮化钠的PBS(-)，冰上孵育5分钟。让EBs沉降或短暂离心（2秒，室温），弃去上清液，并用冰预冷的PBS(-)清洗EBs一次。
      注意：添加叠氮化钠可减缓细胞内蛋白质和RNA转录本的降解。
    3. 将200 µL细胞外基质蛋白在冰上解冻，加入含有EBs的微量离心管中。室温放置约10分钟，直至凝胶完全凝固。
    4. 加入1 mL含4%甲醛的PBS(-)，室温下轻柔振荡孵育15分钟。
      注意：此步骤同时固定EBs和细胞外基质蛋白。若不进行固定，凝胶块可能在脱水过程中分解。若使用预先固定的EBs包埋于凝胶块中，则EBs会随凝胶再次固定，可能导致过度固定。
    5. 弃去甲醛溶液，用冰预冷的PBS(-)清洗EBs一次。加入1 mL 70%乙醇。包埋于凝胶中的EBs可在4 °C下保存于70%乙醇中一周。
    6. 采用标准FFPE流程处理凝胶包埋的EBs。制备厚度为5 μm的FFPE切片。切片于室温下干燥过夜，保存至进行免疫染色前。
      注意：我们的常规FFPE流程如下：70%乙醇，两次更换，每次1小时；80%乙醇，一次更换，1小时；95%乙醇，一次更换，1小时；100%乙醇，三次更换，每次1.5小时；二甲苯，三次更换，每次1.5小时；石蜡（58–60 °C），两次更换，每次2小时。脱水后的组织包埋于石蜡块中，并切成3–10 μm（通常为5 μm）的切片。
    7. 染色前，将切片置于56 °C烘箱中完全干燥至少30分钟。使用二甲苯和梯度乙醇系列进行脱蜡和水化。随后用自来水冲洗切片5分钟。
    8. 为灭活内源性过氧化物酶，将复水后的切片在室温下用BLOXALL封闭液孵育10分钟，然后用PBS冲洗5分钟。
    9. 在室温下用正常马血清（或与二抗来源物种相匹配的其他正常血清）封闭切片20分钟。
    10. 将切片与抗OCT-3/4山羊来源的一抗在含0.1% BSA的PBS(-)中稀释后，于4 °C孵育过夜（针对每种一抗优化稀释比例和孵育条件）。随后在室温下用PBS(-)洗涤切片三次，每次5分钟。
    11. 将切片与Anti-Goat IgG（辣根过氧化物酶标记的马来源二抗；见材料表）在室温下孵育30分钟，然后在室温下用PBS(-)洗涤三次，每次5分钟。
    12. 使用前立即配制所需量的DAB显色底物（见材料表），将切片置于完整的DAB显色液中，室温孵育5分钟。在倒置显微镜下观察DAB显色情况，当OCT4+细胞可见时，立即用流动自来水快速冲洗切片以终止反应。
    13. 使用梯度乙醇和二甲苯系列对切片进行脱水。切片可用于激光捕获显微切割。如需高分辨率显微观察，使用封片剂（见材料表）制备永久性FFPE切片。

