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方法文章

基于三维定量相位成像与机器学习的无标记淋巴细胞亚型识别

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DOI：

10.3791/58305

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2018年11月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Cambridge, 2Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics, Stanford University

本文内容

摘要

我们描述了一种利用定量相位成像和机器学习算法进行无标记淋巴细胞亚型鉴定的实验方案。通过对淋巴细胞的三维折射率断层图像进行测量，可获得单个细胞的三维形态学和生物化学信息，随后利用机器学习算法分析这些信息以实现细胞类型的鉴定。

摘要

本文介绍了一种利用定量相位成像和机器学习技术对淋巴细胞亚型进行无标记识别的实验方案。淋巴细胞亚型的识别对于免疫学研究以及多种疾病的诊断与治疗具有重要意义。目前，对淋巴细胞类型进行分类的标准方法依赖于通过抗原-抗体反应标记特定膜蛋白。然而，这些标记技术存在改变细胞功能的潜在风险。本文所述方案通过利用三维定量相位成像所测得的内源性光学对比信息以及机器学习算法，克服了上述挑战。对淋巴细胞三维折射率（RI）断层图像的测量可提供关于单个细胞三维形态和表型的定量信息。从所测得的三维RI断层图像中提取的生物物理参数随后通过机器学习算法进行定量分析，从而实现对淋巴细胞类型的单细胞水平无标记识别。我们测量了B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的三维RI断层图像，并以超过80%的准确率实现了其细胞类型的识别。在本方案中，我们详细描述了淋巴细胞分离、三维定量相位成像以及用于识别淋巴细胞类型的机器学习分析的具体步骤。

引言

淋巴细胞可分为多种亚型，包括B细胞、辅助性（CD4+）T细胞、细胞毒性（CD8+）T细胞以及调节性T细胞。每种淋巴细胞在适应性免疫系统中具有不同的功能；例如，B淋巴细胞产生抗体，而T淋巴细胞则识别特定抗原、清除异常细胞并调节B淋巴细胞的活动。淋巴细胞的功能与调控与多种疾病密切相关，且受到严格调控，这些疾病包括癌症1、自身免疫性疾病2和病毒感染3。因此，识别不同类型的淋巴细胞对于理解其在上述疾病中的病理生理作用以及临床免疫治疗具有重要意义。

目前，淋巴细胞类型的分类方法主要依赖于通过靶向特定表面膜蛋白或表面标志物的抗原-抗体反应4。靶向表面标志物是一种确定淋巴细胞类型的精确且准确的方法。然而，该方法需要昂贵的试剂和耗时的操作步骤。此外，还存在膜蛋白结构被修饰以及细胞功能发生改变的风险。

为克服这些挑战，本文所述方案引入了一种基于三维定量相位成像（QPI）与机器学习的无标记淋巴细胞类型鉴定方法5。该方法能够利用从单个淋巴细胞的无标记三维成像中提取的形态学信息，在单细胞水平上实现淋巴细胞类型的分类。与传统的荧光显微镜技术不同，QPI利用折射率（RI）分布（活细胞和组织的固有光学特性）作为光学对比机制6,7。单个淋巴细胞的RI断层图像反映了特定淋巴细胞亚型的表型信息。在此基础上，为系统性地利用单个淋巴细胞的三维RI断层图像，采用了有监督的机器学习算法。

利用多种定量相位成像（QPI）技术，细胞的三维折射率断层图已被广泛应用于细胞病理生理学研究，因其能够提供无需标记的定量成像能力8,9,10,11,12,13。此外，单个细胞的三维折射率分布可提供有关细胞的形态学、生物化学和生物力学信息。此前，三维折射率断层成像已应用于血液学14,15,16,17、感染性疾病18,19,20、免疫学21、细胞生物学22,23、炎症24、癌症25、神经科学26,27、发育生物学28、毒理学29以及微生物学12,30,31,32等领域。

尽管三维折射率断层图像可提供细胞的详细形态学和生物化学信息，但仅通过成像三维折射率断层图像难以实现淋巴细胞亚型的分类5。为了系统性且定量地利用所测得的三维折射率断层图像进行细胞类型分类，我们采用了一种机器学习算法。近年来，已有若干研究报道利用多种机器学习算法分析细胞的定量相位图像33，包括微生物检测34、细菌属的分类35,36、炭疽芽孢的快速无标记检测37、精子细胞的自动化分析38、癌细胞的分析39,40，以及巨噬细胞活化的检测41。

