压力增强型恐惧学习：一种可靠的啮齿类动物创伤后应激障碍模型

摘要

本文详细描述了在大鼠和小鼠中开展应激增强恐惧学习（SEFL）实验所需的方法学，该模型是一种创伤后应激障碍的临床前模型。该模型结合了经典条件性恐惧训练的要素，并以啮齿类动物的僵直行为作为恐惧增强的指标。

摘要

恐惧行为对生存至关重要，但过度的恐惧水平会增加罹患创伤后应激障碍（PTSD）等精神疾病的风险。为了理解PTSD中恐惧调节异常的生物学机制，首先需要建立一种有效的动物模型。本实验方案描述了在大鼠和小鼠中开展应激增强恐惧学习（SEFL）实验所需的方法，SEFL是一种PTSD的临床前模型。SEFL旨在模拟PTSD的关键特征，包括由急性应激源引起的恐惧学习长期敏化。SEFL基于经典巴甫洛夫式恐惧条件反射的部分原理，但会产生一种独特且显著增强的恐惧反应，远强于正常的条件性恐惧反应。创伤处理过程包括将啮齿类动物置于条件化实验箱中，在90分钟内随机给予15次无提示性电击（大鼠实验）；在小鼠实验中，则在60分钟内随机给予10次无提示性电击。第2天，将动物置于一个新的条件化环境中，并给予一次电击；第3天，再次将动物放回第2天的同一环境中，检测其僵直水平的变化。与第1天未接受电击的动物相比，此前经历过创伤处理的动物在测试日表现出显著增强的僵直反应。因此，该模型表明，一次高度应激性的经历（创伤）可导致动物对与创伤事件相关刺激产生极度恐惧。

引言

恐惧是一种对生存至关重要的行为，使个体能够识别并应对威胁。然而，过度的恐惧反应可能导致创伤后应激障碍（PTSD）等精神疾病的发生。PTSD 的一个特征是对轻微应激源产生过度反应，尤其是那些与原始创伤相似的刺激，并倾向于形成新的恐惧^1,2。在实验室中，通常通过“僵立行为”来测量恐惧，这是一种在人类和啮齿类动物中均可靠且具有生态学效度的恐惧指标^3,4。尽管已知 PTSD 涉及恐惧调节功能失调以及恐惧表达增强，但目前仍缺乏能够稳定模拟个体对相对无害刺激产生增强恐惧反应的可靠动物模型。

本方案提供了在大鼠和小鼠中开展应激增强恐惧学习（SEFL）实验所需的详细方法学，SEFL是一种可靠且稳健的创伤后应激障碍（PTSD）临床前模型。SEFL借鉴了经典条件化恐惧训练的某些方面，但其产生的反应与正常的恐惧条件化明显不同，并重现了PTSD患者在经历创伤性应激后出现的恐惧增强现象^5,6。在此模型中，一次高度应激性的经历（本文称为创伤）可导致持久的行为改变，包括对与创伤事件相关刺激的极度恐惧、焦虑增加、惊跳反应增强以及糖皮质激素信号通路的改变^7,8。SEFL的主要特征是：动物在某一特定环境中暴露于创伤性应激源（一系列无信号提示的电击）后，在另一不同环境中对轻微应激源（例如，单次电击）表现出过度的恐惧反应。重要的是，SEFL效应并非源于从创伤环境向新环境的泛化，也不是由于对电击敏感性的普遍升高⁵。在我们的模型中，我们有意采用一系列措施以减少向新环境的泛化，例如使用不同的运输方式、气味以及栅格地板图案。因此，与正常的恐惧条件化不同，SEFL是一种非关联性过程，导致动物对并未直接与创伤经历相关的环境线索产生不成比例的新恐惧学习。大量研究表明，在大鼠中进行一次包含15次不可预测电击的90分钟应激处理（或在小鼠中进行一次包含10次不可预测电击的60分钟应激处理），可诱导出持久的恐惧条件化敏感化，同时伴随焦虑增加以及基础皮质酮昼夜节律的失调。相比之下，预先暴露于单次足底电击并不会引发SEFL效应⁹。此外，SEFL在大鼠和小鼠中均可稳定可靠地应用。

因此，PTSD的SEFL模型是研究PTSD病理生理过程中所涉及生物学机制的有力工具。利用SEFL模型，研究人员可以探究创伤暴露对未来恐惧学习的影响。此外，该模型还可用于研究可能参与调控PTSD中所观察到的恐惧表达增强的特定细胞和分子机制。

