TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

摘要

我们描述了一种串联染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）的逐步实验方案，该方法可用于分析特定细胞类型的全基因组组蛋白修饰。

摘要

表观遗传调控在基因表达中发挥着核心作用。自20世纪60年代发现组蛋白修饰以来，其生理与病理功能已得到广泛研究。事实上，通过特异性组蛋白修饰抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）并结合下一代深度测序技术的出现，彻底改变了我们对全基因组范围内表观遗传调控的认识。然而，组织通常由多种细胞类型组成，其复杂的混合状态为研究特定细胞类型的表观基因组带来了分析上的挑战。为在全基因组范围内解析特定细胞类型的染色质状态，我们近期开发了串联染色质免疫沉淀测序技术（tChIP-Seq），该技术基于从目标细胞类型中利用标记的核心组蛋白蛋白选择性纯化染色质，随后进行ChIP-Seq分析。本实验方案旨在介绍tChIP-Seq的最佳操作实践。该技术为在多种组蛋白修饰及模式生物中开展组织特异性的表观基因组研究提供了灵活有效的工具。

引言

动物的组织由多种不同类型的细胞组成。每种细胞中的基因调控决定了其细胞类型。染色质修饰——包括DNA甲基化和组蛋白修饰——是基因表达具有细胞类型特异性的基础。因此，人们一直希望测量每种细胞类型中的表观遗传调控，但这一直是一个技术难题。

为了研究特定细胞类型的表观遗传学，近期开发了串联染色质免疫沉淀测序技术（tChIP-Seq）(图1)¹。在tChIP中，表位标签标记的核心组蛋白H2B在细胞类型特异性启动子驱动下表达。该特性使得可以从目标细胞中分离染色质，即使起始材料来源于多种细胞类型的混合物。在通过修饰组蛋白标记进行染色质纯化，并对分离的DNA进行下一代深度测序（即ChIP-Seq）后，我们能够以全基因组范围监测目标细胞类型的表观遗传状态。

利用该技术，我们近期研究了神经元特异性的组蛋白H3在赖氨酸4位点的三甲基化（H3K4me3）修饰。在该研究中，我们构建了一种基因敲入小鼠模型，通过Cre介导的重组，可在其细胞中表达C端带有FLAG标签的H2B蛋白（Rosa26^{CAG floxed-pA H2B-FLAG}）。通过与在CamK2a启动子驱动下表达Cre-内质网（ER）基因的小鼠杂交，所获得的小鼠品系在注射他莫昔....

方案

本文所述所有方法均已获得理化学研究所安全委员会（H27-EP071）的批准，并遵循相关指南和法规进行。

1. 组织解剖

1. 使用精细的弹簧剪将感兴趣的组织剪成小块（约 <3 mm²）。
   注意：较大的组织碎片冻结所需时间更长，而过小的组织块会携带更多的缓冲液体积，这两种情况均可能影响实验结果。
2. 将剪好的组织碎片加入装有液氮的洁净容器中，并收集至预先装有液氮的 2 mL 离心管中（每管 1 块）。
   注意：建议在该步骤中使用具有亲水表面的离心管。
3. 将离心管敞口置于 -80 °C 环境中超过 > 5 分钟，以挥发残留的液氮。
   注意：关闭管盖后，组织碎片可在 -80 °C 条件下保存一个月，以备后续使用。

2. 细胞固定

注意：此步骤我们使用了一款便捷的冷冻研磨仪。也可使用其他替代设备。

1. 将含有组织样本的2 mL低吸附蛋白管置于用液氮预冷的金属冰架上。
2. 将一个金属弹丸放入1.5 mL离心管中，并用液氮预冷，然后将其放置在金属冰架上。
3. 打开2 mL离心管，将预冷的金属弹丸放入管内，盖紧管盖，将2 mL离心管装入便携式低温研磨仪的管架中，并立即将组装好的管架浸入液氮....

