我们描述了一种利用定量相位成像和机器学习算法进行无标记淋巴细胞亚型鉴定的实验方案。通过对淋巴细胞的三维折射率断层图像进行测量，可获得单个细胞的三维形态学和生物化学信息，随后利用机器学习算法分析这些信息以实现细胞类型的鉴定。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种利用定量相位成像和机器学习技术对淋巴细胞亚型进行无标记识别的实验方案。淋巴细胞亚型的识别对于免疫学研究以及多种疾病的诊断与治疗具有重要意义。目前，对淋巴细胞类型进行分类的标准方法依赖于通过抗原-抗体反应标记特定膜蛋白。然而，这些标记技术存在改变细胞功能的潜在风险。本文所述方案通过利用三维定量相位成像所测得的内源性光学对比信息以及机器学习算法，克服了上述挑战。对淋巴细胞三维折射率（RI）断层图像的测量可提供关于单个细胞三维形态和表型的定量信息。从所测得的三维RI断层图像中提取的生物物理参数随后通过机器学习算法进行定量分析，从而实现对淋巴细胞类型的单细胞水平无标记识别。我们测量了B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的三维RI断层图像，并以超过80%的准确率实现了其细胞类型的识别。在本方案中，我们详细描述了淋巴细胞分离、三维定量相位成像以及用于识别淋巴细胞类型的机器学习分析的具体步骤。
引言
淋巴细胞可分为多种亚型，包括B细胞、辅助性（CD4+）T细胞、细胞毒性（CD8+）T细胞以及调节性T细胞。每种淋巴细胞在适应性免疫系统中具有不同的功能；例如，B淋巴细胞产生抗体，而T淋巴细胞则识别特定抗原、清除异常细胞并调节B淋巴细胞的活动。淋巴细胞的功能与调控与多种疾病密切相关，且受到严格调控，这些疾病包括癌症1、自身免疫性疾病2和病毒感染3。因此，识别不同类型的淋巴细胞对于理解其在上述疾病中的病理生理作用以及临床免疫治疗具有重要意义。
目前，淋巴细胞类型的分类方法主要依赖于通过靶向特定表面膜蛋白或表面标志物的抗原-抗体反应4。靶向表面标志物是一种确定淋巴细胞类型的精确且准确的方法。然而，该方法需要昂贵的试剂和耗时的操作步骤。此外，还存在膜蛋白结构被修饰以及细胞功能发生改变的风险。
为克服这些挑战，本文所述方案引入了一种基于三维定量相位成像（QPI）与机器学习的无标记淋巴细胞类型鉴定方法5。该方法能够利用从单个淋巴细胞的无标记三维成像中提取的形态学信息，在单细胞水平上实现淋巴细胞类型的分类。与传统的荧光显微镜技术不同，QPI利用折射率（RI）分布（活细胞和组织的固有光学特性）作为光学....
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方案
动物饲养和实验操作均在韩国科学技术院（KAIST）机构动物护理与使用委员会（批准号：KA2010-21、KA2014-01 和 KA2015-03）的批准下进行。本研究中的所有实验均依照批准的指南实施。
1. 小鼠血液中淋巴细胞的分离
- 通过 CO2 吸入法处死 C57BL/6J 小鼠后，将 26 号针头插入小鼠心脏，收集 0.3 mL 血液。立即将血液直接注入含有 100 U/mL 肝素溶液的离心管中，该溶液用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
注意：也可从脾脏中分离淋巴细胞。 - 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。
- 向离心管中加入 0.5 mL 氯化铵-氯化钾裂解缓冲液，并轻轻颠倒数次以混匀溶液。
- 在室温（RT）下孵育 5 分钟。
- 加入 4.5 mL PBS 洗涤细胞，然后在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，重复洗涤两次。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 含 10% 胎牛血清（FBS）的新鲜 RPMI-1640 培养基中。
- 向离心管中加入 0.1 µg CD16/32（2.4G2）抗体进行封闭。
- 将离心管置于冰上保存。
2. 淋巴细胞亚群的....
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结果
图 1 展示了整个实验方案的示意图。通过本方案，我们分离了B淋巴细胞（n = 149）、CD4+ T淋巴细胞（n = 95）和CD8+ T淋巴细胞（n = 112）。为了在不同照明角度下获取相位和振幅信息，通过改变照明角度（从-60°到60°），对每个淋巴细胞采集多个二维全息图。通常可使用50幅全息图重建一个三维折射率（RI）断层图像，但可根据成像速度和质量调整二维全息图的数量。利用基于傅里叶变换的场恢复算法，从测得的全息图中提取振幅和相位信息43,44。每个淋巴细胞的三维RI断层图像通过光学衍射层析算法，由多个不同照明角度下获取的二维相位和振幅信息重建而成。图像处理及三维RI断层图像重建方法的详细信息可参见其他文献21,45。
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讨论
我们提出了一种利用三维定量相位成像和机器学习实现无标记识别淋巴细胞类型的实验方案。该方案的关键步骤包括定量相位成像和特征选择。为了获得最佳的全息成像效果，应如上所述控制细胞密度。细胞的机械稳定性对于获取精确的三维折射率（RI）分布也至关重要，因为细胞漂浮或振动会随着照明角度的变化干扰全息图的测量。因此，我们在测量全息图前等待数分钟，直至样本在成像腔室内保持稳定且静止。最后，成像腔室内的气泡在测量全息图时会带来问题，这是由于空气与样本之间的折射率差异所致；因此，应小心地将样本加载至成像腔室中。
特征提取与选择有助于确定分类器的识别性能。我们从20个不同折射率（RI）阈值下的三维RI分布中计算了5种定量的形态学（CV、SA、SI）和生化特征（PD、DM）；因此，共提取了100个特征。我们对最优特征与分类器组合进行了 exhaustive 搜索，并选出了交叉验证准确率最高的组合。我们测试了6种不同的机器学习算法，包括k-近邻法（k = 4 和 k = 6）、线性判别分析、二次判别分析、朴素贝叶斯和决策树，结果表明k-.......
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披露
Y. Park 教授、Y. Jo、Y. S. Kim 和 S. Lee 在 Tomocube 公司拥有财务利益，该公司致力于光学衍射层析和定量相位成像仪器的商业化，也是本研究的资助方之一。
致谢
本工作由韩国科学技术院（KAIST）BK21+项目、Tomocube公司以及韩国国家研究基金会（2015R1A3A2066550、2017M3C1A3013923、2018K000396）提供资助。Y. Jo 感谢韩国科学技术院总统奖学金和峨山基金会生物医学科学奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 | Daehan Biolink | C57BL/6J 小鼠 | 性别和年龄匹配，6 – 8 周龄 |
| Falcon 锥形离心管 | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| 氯化铵-氯化钾裂解缓冲液 | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| 抗体 | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32（克隆 2.4G2） |
| 抗体 | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε（克隆 17A2） |
| 抗体 | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α（克隆 53-6.7） |
| 抗体 | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19（克隆 1D3） |
| 抗体 | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220（克隆 RA3-6B2） |
| 抗体 | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1（克隆 PK136） |
| 抗体 | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4（克隆 GK1.5） |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 |
| 流式细胞术 | BD Biosciences | Aria II 或 III | |
| 成像培养皿 | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| 全息层析成像 | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| 全息层析成像软件 | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| 图像处理软件 | MathWorks | Matlab R2017b |
参考文献
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503(2000).
- Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology<....
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重印与许可