方案

1. 受试者

1. 大鼠
   1. 订购约90日龄的大鼠，到达后单只饲养于标准大鼠笼中。
      注意：建议单只饲养，因为群养会导致动物在居住笼中相互作用，尤其在应激暴露后产生变异性。SEFL已在雄性和雌性大鼠中、Long-Evans和Sprague Dawley大鼠中，以及低至19日龄的大鼠中得到证实^7,10。
   2. 将动物随机分配至至少两个条件组：创伤组（n = 8）和无创伤组（n = 8）（参见Rau et al.⁵ 了解其他对照条件）。
2. 小鼠
   1. 订购约60日龄的小鼠，到达后单只饲养于标准小鼠笼中。在创伤前以及整个实验期间，均需单只饲养至少4周。
   2. 将动物随机分配至至少两个条件组：创伤组（n = 8）和无创伤组（n = 8）。

2. 仪器设置

1. 设置一组恐惧条件化实验舱作为情境A，另一组恐惧条件化实验舱作为情境B（参见 材料表）。将每个恐惧条件化实验箱置于隔音箱内，以防止外界噪音干扰（参见 材料表).
   1. 确保用于作为情境A的实验舱内配备有可见光照明装置（例如白色顶灯） 材料表).
   2. 确保在每只动物实验之间有不同溶液用于清洁实验舱，并为每个实验舱提供不同气味（例如，稀释的清洗液和1%乙酸）。
      注意：必须消除动物产生的气味¹¹.
   3. 将塑料插入物放入情境B中，以区分两种情境的内部布局。建议使用黑色亚克力三角形插入物。或者，可使用白色塑料片制作成弧形后壁（参见 材料表).
   4. 在每个恐惧条件化实验箱中放置网格地板以传递足底电击，每个环境使用不同的网格图案，以区分不同环境间的地板质地（参见 材料表).
      注：具有足够区别的网格图案包括平板网格（所有栅条排列在同一水平面内）、交错网格（栅条排列在两个偏移的水平面内）和交替网格（栅条排列在同一水平面内但直径不同）。
   5. 在每个网格地板下方放置干净的金属托盘以收集排泄物。用清洁液对托盘进行气味处理（参见 材料表).
2. 为每种情境提供足底电击递送的准确时间和强度。
   1. 连接可提供1 mA或更低强度电击的刺激发生器和随机化装置，分别接入每个网格地板，用于足底电击（参见 材料表).
      注意：刺激发生器和随机化装置应置于隔音室内，通过隔音室上的开口用电缆将发生器和随机化装置连接至栅格地板。这样可防止因动物啃咬或清洁液造成的损坏。 等等.
   2. 使用万用表通过将每个探针接触网格地板的不同金属条来检测电击发生器输出的电流，并确认产生所需的电击强度（参见 材料表).
   3. 确保采用一种能够控制电击输送时序和幅度的方法（例如， 计算机软件）可获取（参见 材料表).
3. 确保在每次实验过程中均有视频录制每只动物行为的方法（参见 材料表).
   注意：必须记录两种情况：1）当腔室被可见光照射时；2）当腔室处于黑暗中时。后者可通过使用夜视摄像机，或利用红外光或近红外光照射并记录黑暗中的腔室来实现。
4. 确保有一种独特的动物运输方法，能将动物从动物房运送到情境B，以进一步区分这两种情境。
   注意：虽然已成功使用过将黑色塑料箱（38 × 30 × 24 cm）分隔为四个区域或使用清洁的空笼具等方法，但也可使用任何在外观上明显区别于饲养笼的运输箱。