结果

本文描述了组织解剖、固定、细胞裂解、染色质串联纯化以及用于下一代测序仪的DNA文库制备方法。在操作过程中，可在多个步骤中检测DNA的质量，这是成功测序的关键（图2）。由于单个核小体通常被约147 bp的DNA包裹⁴，因此剪切后的DNA长度不应短于该尺寸。超声处理后立即提取DNA，并在微流控电泳仪上进行检测（图2A）。尽管我们已尽力优化片段大小范围，但仍有一部分DNA（约2 kbp）未能充分剪切。在此步骤中，100–500 bp范围内的DNA片段应占总DNA群体的50%或以上。使用抗FLAG抗体进行亲和纯化（图2B），随后再用抗H3K4me3抗体进行纯化（图2D）后，再次利用微流控电泳仪检测所分离DNA的质量，并估算100–500 bp DNA片段的含量。尽管在此阶段常观察到DNA片段偏向于.......

讨论

本实验方案已针对小鼠脑内神经元进行优化，在该模型中，通过注射他莫昔芬诱导表达带FLAG标签的H2B。H2B表达所用的启动子、起始组织材料及其用量是影响tChIP-Seq成功的关键参数。因此，针对每种目标细胞类型，均需对这些因素进行优化。

本方案所用步骤中的一个关键环节是DNA片段化，以获得长度为100–500 bp的染色质⁵。通常情况下，超声破碎步骤的标准化较为困难，因为它高度依赖于多种因素，包括固定条件、所用组织、超声设备及其参数设置等。因此，针对不同实验需通过反复试验对该DNA片段化步骤进行优化。除了超声破碎外，使用微球菌核酸酶处理也是一种可选方案，可用于分离单核小体大小的DNA片段，这在传统的ChIP方法中已有应用⁶。尽管理想的DNA片段应具有均一的尺寸分布，但片段化的DNA仍可能出现多个不同大小的片段群体，如图2A所示。如上所述，采用SPRI磁珠进行两次尺寸筛选有助于去除较长的DNA片段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白质 LoBind 管，2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	用于细胞裂解
蛋白质 LoBind 管，1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	用于染色质免疫沉淀（ChIP）和文库制备
DNA LoBind 管，1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	用于染色质免疫沉淀（ChIP）和文库制备
8联排 PCR 管	BIO-BIK	3247-00	用于染色质免疫沉淀（ChIP）和文库制备
SK 磨粉机	TOKKEN	SK-200	便携式低温研磨仪，用于制备细胞粉末以进行固定
金属弹丸	TOKKEN	SK-100-DLC10	SK 磨粉机的配件
2 mL 不锈钢管	TOKKEN	TK-AM5-SUS	细胞裂解的可选方案
2 mL 不锈钢管架	TOKKEN	SK-100-TL	细胞裂解的可选方案
16% 甲醛（w/v），无甲醇	Pierce	28906	用于固定细胞。使用前配制成 1% 溶液。
甘氨酸	Nacalai Tesque	17109-35	配制 2.5 M 储存液
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	用于洗涤裂解物和纯化 DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	用于裂解缓冲液 1。配制 1 M，pH 7.5 储存液。
5 M NaCl，分子生物学级	Nacalai Tesque	06900-14	用于裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液
0.5 M EDTA，分子生物学级	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	用于裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液
甘油	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	用于裂解缓冲液 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	用于裂解缓冲液 1
Triton X-100，分子生物学级	Nacalai Tesque	12967-32	用于裂解缓冲液 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	用于裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液。配制 1 M，pH 8.0 储存液。
0.1 M EGTA，pH 中性	Nacalai Tesque	08947-35	用于裂解缓冲液 2
蛋白酶抑制剂混合物（100x）	Nacalai Tesque	25955-24	用于阻止蛋白质降解
RIPA 缓冲液	Thermo Fisher Scientific	89900	用于细胞裂解和洗涤
milliTUBE 1 mL AFA 纤维管	Covaris	520130	超声破碎管。聚焦式超声破碎仪的配件
聚焦式超声破碎仪	Covaris	S220 或 E220	将 DNA 消化至适合 ChIP-Seq 的大小
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	用于 ChIP 洗脱缓冲液
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	用于从裂解物中纯化 DNA
蛋白酶 K，重组型，PCR 级	Sigma-Aldrich	3115887001	用于从裂解物中纯化 DNA
乙醇	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	配制 70% 溶液
