本文详细描述了在大鼠和小鼠中开展应激增强恐惧学习（SEFL）实验所需的方法学，该模型是一种创伤后应激障碍的临床前模型。该模型结合了经典条件性恐惧训练的要素，并以啮齿类动物的僵直行为作为恐惧增强的指标。
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摘要
摘要
恐惧行为对生存至关重要，但过度的恐惧水平会增加罹患创伤后应激障碍（PTSD）等精神疾病的风险。为了理解PTSD中恐惧调节异常的生物学机制，首先需要建立一种有效的动物模型。本实验方案描述了在大鼠和小鼠中开展应激增强恐惧学习（SEFL）实验所需的方法，SEFL是一种PTSD的临床前模型。SEFL旨在模拟PTSD的关键特征，包括由急性应激源引起的恐惧学习长期敏化。SEFL基于经典巴甫洛夫式恐惧条件反射的部分原理，但会产生一种独特且显著增强的恐惧反应，远强于正常的条件性恐惧反应。创伤处理过程包括将啮齿类动物置于条件化实验箱中，在90分钟内随机给予15次无提示性电击（大鼠实验）；在小鼠实验中，则在60分钟内随机给予10次无提示性电击。第2天，将动物置于一个新的条件化环境中，并给予一次电击；第3天，再次将动物放回第2天的同一环境中，检测其僵直水平的变化。与第1天未接受电击的动物相比，此前经历过创伤处理的动物在测试日表现出显著增强的僵直反应。因此，该模型表明，一次高度应激性的经历（创伤）可导致动物对与创伤事件相关刺激产生极度恐惧。
引言
恐惧是一种对生存至关重要的行为，使个体能够识别并应对威胁。然而，过度的恐惧反应可能导致创伤后应激障碍（PTSD）等精神疾病的发生。PTSD 的一个特征是对轻微应激源产生过度反应，尤其是那些与原始创伤相似的刺激，并倾向于形成新的恐惧1,2。在实验室中，通常通过“僵立行为”来测量恐惧，这是一种在人类和啮齿类动物中均可靠且具有生态学效度的恐惧指标3,4。尽管已知 PTSD 涉及恐惧调节功能失调以及恐惧表达增强，但目前仍缺乏能够稳定模拟个体对相对无害刺激产生增强恐惧反应的可靠动物模型。
本方案提供了在大鼠和小鼠中开展应激增强恐惧学习（SEFL）实验所需的详细方法学，SEFL是一种可靠且稳健的创伤后应激障碍（PTSD）临床前模型。SEFL借鉴了经典条件化恐惧训练的某些方面，但其产生的反应与正常的恐惧条件化明显不同，并重现了PTSD患者在经历创伤性应激后出现的恐惧增强现象5,6。在此模型中，一次高度应激性的经历（本文称为创伤）可导致持久的行为改变，包括对与创伤事件相关刺激的极度恐惧、焦虑增加、惊跳反应增强以及糖皮质激素信号通路的改变
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方案
1. 受试者
- 大鼠
- 订购约90日龄的大鼠，到达后单只饲养于标准大鼠笼中。
注意：建议单只饲养，因为群养会导致动物在居住笼中相互作用，尤其在应激暴露后产生变异性。SEFL已在雄性和雌性大鼠中、Long-Evans和Sprague Dawley大鼠中，以及低至19日龄的大鼠中得到证实7,10。 - 将动物随机分配至至少两个条件组：创伤组（n = 8）和无创伤组（n = 8）（参见Rau et al.5 了解其他对照条件）。
- 订购约90日龄的大鼠，到达后单只饲养于标准大鼠笼中。
- 小鼠
- 订购约60日龄的小鼠，到达后单只饲养于标准小鼠笼中。在创伤前以及整个实验期间，均需单只饲养至少4周。
- 将动物随机分配至至少两个条件组：创伤组（n = 8）和无创伤组（n = 8）。
2. 仪器设置
- 设置一组恐惧条件化实验舱作为情境A，另一组恐惧条件化实验舱作为情境B（参见 材料表）。将每个恐惧条件化实验箱置于隔音箱内，以防止外界噪音干扰（参见 材料表).
-
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结果
第2天创伤情境测试的结果如图1所示。与无创伤对照组动物相比，创伤组动物在情境A中表现出显著更高的僵直水平，表明其对创伤情境产生了恐惧记忆 [大鼠：F(1,17) = 23.58，p < 0.01；小鼠：F(1,14) = 666.50，p < 0.0001]。第3天在新情境中施加单次电击前基线期的僵直情况如图2所示。创伤组与无创伤组动物均表现出极低的僵直水平，且两组间无显著差异 [大鼠：F(1,17) = 3.14，p > 0.05；小鼠：F(1,14) = 1.70，p > 0.05]。这表明情境A与情境B具有足够区分度，创伤组动物未将恐惧泛化至新情境。第3天对单次电击的反应性如图3所示。创伤组动物对电击的反应性低于无创伤对照组 [大鼠：F(1,17) = 3.59，p = 0.0.......