4. 从拟胚体中通过流式细胞术富集人原始生殖细胞样细胞（第10天至第13天）

  1. 准备拟胚体解离试剂盒的酶混合液
    1. 将50 µL 酶P加入1,900 µL缓冲液X中，配制酶混合液1，并涡旋混匀。将酶混合液1置于37 °C水浴中预热15分钟。
    2. 将10 µL 酶A加入20 µL缓冲液Y中，配制酶混合液2。
    3. 将酶混合液1和酶混合液2混合，制备完全拟胚体解离酶混合液。
  2. 拟胚体的解离
    1. 从低吸附培养板中收集拟胚体，于15 mL离心管中室温离心，300 × g离心2分钟。弃上清，用10 mL PBS(-)重悬拟胚体，再次离心。
    2. 弃上清，用完全拟胚体解离酶混合液（4.1.3）重悬拟胚体。将拟胚体悬液置于37 °C水浴中孵育15–20分钟，直至拟胚体完全解离。孵育期间，每隔3–5分钟轻柔吹打一次，以促进解离。也可使用配备拟胚体解离程序的自动解离仪。
    3. 向解离后的拟胚体细胞悬液中加入8 mL冰浴PBS(-)。将细胞悬液通过40 µm细胞滤网过滤。用1 mL冰浴PBS(-)清洗滤网三次。
    4. 使用库尔特计数仪对过滤后的细胞悬液进行细胞计数。
    5. 将细胞悬液在4 °C条件下以300 × g离心8分钟，弃上清。用10 mL冰浴PBS(-)重悬细胞沉淀。
    6. 将细胞悬液分装至两个离心管中，一管用于无染色对照（约105个细胞），另一管用于抗CD38染色（剩余所有细胞）。
    7. 将两管在4 °C条件下以300 × g离心8分钟。
  3. 抗CD38染色及hPGCLCs的FACS富集
    1. 用200 µL含3% (w/v) BSA和1% (w/v)叠氮化钠的冰浴PBS(-)重悬无染色对照管中的细胞沉淀。置于冰上直至进行流式细胞术。
      注意：添加叠氮化钠可减缓CD38从细胞表面的内化过程。
    2. 用含3% (w/v) BSA和1% (w/v)叠氮化钠的冰浴PBS(-)重悬用于抗CD38染色的细胞沉淀，调整至每100 µL含1 × 106个细胞。
    3. 每1 × 106个细胞加入10 µL流式级APC标记抗CD38抗体。用铝箔包裹离心管以避光。在4 °C条件下轻柔振荡孵育45分钟。
    4. 加入5 mL冰浴PBS(-)，在4 °C条件下以300 × g离心8分钟。弃上清，用5 mL冰浴PBS(-)重悬细胞沉淀。共用PBS(-)洗涤三次。
    5. 用500 μL含3% (w/v) BSA和1% (w/v)叠氮化钠的冰浴PBS(-)重悬细胞沉淀，调整细胞密度至适合FACS分析的浓度。
    6. 将CD38+细胞作为hPGCLCs进行富集，该群体通常形成明显可区分的细胞群。使用无染色对照以确保正确识别CD38+细胞。典型产量为：第10天拟胚体中hPGCLCs占所有经FACS检测的单细胞的1–5%，第13天拟胚体中则为20–40%。

结果

此处使用的微孔板为24孔格式，其中8个孔容纳微孔板片，每个微孔板片可支持形成多达1,200个类胚体（EB）。通常，由约2,400万个4i初始态多能性细胞出发，该微孔板可生成约8,000个EB，每个EB包含约3,000个细胞。在EB非黏附性培养并持续摇动的过程中，由于自发性自解，完整EB的数量逐渐减少，至实验方案第13天时约有3,000个EB存活。这些存活的EB中，大多数在其表面具有50–200个人原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）（通过EB连续切片中OCT4+细胞的免疫组织化学检测估算；见图8），总共可获得约100,000个OCT4+ hPGCLC。将EB酶解为单细胞的过程效率相对较低，导致经FACS富集的CD38+ hPGCLC产量降至9,000–47,000个细胞。在我们的实验中，六次独立但连续的实验批次平均产量为14,038 ± 5,731（均值 ± 标准误）。由于CD38阴性的EB细胞几乎不表达或完全不表达OCT4 mRNA（qPCR检测）或蛋白（免疫组织化学检测），因此所有强烈表达OCT4蛋白的EB细胞实际上等同于CD38+ hPGCLC的全部群体。

本方案的关键参数包括细胞密度。当将 2.0 × 105 个人源iPSC接种于包被有细胞外基质蛋白的6孔板（每孔生长面积为9.60 cm2）中，并加入2 mL添加Y27632的培养基（2.2.9）时，接种后24小时细胞密度可达约20–30%融合度（图1）。随后在不含Y27632的mTeSR1培养基中继续培养24小时，细胞发生聚集并形成克隆，占据约30%的生长面积（图2）。接着将细胞转入4i重编程培养基（2.3.2）中培养。在4i培养基中培养24小时后，细胞达到融合状态（图3）。再继续在4i培养基中培养24小时，细胞变得紧密堆积（图4）。准确的换液时间（每24小时±4小时）以及细胞密度对于成功形成拟胚体（EBs）和人原始生殖样细胞（hPGCLCs）至关重要。