本方案提供了利用三维定量相位成像（3D QPI）结合机器学习，在单细胞水平上无标记识别淋巴细胞类型的详细步骤。包括：1）从小鼠血液中分离淋巴细胞，2）通过流式细胞术对淋巴细胞进行分选，3）三维QPI成像，4）从三维折射率断层图中提取定量特征，以及5）采用有监督学习方法识别淋巴细胞类型。

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方案

动物饲养和实验操作均在韩国科学技术院（KAIST）机构动物护理与使用委员会（批准号：KA2010-21、KA2014-01 和 KA2015-03）的批准下进行。本研究中的所有实验均依照批准的指南实施。

1. 小鼠血液中淋巴细胞的分离

  1. 通过 CO2  吸入法处死 C57BL/6J 小鼠后，将 26 号针头插入小鼠心脏，收集 0.3 mL 血液。立即将血液直接注入含有 100 U/mL 肝素溶液的离心管中，该溶液用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
    注意：也可从脾脏中分离淋巴细胞。
  2. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
  3. 向离心管中加入 0.5 mL 氯化铵-氯化钾裂解缓冲液，并轻轻颠倒数次以混匀溶液。
  4. 在室温（RT）下孵育 5 分钟。
  5. 加入 4.5 mL PBS 洗涤细胞，然后在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，重复洗涤两次。
  6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 含 10% 胎牛血清（FBS）的新鲜 RPMI-1640 培养基中。
  7. 向离心管中加入 0.1 µg CD16/32（2.4G2）抗体进行封闭。
  8. 将离心管置于冰上保存。

2. 淋巴细胞亚群的流式细胞术分析与分选

注意：根据细胞类型分选淋巴细胞对于建立真实值（ground-truth）至关重要即， 正确的细胞类型标签，用于在监督学习中训练和测试细胞类型分类器。流式细胞术作为一种金标准方法，用于鉴定和分离淋巴细胞42.

  1. 在100 µL新鲜RPMI-1640培养基（含10% FBS）中配制表面标志物染色抗体混合液，其中包含0.1 µg的CD3e（17A2）、CD8a（53-6.7）、CD19（1D3）、CD45R（B220，RA3-6B2）和NK1.1（PK136）抗体，以及0.25 µg的CD4（GK1.5）抗体，用于标记B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T淋巴细胞。
  2. 将100 µL抗体混合液加入细胞悬液（步骤1.8中获得）。
  3. 冰上孵育25分钟。
  4. 加入5 mL PBS，于4 °C下以400 × g离心5分钟，洗涤细胞两次。
  5. 将细胞沉淀重悬于5 mL含10% FBS的新鲜RPMI-1640培养基中，并加入2.5 µg DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。
  6. 利用上述荧光标记物的信号水平，通过流式细胞术分别收集各亚群淋巴细胞。同时利用DAPI信号排除死细胞。
    注意：基于流式细胞术的细胞分选详细方案此前已有报道42。