3. 大鼠和小鼠的SEFL操作步骤

1. 在开始SEFL实验程序前至少7天，每天用手轻轻将啮齿类动物从饲养笼中取出，并每只握住60-90秒，以进行日常抓握处理。
2. 在SEFL程序的第1天，将实验对象放入情境A中，使其接受创伤性应激刺激。
   1. 使用一组特定的栅格地板（例如，平面栅格），并用可见光照明实验舱。
   2. 使用万用表检测电击发生器输出的电流：将两个探针分别接触栅格地板的不同金属条，确认产生预期的电击强度。
      注意：金属条的损坏或腐蚀可能导致电击强度减弱或不均匀。尿液等液体接触沿墙壁的栅格也可能对电击传递产生不利影响。
   3. 用一种清洁溶液（例如，稀释的清洁剂）擦拭实验舱的墙壁和门，并向栅格地板下方的接液盘喷洒该溶液。
      注意：此步骤旨在消除前一只动物留下的气味。
   4. 将动物连同其饲养笼一起放在推车上，从动物房运送至实验房间，并逐一放入恐惧条件化实验舱中。每次仅将一轮实验所需的动物（由恐惧条件化实验舱数量决定）带入实验房间。
      注意：为避免因顺序或时间因素造成干扰，每一轮应包含处于创伤和非创伤条件下的动物。
   5. 对于大鼠实验，使用电击发生器和电流分配器，通过含有创伤条件动物的实验舱栅格条，在90分钟内随机给予15次、每次1秒、1 mA的足底电击（平均ISI = 6 min）。非创伤对照组动物在相同情境中暴露90分钟，但不给予电击。
   6. 对于小鼠实验，使用电击发生器和电流分配器，通过含有创伤条件动物的实验舱栅格地板，在60分钟内随机给予10次、每次1秒、1 mA的足底电击（平均ISI = 6 min）。非创伤对照组动物在相同情境中暴露60分钟，但不给予电击。
   7. 在90分钟（大鼠实验）或60分钟（小鼠实验）后，将所有动物放回其饲养笼，并立即送回动物房。
3. 在SEFL程序的第2天，如需评估动物对创伤情境的恐惧反应，请执行以下步骤：
   1. 按照第1天的方式设置情境A。
   2. 如同第1天，将动物连同其饲养笼一起运送至实验房间。
   3. 将动物放入情境A中，持续8分钟，期间不给予电击，并全程录像记录其行为。
   4. 8分钟后，将所有动物放回饲养笼，并立即送回动物房。
4. 在SEFL程序的第3天，将所有实验对象暴露于情境B中的轻度应激刺激。
   注意：该步骤可在创伤性应激刺激后24小时至90天内的任意时间进行⁹。
   1. 使用与情境A不同的栅格地板（例如，交错或错列式栅格地板），并插入黑色三角形或白色弧形Plexiglas隔板。不要使用可见光照明实验舱；但可根据需要使用红外或近红外光。
   2. 使用万用表检测电击发生器输出的电流：将两个探针分别接触栅格地板的不同金属条，确认产生预期的电击强度。使用万用表检测电击发生器输出的电流：将两个探针分别接触栅格地板的不同金属条，确认产生预期的电击强度。
      注意：金属条的损坏或腐蚀可能导致电击强度减弱或不均匀。尿液等液体接触沿墙壁的栅格也可能对电击传递产生不利影响。
   3. 使用在情境A中未使用的另一种溶液（例如，1%乙酸）擦拭实验舱，并向栅格地板下方的接液盘喷洒该溶液。
   4. 采用与情境A不同的运输方式（例如，黑色塑料箱）将动物从动物房运送至实验房间，并逐一放入恐惧条件化实验舱中。每次仅将一轮实验所需的动物（由恐惧条件化实验舱数量决定）带入实验房间。
   5. 使所有动物暴露于轻度应激刺激（如下所述），并在实验期间录像记录其僵直（freezing）和活动情况。
      1. 在180秒的基础期后，对所有动物施加一次足底电击：大鼠为1秒、1 mA，小鼠为2秒、1 mA。
         注意：确保在180秒基础期内，动物的僵直行为不超过5%¹²。
      2. 电击后30秒，将所有动物移出实验舱，并立即送回动物房。
5. 在SEFL程序的第4天，测试动物对轻度应激情境的恐惧反应。
   1. 按照第3天的方式设置情境B。
   2. 使用与第3天相同的运输方式，将动物从动物房运送至实验房间。
   3. 将动物放入情境B中，持续8分钟，期间不给予电击，并全程录像记录其僵直行为。
   4. 8分钟后，将所有动物移出实验舱，并立即送回动物房。

4. 数据分析

1. 在记录的实验过程中，使用“僵直”来测量恐惧，僵直定义为除呼吸所必需的运动外，身体完全无运动。
   注意：僵直行为由不知晓实验条件的人类评分者进行评分最为准确，但也有多种自动化程序表现良好。然而，所有自动化系统都必须以人工观察结果为基准进行校准，才能确保准确性¹³。
   1. 手动评分僵直时，由不了解实验条件的实验人员在感兴趣的时间段内每4秒观察一次受试动物³。每次观察时，将动物状态分类为“僵直”或“非僵直”。通过比较僵直状态的观察次数与总观察次数，计算出僵直所占时间的百分比。
   2. 若使用自动化视频分析系统进行僵直评分，应首先验证自动化分析结果与手动评分结果的一致性，因为自动化分析若得出明显不同的僵直评分，可能导致结果不准确。
      注意：从未接受过电击的大鼠或小鼠，其僵直时间百分比应在0%至5%之间，若数值更高，则提示设备校准不佳。
2. 使用上述方法测量在感兴趣时间段内的恐惧反应（如下所述）。
   1. 将第2天整个8分钟测试阶段中动物处于僵直状态的时间百分比，作为其对创伤环境的恐惧程度指标。
   2. 将第3天在Context B中给予电击前3分钟基线期内的僵直时间百分比，作为恐惧从创伤环境向轻度应激环境泛化的指标。
      注意：对于SEFL实验，必须充分区分不同环境，以避免出现显著的恐惧泛化。
   3. 将第3天电击后紧接着的30秒时间段内的僵直时间百分比，作为电击后即刻恐惧反应的测量指标。
   4. 将第4天整个8分钟测试阶段中动物处于僵直状态的时间百分比，作为其对轻度应激环境的恐惧程度指标。
3. 通过第3天电击期间及电击后立即发生的3秒时间段内的运动幅度或速度，来测量对电击的反应性。
   注意：所有数据分析均建议采用方差分析（ANOVA），以便根据需要添加额外组别（e.g.，药物处理组）。