在4i培养基中培养48小时后，将细胞解离并接种至微孔板中，该微孔板的孔径为400 µm（2.4）。尽管该商用微孔板已由制造商涂覆以形成低黏附表面，但仍建议使用洗涤剂重新涂覆（2.4.3），以降低细胞非特异性黏附的风险。使用800 µm微孔时，hPGCLC的产量降低，表明胚胎体（EB）的大小对定向分化具有重要意义。在4i培养基中接种的细胞将在24–30小时内于微孔中形成EB，可通过标准倒置相差显微镜观察（图5）。EB的圆形轮廓在培养24小时及之后变得清晰可见。不建议在EB的圆形轮廓尚未明显形成前过早收集（例如，接种后16小时），因为此时EB极为脆弱，易受机械损伤而解体。需要注意的是，大量未分化的hiPSCs未被纳入EB中，此现象属正常。这些未被纳入的细胞将在EB于低黏附表面开始摇床培养前被洗去（2.5.2）。另需注意，在本实验方案中，EB是在4i维持多能性培养基中形成，而非在hPGCLC诱导培养基中。在接触hPGCLC诱导培养基之前，先在4i培养基中预先形成结构致密的EB，对于hPGCLC在EB表面的分布至关重要。

在hPGCLC培养基中，于摇动且非黏附的培养条件下维持的EBs将保持其球形形态，不会发生聚集或融合（图6 和 图7）。摇动条件过弱会导致EBs聚集和融合，而条件过强则会破坏EBs结构。人类PGCLCs最早在hPGCLC培养基中培养5天后即可出现，表现为EBs表面表达OCT4的细胞，其数量持续增加至培养第8天（图8）。EBs进一步孵育可能导致EBs解体及hPGCLCs丢失。在hPGCLC培养基中培养5–8天后，可通过FACS将EB细胞经酶消化解离后富集CD38+的人类PGCLCs（图9）。

光镜下的细胞形态；肝细胞形成研究，肝组织分析。
图1：接种后24小时在添加Y27632的培养基中培养的人iPSC细胞。 细胞密度约为20-30%融合度。在ROCK抑制剂Y27632存在下，细胞倾向于充分伸展，呈现长而棘状的突起。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜下的细胞培养；生物学研究，显微图像显示细胞生长模式。
图 2：人iPSC细胞接种后48小时的培养情况。 细胞聚集形成克隆，占据约30%的生长区域。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜下的细胞培养；致密的细胞单层；生物学研究；显微图像。
图3：人iPSC细胞在4i重编程培养基中培养24小时。 细胞达到汇合状态。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

在光学显微镜下观察细胞培养的融合度；显微镜图像；细胞生长分析。
图 4：在 4i 重编程培养基中培养 48 小时的人源 iPSC 细胞培养物。 融合的细胞排列紧密。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

显示细胞结构呈有序几何排列的胚胎样本显微图像。
图5：在4i重编程培养基中孵育24小时后于微孔中形成的人iPSC类胚体（EBs）。 接种后24至30小时，类胚体的圆形轮廓开始可见。当在相差显微镜下确认轮廓清晰时，即可将类胚体转移至摇床培养条件。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学显微图像；小鼠胰岛用于研究糖尿病和胰岛素生成。
图 6：人iPSC类胚体在hPGCLC培养基中孵育24小时。 类胚体基本保持其球形结构。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞簇的显微镜图像；细胞生长和结构的研究。
图7：人iPSC EB在hPGCLC培养基中培养192小时。 与培养24小时时相比，EB体积增大，但仍基本保持球形，无明显聚集或融合现象。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示染色细胞聚集体的组织切片组织学显微图像，用于细胞分析。
图 8：在 hPGCLC 培养基中孵育 192 小时后，表达 OCT4 的人源 PGCLC 定位于 hiPSC 类胚体（EB）表面。 将类胚体包埋于细胞外基质蛋白中，并进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片的 OCT4 免疫组化染色（DAB 显色）。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。