3. 三维定量相位成像

  1. 在整个成像过程中将分选后的淋巴细胞置于冰上，并在淋巴细胞从小鼠分离后5小时内完成所有操作，以避免细胞损伤和生化改变。
  2. 选择一种已分选的细胞类型（B细胞、CD4+ T细胞或CD8+ T细胞），并将步骤2.6中获得的样本稀释至180个细胞/µL 使用RPMI培养基以获得最佳成像条件（即， 每个视野一个细胞
  3. 将120 μL稀释后的样品通过缓慢注射加入成像室。仔细检查成像室中是否存在气泡。若发现气泡，需小心去除，因为气泡会影响测量结果的质量。
  4. 使用商用三维定量相位显微镜（或称全息层析成像）及其成像软件获取三维折射率断层图像。
    注意：有关实验装置的详细信息可参见原始论文5.
    1. 在显微镜物镜上滴加一滴蒸馏水。
    2. 将装有样品的成像室置于显微镜的移动载物台上，调整其位置，使样品与物镜对齐。
    3. 通过单击调整物镜和聚光镜的轴向位置 聚焦 和 表面分别在 "校准" 标签的 "显微镜" 成像软件的视角。
    4. 通过单击对准物镜和聚光镜 自动模式. 或者，使用 扫描模式 手动调节镜头，使照明图案位于视场中心区域。
    5. 返回到 正常模式 调整移动台以在视野中定位一个细胞。
    6. 通过调节物镜的轴向位置来找到焦平面。完美聚焦会使屏幕上显示的样品边界几乎不可见。
    7. 调整载物台，找到一个无细胞的位置。
    8. 点击 校准 通过不同照明角度测量多个二维全息图。
    9. 调整载物台，使细胞位于视野中央。
    10. 转移到 "采集" 标签并单击 3D 快照 以与步骤 3.4.8 相同的照明角度测量细胞的全息图。
    11. 当获取的数据呈现在 "数据管理" 面板中，右键单击已获取的数据，然后单击 过程 利用衍射层析成像算法，从步骤 3.4.8 和 3.4.10 中测得的全息图重建三维折射率层析图9,10 在成像软件中实现。
    12. 重复步骤 3.4.5–3.4.11，以测量超过 100 个细胞，确保机器学习的统计效力。
    13. 所有经过步骤 3.4.11 处理的图像均可进行可视化。在“数据管理”面板中，右键单击数据并点击“打开”以可视化数据。在“数据管理器”面板中点击“RI 断层图像”。在“预设”选项卡中，点击“加载”，然后双击“lymphocyte.xml”——这是成像软件提供的预定义传递函数，用于根据三维折射率（RI）分布可视化断层图像。 
  5. 重复步骤 3.2–3.4，以测量所有淋巴细胞亚型的三维折射率断层图像。

4. 从三维折射率断层图像中定量提取形态学和生化特征

  1. 将上述测得的所有断层扫描数据放入同一个文件夹中，并按细胞类型在该文件夹的子文件夹中进行分类。将每个断层扫描图像预处理为单个 .mat 文件。
  2. 打开 补充文件1 - 特征提取 （为图像处理软件编写的程序）。
  3. 编辑第14行，指定步骤4.1中准备好的断层扫描图像文件夹。
  4. 编辑第15行，指定用于保存提取特征数据的文件夹。
  5. 可选：编辑第17行，以调整特征提取的折射率（RI）阈值参数。默认设置为从1.340至1.378，以0.002为增量，共20个RI阈值，如前所述5。
  6. 运行代码。对于数据集中的每个断层扫描图像，代码将针对每个RI阈值计算五个特征：表面积（SA）、细胞体积（CV）、球形度（SI）、蛋白质密度（PD）和干质量（DM）。特征提取的详细算法在其他文献中有描述5。
  7. 为监控特征提取过程，在代码运行期间查看屏幕显示的基于RI阈值的细胞分割图像。
  8. 检查已提取的特征数据，每个断层扫描图像对应一个.mat文件，保存在步骤4.4中指定的文件夹中。

5. 监督学习与识别

  1. 将步骤 4.8 中获得的特征数据随机分为训练集（70%）和测试集（30%），并分别存放在不同的文件夹中。
  2. 打开补充文件 2 - 训练 （为图像处理软件编写的程序）。
  3. 编辑第 14 行，指定在步骤 5.1 中准备的训练集。
  4. 编辑第 16 行，指定用于保存训练后分类器的文件夹。
  5. 编辑第 17 行，为分类器设置文件名。
  6. 可选：编辑第 19 行以选择用于训练的特征。默认选项如前所述5，用于获得下文的代表性结果。
  7. 运行代码。代码使用训练集的选定特征，通过 k-最近邻算法（k-NN；k = 4）训练分类器，然后将分类器（按步骤 5.5 中命名）保存至步骤 5.4 指定的文件夹中。
  8. 在屏幕上查看分类器性能及交叉验证准确率的可视化结果。
  9. 可选：通过重复步骤 5.5–5.7，使用不同特征组合训练多个分类器，然后选择交叉验证准确率最高的分类器。
  10. 打开补充文件 3 - 测试 （为图像处理软件编写的程序）。
  11. 编辑第 14–15 行，指定待测试的已训练分类器。
  12. 编辑第 17 行，指定在步骤 5.1 中准备的测试集。
  13. 运行代码。上述分类器将识别测试集中各个淋巴细胞的细胞类型。
  14. 在屏幕上查看识别性能及测试准确率的可视化结果。