小鼠来源的单克隆抗 FLAG M2 抗体	Sigma-Aldrich	F1804	用于纯化目标细胞中表达的染色质
Dynabead M-280 羊抗小鼠 IgG 磁珠	Thermo Fisher Scientific	11201D	可用于抗 FLAG 免疫沉淀和抗 H3K4me3 免疫沉淀
抗三甲基化组蛋白 H3（K4）小鼠单克隆抗体	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	任何适用于 ChIP 分析的其他抗体亦可使用
10x 封闭试剂	Sigma-Aldrich	11096176001	亲和纯化过程中的封闭剂
Denhardt’s 溶液	Nacalai Tesque	10727-74	亲和纯化过程中的封闭剂
糖原（5 mg/ml）	Thermo Fisher Scientific	AM9510	用于从裂解物中纯化 DNA
Qubit 2.0 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q32866	用于定量分离的 DNA
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q32851	用于定量分离的 DNA
0.5 mL 管	Axygen	10011-830	用于 Qubit 定量
苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）	Nacalai Tesque	25970-56	用于从裂解物中纯化 DNA
AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63881	用于文库制备的 SPRI 磁珠
金属冰盒	Funakoshi	IR-1	用于保持细胞裂解物处于冷冻状态
样品冷却器	New England Biolabs	T7771S	有助于在最小损伤下固定细胞
2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2939BA	用于检测分离 DNA 片段的质量。也可使用其他片段分析仪。
Bioanalyzer 2100 专家软件	Agilent Technologies	G2946CA	随生物分析仪提供
高灵敏度 DNA 检测试剂盒	Agilent Technologies	5067-4626	用于检测分离 DNA 片段的质量
KAPA LTP 文库制备试剂盒	Roche	07961898001	包含 10x KAPA 末端修复缓冲液、KAPA 末端修复酶混合物、KAPA A-尾化缓冲液、KAPA A-尾化酶、KAPA 连接缓冲液、KAPA DNA 连接酶和 PEG/NaCl 溶液
NEXTflex DNA 条形码	BIOO Scientific	NOVA-514101	文库制备用接头。包含 DNA 条形码接头和引物混合物。
KAPA 实时文库扩增试剂盒	Roche	07959028001	包含 2x KAPA HiFi HS 实时 PCR 预混液、PCR 引物混合物和荧光标准品
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	用于文库制备。此外，该酶可能也是 KAPA 实时文库扩增试剂盒所需
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl，pH 8.5，用于 DNA 洗脱
386 孔 qPCR 板	Thermo Fisher Scientific	4309849	用于实时 PCR
QuantStudio 7 Flex 实时 PCR 系统	Thermo Fisher Scientific	4485701	用于定量 DNA
MicroAmp 光学密封膜	Thermo Fisher Scientific	4311971	用于实时 PCR
MicroAmp 透明密封膜	Thermo Fisher Scientific	4306311	用于板密封
末端修复主混合液			混合 1.4 µL 10x KAPA 末端修复缓冲液、1 µL KAPA 末端修复酶混合物和 1.6 µL H2O
A-尾化主混合液			混合 1 µL KAPA A-尾化缓冲液、0.6 µL KAPA A-尾化酶和 8.4 µL H2O
连接缓冲液混合液			混合 2 µL KAPA 连接缓冲液和 6 µL H2O
实时 PCR 主混合液			混合 5 µL 2x KAPA HiFi HS 实时 PCR 预混液、0.35 µL PCR 引物混合物（正向引物 AATGATACGGCGACCACCGAG 和反向引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 各 10 µM）以及 3.15 µL H2O
PCR 主混合液			混合 10 µL 2x KAPA HiFi Ready Mix、0.9 µL PCR 引物混合物和 0.6 µL H2O
整合基因组浏览器（Integrative Genomics Viewer）	Broad Institute	IGV_2.3.88	用于可视化测序数据的基因组浏览器
DNA 寡核苷酸：5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		用于扩增 GAPDH 启动子区域的引物
DNA 寡核苷酸：5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		用于扩增 GAPDH 启动子区域的引物
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	用于定量对应于 GAPDH 启动子区域的 DNA
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	用于定量对应于 GAPDH 启动子区域的 DNA