显示染色与未染色样品的自发荧光与CD38对比的流式细胞术图谱。
图9：通过FACS将人源PGCLC从酶解离的EB细胞中以CD38+细胞形式富集。 在hPGCLC培养基中培养5-8天后，可通过酶消化法将EB解离，制备成单细胞悬液。hPGCLC可通过FACS以CD38+细胞形式进行富集（红点）。不表达CD38的EB细胞（蓝点）也应收集，作为阴性对照。CD38阳性与CD38阴性细胞的FACS设门应保持较宽的间距（绿点），以避免两类细胞之间的交叉污染。上图与下图分别显示未加和添加抗CD38抗体染色的FACS图谱。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

使用本方案高效生成hPGCLCs已在三株具有正常二倍体核型的人类iPSC独立克隆中得到验证10。这些iPSC克隆均来源于同一批人类新生儿真皮成纤维细胞培养物10。作者将根据研究人员的申请，在适当的材料转移协议和冷冻活体人类细胞运输安排下提供这些细胞。目前尚不清楚使用本方案或其它实验室报道的方案时，是否必须具备正常核型才能实现高效的hPGCLC生成。

最近的研究表明，使用京都大学斋藤组所描述的方案8，从人诱导多能干细胞（hiPSCs）11或胚胎干细胞（ESCs）14生成人原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）依赖于EOMESODERMIN的表达，EOMESODERMIN是一种T-box转录因子，对SOX17的诱导至关重要。SOX17似乎在人类多能干细胞的生殖系分化过程中发挥主调控转录因子的作用6。EOMESODERMIN由EOMES基因编码，在hPGCLC诱导条件下，利用CRISPR/Cas9技术敲除EOMES基因几乎完全阻断了SOX17的诱导11，其他基因的表达模式也与SOX17基因敲除细胞一致。在EOMES基因敲除细胞中，于hPGCLC诱导培养期间通过可诱导载体过表达EOMESODERMIN，可有效恢复hPGCLC的高效生成以及包括SOX17在内的生殖系相关基因的表达。相反，诱导性过表达SOX17同样能够恢复PGCLC的高效生成，但并不诱导EOMES的表达。因此，EOMESODERMIN是SOX17的关键上游诱导因子，这似乎是EOMESODERMIN在人多能干细胞诱导生成hPGCLC过程中的最重要功能。我们的方案可在hiPSCs中诱导SOX17表达10，但其是否依赖于EOMESODERMIN的诱导仍有待确定。

本方案将维持在 mTeSR1 培养基中培养的始发态多能性人诱导多能干细胞（iPSCs）在 4i 重编程培养基6中转化为 ERK 非依赖性的 naive 多能性状态，持续 96 小时；该 4i 培养基是一种改良的 naive 人干细胞培养基（NHSM）5。我们曾尝试使用相同的 hPSC 克隆，但在转入 4i 重编程培养基前，将其维持在其他市售的人 iPSC 培养基中，结果在生成 hPGCLCs 时，其产量不同程度地降低。尽管长期适应这些其他培养基是否能改善 hPGCLC 的生成仍有待后续研究确定，但该观察结果提示：在进入 4i 重编程之前，人 iPSCs 所处的始发态多能性状态的精确特性，会显著影响 4i 培养基中拟胚体（EB）的形成，以及在 hPGCLC 诱导培养基中 EB 向 hPGCLC 的分化效率。

按照我们的方案，由hiPSCs高效且高度可重复地生成hPGCLCs，部分原因在于使用了微孔板，该技术能够高效地批量产生大量大小均一的拟胚体（EB）（每批约8,000个EB，每个EB含3,000个hiPSCs）。与使用常规U型底细胞培养孔的方法相比，本方案单次实验批次所能生成的EB数量显著更多。大量大小均一且表面均匀分布hPGCLCs的EB，可能为高通量化学筛选提供独特机会，用于鉴定影响原始生殖细胞（PGC）特化过程或其生物学特性（如表观遗传重编程）的小分子激活剂或抑制剂。这类EB还可用于大量生殖系毒性物质的毒理学评估，包括环境污染物以及临床处方药物（如化疗药物）等。