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结果

图 1 展示了整个实验方案的示意图。通过本方案，我们分离了B淋巴细胞（n = 149）、CD4+ T淋巴细胞（n = 95）和CD8+ T淋巴细胞（n = 112）。为了在不同照明角度下获取相位和振幅信息，通过改变照明角度（从-60°到60°），对每个淋巴细胞采集多个二维全息图。通常可使用50幅全息图重建一个三维折射率（RI）断层图像，但可根据成像速度和质量调整二维全息图的数量。利用基于傅里叶变换的场恢复算法，从测得的全息图中提取振幅和相位信息43,44。每个淋巴细胞的三维RI断层图像通过光学衍射层析算法，由多个不同照明角度下获取的二维相位和振幅信息重建而成。图像处理及三维RI断层图像重建方法的详细信息可参见其他文献21,45。

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讨论

我们提出了一种利用三维定量相位成像和机器学习实现无标记识别淋巴细胞类型的实验方案。该方案的关键步骤包括定量相位成像和特征选择。为了获得最佳的全息成像效果，应如上所述控制细胞密度。细胞的机械稳定性对于获取精确的三维折射率（RI）分布也至关重要，因为细胞漂浮或振动会随着照明角度的变化干扰全息图的测量。因此，我们在测量全息图前等待数分钟，直至样本在成像腔室内保持稳定且静止。最后，成像腔室内的气泡在测量全息图时会带来问题，这是由于空气与样本之间的折射率差异所致；因此，应小心地将样本加载至成像腔室中。

特征提取与选择有助于确定分类器的识别性能。我们从20个不同折射率（RI）阈值下的三维RI分布中计算了5种定量的形态学（CV、SA、SI）和生化特征（PD、DM）；因此，共提取了100个特征。我们对最优特征与分类器组合进行了 exhaustive 搜索，并选出了交叉验证准确率最高的组合。我们测试了6种不同的机器学习算法，包括k-近邻法（k = 4 和 k = 6）、线性判别分析、二次判别分析、朴素贝叶斯和决策树，结果表明k-...

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披露

Y. Park 教授、Y. Jo、Y. S. Kim 和 S. Lee 在 Tomocube 公司拥有财务利益，该公司致力于光学衍射层析和定量相位成像仪器的商业化，也是本研究的资助方之一。

致谢

本工作由韩国科学技术院（KAIST）BK21+项目、Tomocube公司以及韩国国家研究基金会（2015R1A3A2066550、2017M3C1A3013923、2018K000396）提供资助。Y. Jo 感谢韩国科学技术院总统奖学金和峨山基金会生物医学科学奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠Daehan BiolinkC57BL/6J 小鼠 性别和年龄匹配，6 – 8 周龄
Falcon 锥形离心管ThermoFisher Scientific14-959-53A15 mL
磷酸盐缓冲液 Sigma-Aldrich806544-500ML
氯化铵-氯化钾裂解缓冲液 ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR8758
胎牛血清ThermoFisher Scientific10438018
抗体BD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32（克隆 2.4G2）
抗体BD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3ε（克隆 17A2）
抗体Biolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8α（克隆 53-6.7）
抗体BD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19（克隆 1D3）
抗体BD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220（克隆 RA3-6B2）
抗体BD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1（克隆 PK136）
抗体eBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4（克隆 GK1.5）
DAPI Roche102362760014,6-二脒基-2-苯基吲哚
流式细胞术 BD BiosciencesAria II 或 III 
成像培养皿Tomocube, Inc.TomoDish
全息层析成像Tomocube, Inc.HT-1H
全息层析成像软件Tomocube, Inc.TomoStudio
图像处理软件MathWorksMatlab R2017b

参考文献

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三维折射率淋巴细胞分离特征提取K-最近邻单细胞分析细胞分类
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