tchip-seq: 细胞专用表观体分析

Summary

我们描述了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq) 的分步协议, 该协议可分析细胞类型特异性基因组蛋白的全组蛋白修饰。

Abstract

表观遗传调控在基因表达中起着核心作用。自20世纪60年代发现组蛋白修饰以来, 其生理和病理功能得到了广泛的研究。事实上, 下一代深度测序和染色质免疫沉淀 (chip) 通过特异性组蛋白修饰抗体的出现, 已经彻底改变了我们对整个基因组表观遗传调控的看法。相反, 组织通常由不同的细胞类型组成, 其复杂的混合物对研究特定细胞类型的表观基因组提出了分析挑战。为了以全基因组的方式解决细胞类型特异性染色质状态, 我们最近开发了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq), 它是基于从细胞标记的核心组蛋白纯化染色质的选择类型的兴趣, 其次是 chip-seq。该协议的目标是引入 tchip-seq 的最佳实践。该技术为组织特异性表观基因组研究提供了一种通用工具, 用于不同组蛋白修饰和模型生物的研究。

Introduction

动物的组织由不同的细胞类型组成。每个细胞的基因调控定义了细胞类型。染色质修饰-dna 甲基化和组蛋白修饰-是基因表达的细胞类型特异性的基础。因此, 每种细胞类型的表观遗传调控的测量都是人们所希望的, 但这一直是一个技术挑战。

为了研究特定细胞类型的表观遗传学, 最近开发了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq)⁽ 图 1)1。在 tchip 中, 表位标记的核心组蛋白 h2b 是从细胞类型特异性启动子中表达的。此功能允许从感兴趣的细胞中分离色谱素, 尽管这种材料从各种细胞类型的混合物开始。在 chip-seq--通过修饰组蛋白标记和下一代分离 dna 深度测序进行纯化之后, 我们可以以全基因组的方式监测目标细胞类型的表观遗传状态。

利用这项技术, 我们最近研究了在赖氨酸 4 (h3k4me3) 标记组蛋白 h3 蛋白的神经元特异性三甲基化。在这项研究中, 我们开发了一个敲门砖, 其中 c 端结标记的 h2b 蛋白表达后, cre-acid 介导重组 (^{rosa26cag 浮法 h2b-flag})。在 camk2a 启动子的控制下, 利用具有 cre-内质网 (er) 基因的小鼠杂交, 得到的小鼠线在他莫....

Protocol

此处描述的所有方法均已获得 riken (h27-ep071) 安全部门的批准, 并遵循相关的准则和法规。

1. 组织解剖

1. 使用精细的弹簧剪刀将感兴趣的组织分解成小块 (约 lt;3 毫米²)。
   注意: 较大的组织碎片需要更长的时间来冻结, 较小的碎片将携带较大体积的缓冲液, 这两者都可能影响结果。
2. 将解剖的组织碎片加入一个充满液氮的清洁容器中, 收集到2毫升充满液氮的管 (每管1片) 中。
   注: 此步骤建议使用具有亲水表面的管材。
3. 将管置于-80°c > 5分钟, 盖打开以蒸发剩余的液氮。
   注意: 关闭瓶盖后, 组织碎片可在-80°c 下储存一个月后再使用。

2. 细胞固定

注意: 我们在此步骤中使用了方便的低温磨床。可以使用另一种设备。

1. 将含有组织样本的 2个 ml 蛋白低结合管放在用液氮冷却的金属冰架上。
2. 将金属子弹放入 1.5 ml 管中, 用液氮冷却。把它放在金属冰架上。
3. 打开 2 ml 管, 将预冷的金属子弹放入管中。合上瓶盖, 将 2个 ml 管放入方便的低温磨床的管座上, 并立即将组装好的管架浸入液氮中1分钟。
4. 将冷冻管支架插入方便的低温磨床的外盒盒, 并用力摇....