使用本方案稳健且可重复地生成人原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）的关键因素包括：（i）使用在细胞外基质蛋白上以 mTeSR1 培养基维持的健康人诱导性多能干细胞（hiPSCs）；（ii）接种精确数量的细胞，并严格遵循培养基更换和传代的时间安排；（iii）选择性能良好的人重组 BMP4 试剂批次；以及（iv）在摇床培养过程中尽量减少胚胎体（EBs）的物理损伤。根据我们的经验，最佳批次的 BMP4 试剂在 100 ng/mL 浓度下效果最佳，而其他批次的 BMP4 试剂则需要 2 倍或更高的剂量。另一方面，使用最佳批次的 BMP4 时，提高 BMP4 浓度（例如，200 ng/mL）反而会降低 hPGCLCs 的产量。我们建议测试来自多个供应商的不同批次的人重组 BMP4 试剂在支持 hPGCLC 生成方面的性能，并储备足量表现最佳的批次。

本研究的人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）实验方案有一个独特之处：hPGCLC定位于胚状体（EB）最外层表面10（图8），而其他实验方案生成的hPGCLC通常位于细胞聚集体的内部6,8。胚状体往往形成多个不同的层次结构，包括表面层、外层壳、内层壳和核心区域；由于营养物质、氧气以及培养基通过扩散提供的促存活生长因子供应有限，中心核心区域常出现坏死现象20。将hPGCLC定位于EB表面，可避免因扩散受限而影响细胞与中心区域之间的物质交换，从而有利于在药理学或毒理学研究中，对hPGCLC进行直接、时间可控且剂量可控的药物或毒性物质暴露处理。