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讨论
SEFL 是一种稳定的 PTSD 行为模型，可在大鼠和小鼠中重现，用于研究 PTSD 特征性的敏化恐惧反应。在经历创伤性应激后，啮齿类动物仅当一个明显不同的环境与一种轻度应激源配对（作为先前创伤经历的提示）时，才会在该环境中表现出增强的恐惧反应。在创伤性应激之后，当动物于第 2 天返回创伤性应激环境时，表现出高水平的恐惧反应，这表明对创伤性应激的记忆保持完整（图 1）。然而，它们从创伤性应激环境向新环境的恐惧泛化程度极低，这体现在第 3 天 3 分钟基线期的僵直反应极少（图 2）。这表明，对该新环境的任何学习增强并非简单地源于创伤环境的泛化。此外，暴露于创伤性应激源的动物在第 3 天对单次电击的反应性并未增强（图 3），表明学习增强并非由于先前的电击暴露使单次电击被感知为更疼痛所致。关键的是，暴露于创伤性应激源的动物在第 3 天单次电击后立即表现出显著增加的僵直反应（图 4），并在第 4 天返回单次电.......
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披露
Fanselow 博士是 Neurovation Labs 的创始董事会成员。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院R01AA026530（MSF）、斯塔格林脑与行为健康中心（MSF）、NRSA-F32 MH10721201A1和NARSAD 26612（AKR）以及美国国家科学基金会DGE-1650604（SG）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 适用于低矮地板的恐惧条件反射实验箱 | Med Associates Inc. | VFC-008-LP | 恐惧条件反射实验箱 |
| 隔音减噪舱 | Med Associates Inc. | NIR-022SD | 隔音隔间，用于防止外界噪音侵入 |
| 近红外/白光控制箱 | Med Associates Inc. | NIR-100VR | 可提供白光和近红外光的光控箱 |
| 近红外VFC光盒 | Med Associates 公司 | NIR-100L2 | 白色顶置环境灯 |
| Windex 原始玻璃清洁剂 | Windex | 用于在动物之间清洁和去除恐惧条件反射实验箱气味的溶液 | |
| 乙酸 | Fisher Scientific | A38-212 | 用于在动物之间清洁和去除恐惧条件反射箱气味的溶液 |
| A型框架培养室插件 | Med Associates 公司 | ENV-008-IRT | 用于区分环境A和B内部布局的黑色亚克力三角形插件 |
| 弯曲壁插件 | Med Associates 公司 | VFC-008-CWI | 用于区分情境A和B内部布局的白色塑料板 |
| 低剖面情境网格地板，配有1/8" 小鼠用网格杆 | Med Associates Inc. | VFC-005A | 小鼠用平板网格地板 |
| 低剖面交替式1/8情境网格地板" &和 3/16" 小鼠网格杆实验 | Med Associates 公司 | VFC-005-S | 小鼠交错网格地板 |
| 低剖面情境化网格地板，配有1/8" 用于小鼠的交错网格杆 | Med Associates 公司 | VFC-005A-L | 小鼠用交替网格地板 |
| 低剖面情境化网格地板，配有 3/16" 大鼠用网格杆 | Med Associates 公司 | VFC-005 | 大鼠用平板网格地板 |
| 低剖面情境化网格地板，采用交替式 3/16 设计" &和 3/8" 网格棒 | Med Associates 公司 | VFC-005-L | 大鼠用交替网格地板 |
| 低剖面情境化网格地板，配有 3/16" 用于大鼠的交错网格杆 | Med Associates Inc. | VFC-005-S | 用于大鼠的交错网格地板 |
| 金属盘 | Med Associates Inc. | 用于接住网格地板下方排泄物的金属托盘 | |
| 独立式厌恶刺激器/随机刺激器 | Med Associates 公司 | ENV-414S | 用于足底电击递送的刺激发生器和随机化装置 |
| 万用表 | 扁虫 | 87-5 | 测量足底电击强度的工具 |
| VideoFreeze 软件 | Med Associates 公司 | SOF-843 | 用于控制电击递送的 VideoFreeze 软件 |
| 高速Firewire黑白视频摄像机 | Med Associates Inc. | VID-CAM-MONO-4 | 能够记录近红外光的摄像机 |
参考文献
- Bremner, J. D., Krystal, J. H., Southwick, S. M., Charney, D. S. Functional neuroanatomical correlates of the effects of stress on memory. Journal of Traumatic Stress. 8 (4), 527-553 (1995).
- Dykman, R. A., Ackerman, P. T., Newton, J. E. ....
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重印与许可