结果

第2天创伤情境测试的结果如图1所示。创伤组动物在情境A中的僵直水平显著高于无创伤对照组，表明动物已习得对创伤情境的恐惧反应［大鼠：F(1,17) = 23.58，p < 0.01；小鼠：F(1,14) = 666.50，p < 0.0001］。第3天在新情境中施加单次电击前基线期的僵直情况如图2所示。创伤组与无创伤组动物的僵直水平均极低，且组间无显著差异［大鼠：F(1,17) = 3.14，p > 0.05；小鼠：F(1,14) = 1.70，p > 0.05］。这表明情境A与情境B具有足够区分度，创伤组动物未将恐惧反应泛化至新情境。第3天对单次电击的反应性如图3所示。创伤组动物的电击反应性低于无创伤对照组［大鼠：F(1,17) = 3.59，p = 0.07；小鼠：F

讨论

SEFL 是一种稳定的 PTSD 行为模型，可在大鼠和小鼠中重现，用于研究 PTSD 特征性的敏化恐惧反应。在经历创伤性应激后，啮齿类动物仅当一个明显不同的环境与一种轻度应激源配对（作为先前创伤经历的提示）时，才会在该环境中表现出增强的恐惧反应。在创伤性应激之后，当动物于第 2 天返回创伤性应激环境时，表现出高水平的恐惧反应，这表明对创伤性应激的记忆保持完整（图 1）。然而，它们从创伤性应激环境向新环境的恐惧泛化程度极低，这体现在第 3 天 3 分钟基线期的僵直反应极少（图 2）。这表明，对该新环境的任何学习增强并非简单地源于创伤环境的泛化。此外，暴露于创伤性应激源的动物在第 3 天对单次电击的反应性并未增强（图 3），表明学习增强并非由于先前的电击暴露使单次电击被感知为更疼痛所致。关键的是，暴露于创伤性应激源的动物在第 3 天单次电击后立即表现出显著增加的僵直反应（图 4），并在第 4 天返回单次电...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
适用于低矮地板的恐惧条件反射实验箱	Med Associates Inc.	VFC-008-LP	恐惧条件反射实验箱
隔音减噪舱	Med Associates Inc.	NIR-022SD	隔音隔间，用于防止外界噪音侵入
近红外/白光控制箱	Med Associates Inc.	NIR-100VR	可提供白光和近红外光的光控箱
近红外VFC光盒	Med Associates 公司	NIR-100L2	白色顶置环境灯
Windex 原始玻璃清洁剂	Windex		用于在动物之间清洁和去除恐惧条件反射实验箱气味的溶液
乙酸	Fisher Scientific	A38-212	用于在动物之间清洁和去除恐惧条件反射箱气味的溶液
A型框架培养室插件	Med Associates 公司	ENV-008-IRT	用于区分环境A和B内部布局的黑色亚克力三角形插件
弯曲壁插件	Med Associates 公司	VFC-008-CWI	用于区分情境A和B内部布局的白色塑料板
低剖面情境网格地板，配有1/8" 小鼠用网格杆	Med Associates Inc.	VFC-005A	小鼠用平板网格地板
低剖面交替式1/8情境网格地板" &和 3/16" 小鼠网格杆实验	Med Associates 公司	VFC-005-S	小鼠交错网格地板
低剖面情境化网格地板，配有1/8" 用于小鼠的交错网格杆	Med Associates 公司	VFC-005A-L	小鼠用交替网格地板
低剖面情境化网格地板，配有 3/16" 大鼠用网格杆	Med Associates 公司	VFC-005	大鼠用平板网格地板
低剖面情境化网格地板，采用交替式 3/16 设计" &和 3/8" 网格棒	Med Associates 公司	VFC-005-L	大鼠用交替网格地板
低剖面情境化网格地板，配有 3/16" 用于大鼠的交错网格杆	Med Associates Inc.	VFC-005-S	用于大鼠的交错网格地板
金属盘	Med Associates Inc.		用于接住网格地板下方排泄物的金属托盘
独立式厌恶刺激器/随机刺激器	Med Associates 公司	ENV-414S	用于足底电击递送的刺激发生器和随机化装置
万用表	扁虫	87-5	测量足底电击强度的工具
VideoFreeze 软件	Med Associates 公司	SOF-843	用于控制电击递送的 VideoFreeze 软件
高速Firewire黑白视频摄像机	Med Associates Inc.	VID-CAM-MONO-4	能够记录近红外光的摄像机