Results

在这里, 我们描述了组织解剖, 固定, 细胞裂解, 染色质的串联纯化, 以及 dna 文库准备下一代测序。在过程中, 可以在多个步骤中测试 dna 的质量, 这是成功测序的关键 (图 2)。由于单个核糖体通常被 147 bp ^{dna 4}包围, 剪切的 dna 不应短于该大小。超声检查后, 立即分离 dna 并在微流式电泳机上运行 (图 2a)。尽管我们尽了最大努力优化大小范围, 但我们仍然有大量的 dna (约 2 kbp) 没有被剪掉。在这一步中, 从 100-500 bp 到 100 bp 的 dna 比例应该是人口的50% 或更多。在抗 flag 抗体 (图 2b) 和抗 h3k4me3 抗体 (图 2d) 进行亲和力纯化后, 使用微流控电泳机再次检测分离 dna 的质量, dna .......

Discussion

我们的协议针对小鼠大脑的神经元进行了优化, 其中 FLAG-tagged 的 h2b 的表达是由他莫西芬注射液诱导的。用于 h2b 表达的促进剂、起始组织材料和组织量是 tchip-seq 成功的关键参数。因此, 应考虑对每个细胞类型感兴趣的因素进行优化。

在本协议中使用的程序中, 一个关键的步骤是 dna 剪切, 以实现 200-500 bp⁵的染色质长度。一般来说, 超声检查步骤的标准化具有挑战性, 因为它在很大程度上取决于多种因素;固定条件、使用的组织、用于超超声的设备以及设备设置等。因此, 单个实验需要对这一 dna 剪切步骤进行试错优化。微核核酸酶治疗不是超超声, 而是分离单个核糖体大小 dna 的一种选择, 就像天真的 chip 方法⁶中使用的那样。尽管 dna 的同质大小分布是理想的, 但剪切的 dna 可能显示多个群体, 如图 2 a 所示。如上文所述, spri 磁珠的双重尺寸选择有助于去除较长尺寸的 dna .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind 蛋白吸附管，2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	用于细胞裂解
Protein LoBind 管，1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	用于 ChIP 和文库制备
DNA LoBind LoBind 管，1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	用于 ChIP 和文库制备
8 条 PCR 管	BIO-BIK	3247-00	用于 ChIP 和文库制备
SK Mill	TOKKEN	SK-200	手持式低温研磨机，用于制造用于固定的细胞粉末
金属子弹	TOKKEN	SK-100-DLC10	SK Mill 附件
2 mL 不锈钢管	TOKKEN	TK-AM5-SUS	细胞选件裂解
2 mL 不锈钢管架	TOKKEN	SK-100-TL	裂解选项
16% 甲醛 （w/v），不含甲醇	Pierce	28906	用于固定细胞。使用前准备 1% 溶液。
甘氨酸	Nacalai Tesque	17109-35	制备 2.5 M 储备
D-PBS （-）（1x）	Nacalai Tesque	14249-24	用于洗涤裂解物和纯化的 DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	用于裂解缓冲液 1.准备 1 M、pH 7.5 的原液。
5 M NaCl，分子生物学级	Nacalai Tesque	06900-14	用于裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液
0.5 M EDTA，分子生物学级	Wako Pure Chemical Industries， Ltd.	311-90075	用于裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液
甘油	Wako Pure Chemical Industries， Ltd.	072-04945	用于裂解缓冲液 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	用于裂解缓冲液 1
Triton X-100，分子生物学级	Nacalai Tesque	12967-32	用于裂解缓冲液 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	用于裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液。制备 1 M，pH 值为 8.0 的原液。
0.1 M EGTA pH 中性	Nacalai Tesque	08947-35	用于裂解缓冲液 2
蛋白酶抑制剂混合物 （100x）	Nacalai Tesque	25955-24	用于阻止蛋白质
RIPA 缓冲液	Thermo Fisher Scientific	89900	用于细胞裂解和洗涤
milliTUBE 1 mL AFA 纤维	Covaris	520130	Sonicator 管。聚焦超声仪的附件
聚焦超声仪	Covaris	S220 或 E220	DNA 消化成足够的大小，用于 ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	用于 ChIP 洗脱缓冲液
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14
PCR 级	Sigma-Aldrich		从裂解物
乙醇	Wako Pure Chemical Industries， Ltd.	054-07225	制备 70% 溶液
中产生的抗 FLAG M2 单克隆抗体	Sigma-Aldrich	F1804	纯化在目标细胞中表达的染色质