小鼠PGCLC表现出强烈的全基因组DNA去甲基化，至少部分涉及印记控制区7,19,20，而hPGCLC中的全基因组gDNA去甲基化程度似乎弱于小鼠PGCLC或PGC6,7。转录组谱型表明，hPGCLC可能比小鼠PGCLC更类似于胚胎PGC的较早阶段10。已有报道指出，在hPGCLC诱导条件下延长EB培养时间可导致gDNA去甲基化程度增加7；然而，hPGCLC在EB中或作为分离细胞进行更长时间的培养是否能够达到更高级别的生殖系分化阶段，仍有待未来研究进一步确定。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Shiomi Yawata 和 Chie Owa 在初期研究中提供的技术协助。本研究由美国国家环境卫生科学研究所/国立卫生研究院（NIEHS/NIH）资助，资助编号为 R01 ES023316 和 R21ES024861（授予 TS），以及由飞行乘务员医学研究所（FAMRI）资助（授予 JHH）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
启动态多能性hiPSC培养
MatrigelCorning354277按照生产商推荐体积（约200 μL）分装Matrigel。使用预冷离心管。于-80 °C保存
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21041-0254 °C保存
mTeSR1STEMCELL Technologies85850将5X补充剂加入基础培养基中进行重悬。重悬后的培养基可在4 °C保存
不超过4周，不影响细胞培养性能
Y27632Axon1683将5 mg Y27632（分子量320.26）溶于312.2 μL水中，配制50 mM Y27632储备液。经0.22 μm滤器除菌。分装20 μL/管×15管，-20 °C保存
CryoStor CS10STEMCELL Technologies079304 °C保存
AccutaseInnovative cell technologiesAT104-500细胞解离酶；分装40 mL/管×12管，-20 °C保存
名称公司货号备注
4i hiPSC培养
KnockOut DMEMThermo Fisher ScientificA1286101
KnockOut 血清替代物Thermo Fisher Scientific10828028分装40 mL/管×12管，-20 °C保存
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100x）Thermo Fisher Scientific10378016
MEM非必需氨基酸溶液（100x）Thermo Fisher Scientific11140050
牛胰岛素Sigma-AldrichI1882-100MG向10 mL水中加入0.1 mL冰醋酸。经0.22 μm滤器除菌。将100 mg胰岛素冻干粉溶于10 mL预冷的酸化水中，配制10 mg/mL储备液。分装650 μL/管×15管，-80 °C保存
人LIFPeproTech300-05将250 μg人LIF溶于250 μL水中。加入750 μL含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液，配制250 μg/mL人LIF储备液。该产品的比活性为>10,000 单位/μg。分装40 μL/管×25管，-80 °C保存
人FGF2R&D Systems4114-TC将1 mg人FGF2溶于5 mL PBS(-)中，配制200 μg/mL人FGF2储备液。分装100 μL/管×50管，-80 °C保存
人TGF-β1PeproTech100-21将50 μg溶于50 μL 10 mM柠檬酸（pH 3.0）中。加入150 μL含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液，配制250 μg/mL人TGF-β1储备液。分装4 μL/管×50管，-80 °C保存
4i基础培养基混合以下试剂配制4i基础培养基：
500 mL KnockOut DMEM
100 mL KnockOut血清替代物
6 mL青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100x）
6 mL MEM非必需氨基酸溶液（100x）
650 µL 10 mg/mL牛胰岛素
40 µL 250 µg/mL人LIF
20 µL 200 µg/mL人FGF2
4 µL 250 µg/mL人TGF-β1
分装40 mL/管，-80 °C保存
CHIR99021Axon1386将25 mg CHIR99021（分子量465.34）溶于1791 μL DMSO中，配制30 mM CHIR99021储备液。分装50 μL/管×35管，-20 °C保存
PD0325901Axon1408将5 mg PD0325901（分子量482.19）溶于1037 μL DMSO中，配制10 mM PD0325901储备液。分装50 μL/管×20管，-20 °C保存
BIRB796Axon1358将10 mg BIRB796（分子量527.66）溶于948 μL DMSO中，配制20 mM BIRB796储备液。分装50 μL/管×18管，-20 °C保存
SP600125Tocris1496将10 mg SP600125（分子量220.23）溶于908 μL DMSO中，配制50 mM SP600125储备液。分装50 μL/管×18管，-20 °C保存
AggreWell400STEMCELL Technologies27845微孔板
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443将5 g Pluronic F-127溶于100 mL水中，配制5%（w/v）Pluronic F127储备液。经0.22 μm滤器除菌。分装50 mL/管×2管，室温保存
名称公司货号备注
hPGCLC培养
Glasgow’s MEMThermo Fisher Scientific11710035
丙酮酸钠（100 mM）Thermo Fisher Scientific11360070
青霉素-链霉素（100x）Corning30-002-CI
hPGCLC基础培养基混合以下试剂配制hPGCLC基础培养基：
500 mL Glasgow’s MEM
75 mL KnockOut血清替代物
6 mL MEM非必需氨基酸溶液（100x）
6 mL 100 mM丙酮酸钠
6 mL青霉素-链霉素（100x）
分装40 mL/管，-20 °C保存
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148将350 μL 2-巯基乙醇（14.3 M）稀释于9.65 mL PBS(-)中，配制500 mM 2-巯基乙醇储备液。4 °C保存
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA4544将400 mg L-抗坏血酸溶于20 mL水中，配制20 mg/mL L-抗坏血酸储备液。经0.22 μm滤器除菌。分装500 μL/管×40管，-20 °C保存
重组人BMP4R&D Systems314-BP将1 mg重组人BMP4溶于10 mL 4 mM盐酸水溶液中，配制100 μg/mL重组人BMP4储备液。分装250 μL/管×40管，-80 °C保存
人SCFPeproTech300-07将250 μg人SCF溶于500 μL含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液中，配制500 μg/mL人SCF储备液。分装35 μL/管×14管，-80 °C保存
人EGFPeproTechAF-100-15将1 mg人EGF溶于1 mL含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液中，配制1 mg/mL人EGF储备液。分装100 μL/管×10管。将100 μL 1 mg/mL人EGF储备液与300 μL含0.1%牛血清白蛋白的PBS(-)溶液混合，配制250 μg/mL人EGF储备液。分装20 μL/管×20管。-80 °C保存
细胞筛Corning352340孔径 = 40 μm
50 mL聚丙烯圆锥形离心管Corning352070
低吸附培养板Corning3471
Vari-Mix平台摇床ThermofisherM79735Q
名称公司货号备注
免疫组织化学染色
BLOXALL封闭液VECTORSP-6000
正常马血清
ImmPRESS抗山羊IgG试剂		VECTORMP-7405
OCT-3/4抗体Santa CruzSC-8629
ImmPACT DABVECTORSK-4105
PermountThermofisherSP15-100封片剂
名称公司货号备注
分离hPGCLC
类胚体解离试剂盒Miltenyi Biotec130-096-348
APC标记抗CD38抗体abcamab134399

参考文献

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BMP4 FACS CD38 OCT4 iPSC

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