Dynabead M-280 绵羊抗小鼠 IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	可用于抗 FLAG IP 和抗 H3K4me3 IP
抗三甲基组蛋白 H3 （K4） 抗小鼠单克隆抗体	Wako Pure Chemical Industries， Ltd.	301-34811	任何其他适用于 ChIP 分析的抗体都可以使用
10x 封闭试剂	Sigma-Aldrich	11096176001	用于亲和纯化过程中的封闭
Denhardt's 溶液	Nacalai Tesque	10727-74	用于亲和纯化过程中的封闭
糖原 （5 mg/ml）	Thermo Fisher Scientific	AM9510	从裂解物
Qubit 2.0 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q32866	用于定量分离的 DNA
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q32851	用于分离的 DNA 的定量
0.5 mL 管	Axygen	10011-830	用于 Qubit 定量
苯酚/氯仿/异戊醇 （25：24：1）	Nacalai Tesque	25970-56	从裂解物中纯化
DNA AMPure XP 珠子	Beckman Coulter	A63881	用于文库制备的 SPRI 磁珠
金属冰架	Funakoshi	IR-1	保持细胞裂解物冷冻
样品冷却器	New England Biolabs	T7771S	帮助修复损伤最小的细胞
2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2939BA	检查分离的 DNA 片段的质量。可以使用另一个片段分析器。
生物分析仪 2100 Expert 软件	Agilent Technologies	G2946CA	随生物分析仪提供
高灵敏度 DNA 试剂盒	Agilent Technologies	5067-4626	为了检查分离的 DNA 片段的质量，
KAPA LTP 文库制备试剂盒	Roche	07961898001	随附 10x KAPA 末端修复缓冲液、KAPA 末端修复酶混合物、KAPA A-Tailing 缓冲液、KAPA A-Tailing 酶、KAPA 连接缓冲液、KAPA DNA 连接酶和 PEG/NaCl 溶液
NEXTflex DNA 条形码	BIOO Scientific	NOVA-514101	适配器用于文库制备。随附 DNA 条形码接头和引物混合物。
KAPA 实时文库扩增试剂盒	Roche	07959028001	随附 2x KAPA HiFi HS 实时 PCR 预混液、PCR 引物混合物和荧光标准品
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	用于文库制备。此外，KAPA 实时文库扩增试剂盒缓冲液
EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl，pH 8.5 可能需要这种酶，用于洗脱 DNA
386 孔 qPCR 板	Thermo Fisher Scientific	4309849	用于实时荧光定量 PCR
QuantStudio 7 Flex 实时荧光定量 PCR 系统	Thermo Fisher Scientific	4485701	定量 DNA
MicroAmp 光学胶膜	Thermo Fisher Scientific	4311971	用于实时荧光定量 PCR
MicroAmp 透明封口膜	Thermo Fisher Scientific	4306311	用于板密封
末端修复预混液			1.4 µL of 10x KAPA 末端修复缓冲液，1 µL 的 KAPA 末端修复酶混合物，以及 1.6 µL of H2O
A-taling 预混液			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing 缓冲液，0.6 &微量;L 的 KAPA A-Tailing 酶，以及 8.4 µL of H2O
连接缓冲液混合物			2 µ 混合;L 的 KAPA 连接缓冲液和 6 &微量;L of H2O
实时 PCR 预混液			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS 实时 PCR 预混液，0.35 &微量;L PCR 引物混合物（10 &微量;M 正向引物 AATGATACGGCGACCACCGAG 和反向引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG），和 3.15 &微量;L of H2O
PCR 预混液			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix，0.9 µL PCR 引物混合物，以及 0.6 &微量;L of H2O
综合基因组学查看器	Broad Institute	IGV_2.3.88	可视化测序数据的基因组浏览器
DNA 橄榄核苷酸：5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		扩增 GAPDH DNA 橄榄核苷酸启动子区域的引物
：5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		扩增 GAPDH 启动子区域的引物
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	定量与 GADPH 启动子区域相对应的 DNA
热循环仪 Dice	Takara	TP870	定量与 GADPH 启动子区域相对应的 DNA